中華絨螯蟹微孢子蟲(chóng)全基因組分泌蛋白的預(yù)測(cè)分析

寧梓健，寇詩(shī)瑀，包 杰，姜宏波

( 沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué) 畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110866 )

中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)俗稱河蟹，是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)甲殼動(dòng)物之一，廣泛養(yǎng)殖于稻田、池塘、湖泊等水體中[1]。近年來(lái)，隨著養(yǎng)殖產(chǎn)量的不斷提高，很多中華絨螯蟹養(yǎng)殖地區(qū)相繼出現(xiàn)了高死亡率的“肝胰腺壞死癥”[2]，部分個(gè)體組織學(xué)研究顯示，肝胰臟上皮細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)內(nèi)感染了微孢子蟲(chóng)(Hepatosporaeriocheir)[3]。中華絨螯蟹感染微孢子蟲(chóng)后，肝胰腺由健康的金黃色漸漸轉(zhuǎn)變成灰白色，活動(dòng)能力減弱，難以抵抗較大應(yīng)激[4]。2002年，Wang等[5]通過(guò)電鏡觀察到中華絨螯蟹微孢子蟲(chóng)的蟲(chóng)體，開(kāi)始對(duì)其形態(tài)結(jié)構(gòu)、病理特征及流行病學(xué)進(jìn)行研究。中華絨螯蟹微孢子蟲(chóng)是一種營(yíng)專性細(xì)胞內(nèi)寄生生活的單細(xì)胞真核生物，個(gè)體極小，呈卵圓形，長(zhǎng)徑(1.7±0.2) μm，短徑(1.0±0.2) μm，有1個(gè)細(xì)胞核，占據(jù)蟲(chóng)體的中心位置，位于極膜層和后液泡之間，周圍有2層或3層內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和7～8圈極管[6-7]。由于微孢子蟲(chóng)是一種引起中華絨螯蟹肝胰腺壞死的新型水產(chǎn)病原，寄主感染該微孢子蟲(chóng)后抗病能力變?nèi)?、生長(zhǎng)發(fā)育緩慢，給中華絨螯蟹養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)帶來(lái)很大損失，因此深入研究此微孢子蟲(chóng)在中華絨螯蟹細(xì)胞內(nèi)的侵染機(jī)制對(duì)于該病的防治具有重要意義。

在病原微生物侵染宿主的過(guò)程中，病原微生物會(huì)產(chǎn)生許多激發(fā)入侵和致病的信號(hào)分子，這些信號(hào)分子可能與宿主細(xì)胞表面受體蛋白產(chǎn)生識(shí)別作用。研究表明，病原微生物將信號(hào)分子分泌到體外，才可與宿主受體蛋白識(shí)別，產(chǎn)生作用[8]。如在植物中，有研究表明，馬鈴薯晚疫病菌(Phytophthorainfestans)Inf1[9]和豌豆銹病病菌(Uromycesvignae)小種1號(hào)產(chǎn)生的特異性信號(hào)分子為分泌蛋白[10]。在動(dòng)物中，已報(bào)道家蠶微孢子蟲(chóng)的重要分泌蛋白——孢壁蛋白和絲氨酸蛋白酶抑制劑是微孢子蟲(chóng)入侵宿主細(xì)胞的關(guān)鍵蛋白[11]，但關(guān)于中華絨螯蟹微孢子蟲(chóng)的分泌蛋白研究尚未見(jiàn)報(bào)道。筆者從全基因組水平預(yù)測(cè)和篩選中華絨螯蟹微孢子蟲(chóng)的分泌蛋白，分析可能與宿主受體蛋白起作用的信號(hào)分子，以期為探究中華絨螯蟹微孢子蟲(chóng)侵染機(jī)制奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為中華絨螯蟹養(yǎng)殖過(guò)程中微孢子蟲(chóng)的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 基因組數(shù)據(jù)來(lái)源

中華絨螯蟹微孢子蟲(chóng)基因組數(shù)據(jù)從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov)下載獲得，其登錄號(hào)為L(zhǎng)VKB00000000.1。

1.2 分泌蛋白的預(yù)測(cè)

針對(duì)中華絨螯蟹微孢子蟲(chóng)全基因組的蛋白質(zhì)編碼序列，運(yùn)行EuSecPred 2.0在線流程(http:∥microbe.Swu.Edu.cn/silkpathdb/eusecpred)篩選分泌蛋白，方法步驟參照文獻(xiàn)[11-12]：利用TMHMM程序過(guò)濾掉跨膜蛋白[13]；NLStradamus.Pl程序[14]和PredictNLS程序(https:∥rostlab.org/owiki/index.php/PredictNLS)篩去細(xì)胞核蛋白；SignalP 4.0程序?qū)Φ鞍仔蛄羞M(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)，篩去其中N端無(wú)信號(hào)肽的蛋白質(zhì)[11-12]；MitoProt程序預(yù)測(cè)線粒體蛋白[15]；TargetP程序?qū)Ψ蔷€粒體蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，篩選定位于胞外的分泌型蛋白[16]；Kohgpi程序去除可能具有GPI錨定修飾的蛋白質(zhì)[17]，得到中華絨螯蟹微孢子蟲(chóng)的分泌蛋白集合。

1.3 分泌蛋白序列特征的分析

根據(jù)分泌蛋白的信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果，統(tǒng)計(jì)信號(hào)肽以及完整分泌蛋白序列的長(zhǎng)度及氨基酸組成，提取信號(hào)肽剪切位點(diǎn)前后各3個(gè)氨基酸殘基，通過(guò)WebLogo程序(http:∥weblogo.threeplusone.com/)統(tǒng)計(jì)分析其氨基酸組成[18]，利用MEME程序(http:∥meme.nbcr.net/meme/)預(yù)測(cè)分泌蛋白信號(hào)肽區(qū)和非信號(hào)肽區(qū)中可能存在的基序[19]。

1.4 分泌蛋白功能的分析

利用BLASTP程序，將預(yù)測(cè)獲得的中華絨螯蟹微孢子蟲(chóng)分泌蛋白序列在Nr(ftp:∥ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/db/FASTA/nr.gz)和Swiss-Prot(ftp:∥ftp.uniprot.org/pub/databases/uniprot/current-release/knowledgebase/complete/uniprot-sprot.fasta.gz)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，將比對(duì)結(jié)果中得分最高的同源序列的功能作為對(duì)應(yīng)分泌蛋白的參考功能，并對(duì)功能進(jìn)行分類。

2 結(jié) 果

2.1 預(yù)測(cè)所得的中華絨螯蟹微孢子蟲(chóng)的分泌蛋白

運(yùn)行EuSecPred 2.0在線流程篩選分泌蛋白，對(duì)從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)下載得到的全部2700個(gè)中華絨螯蟹微孢子蟲(chóng)蛋白質(zhì)序列進(jìn)行預(yù)測(cè)，得到的結(jié)果為：484個(gè)蛋白質(zhì)具有跨膜域結(jié)構(gòu)；200個(gè)核蛋白；128個(gè)蛋白質(zhì)具有信號(hào)肽序列；18個(gè)定位于線粒體的蛋白質(zhì)；87個(gè)蛋白質(zhì)具有亞細(xì)胞定位信號(hào)；剔除了8個(gè)具有GPI錨定位點(diǎn)的蛋白質(zhì)以后，最終篩選得到了99個(gè)分泌蛋白。對(duì)這99個(gè)分泌蛋白所對(duì)應(yīng)的基因編號(hào)、基因長(zhǎng)度、基因GC含量及分泌蛋白的氨基酸序列長(zhǎng)度和信號(hào)肽序列長(zhǎng)度進(jìn)行了數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)整合，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 預(yù)測(cè)到的中華絨螯蟹分泌蛋白基因及序列分析Tab.1 Coding genes and sequence information on the predicted secreted protein gene in microsporidium parasited in Chinese mitten crab E. sinensis

2.2 分析預(yù)測(cè)所得的中華絨螯蟹微孢子蟲(chóng)分泌蛋白的序列特征

2.2.1 分泌蛋白與其信號(hào)肽的長(zhǎng)度與氨基酸組成

對(duì)預(yù)測(cè)所得的99個(gè)中華絨螯蟹微孢子蟲(chóng)的分泌蛋白及其信號(hào)肽的長(zhǎng)度進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和整理，得到蛋白質(zhì)序列長(zhǎng)度為30～700 aa，主要集中在30～300 aa，平均值為142.84 aa，中值為79.00 aa(圖1)；信號(hào)肽序列長(zhǎng)度為11～28 aa，主要分布在11～23 aa，長(zhǎng)度平均值為18.63 aa，中值為19.00 aa(圖2)。

圖1 中華絨螯蟹微孢子蟲(chóng)分泌蛋白序列長(zhǎng)度分析Fig.1 Analysis of the lengths of secretory protein sequence in microsporidium H. eriocheir parasited in Chinese mitten crab E. sinensis

圖2 中華絨螯蟹微孢子蟲(chóng)分泌蛋白信號(hào)肽長(zhǎng)度分析Fig.2 Analysis of the lengths of signal peptides of secretory protein in microsporidium H. eriocheir parasited in Chinese mitten crab E. sinensis

對(duì)預(yù)測(cè)所得的99個(gè)中華絨螯蟹微孢子蟲(chóng)的分泌蛋白及其信號(hào)肽的氨基酸組成進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和整理，結(jié)果顯示，在分泌蛋白的組成中，以疏水性氨基酸為主，占分泌蛋白中所有氨基酸的43.70%，其次為親水性氨基酸，占分泌蛋白中所有氨基酸的17.21%；在信號(hào)肽中，氨基酸的組成同樣主要為疏水性氨基酸，占信號(hào)肽中所有氨基酸的64.80%，其次為親水性氨基酸，占信號(hào)肽中所有氨基酸的18.34%(表2、圖3)。

圖3 中華絨螯蟹微孢子蟲(chóng)分泌蛋白及信號(hào)肽的氨基酸組成Fig.3 Amino acid composition of signal peptide and secretory protein in microsporidium H. eriocheir parasited in Chinese mitten crab E. sinensis每種氨基酸對(duì)應(yīng)柱體中，左側(cè)柱體為分泌蛋白中各氨基酸所占的比例，右側(cè)柱體為分泌蛋白信號(hào)肽中各氨基酸所占的比例. 黑色.疏水性氨基酸；綠色.親水性氨基酸；紅色.酸性氨基酸；藍(lán)色.堿性氨基酸；紫色.中性氨基酸；下同.In the column corresponding to each amino acid, the left column is the proportion of each amino acid in the secretory protein, and the right column is the proportion of each amino acid in the signal peptide. Black.hydrophobic amino acid; green.hydrophilic amino acid; red.acidic amino acid; blue.basic amino acid; purple. neutral amino acid; et sequntia.

表2 各字母所代表氨基酸種類及英文對(duì)照Tab.2 Comparison table of amino acid types and their abbreviations represented by each letter

2.2.2 信號(hào)肽剪切位點(diǎn)的氨基酸組成

對(duì)各分泌蛋白信號(hào)肽的剪切位點(diǎn)的氨基酸組成進(jìn)行了數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和整理，發(fā)現(xiàn)其結(jié)果與信號(hào)肽的氨基酸組成十分相近。分泌蛋白信號(hào)肽剪切位點(diǎn)處疏水性氨基酸所占比例最高，為42.24%，其中最多的為亮氨酸(L)，占比為11.87%；其次為親水性氨基酸，占信號(hào)肽剪切位點(diǎn)中所有氨基酸的26.35%，其中最多的是絲氨酸(S)，占比為10.65%(圖4)。對(duì)信號(hào)肽剪切位點(diǎn)前后氨基酸組成進(jìn)行分析，剪切位點(diǎn)上游的-3位主要為纈氨酸(V)，-2位主要為亮氨酸，剪切位點(diǎn)兩側(cè)的-1位和1位所占比例最高的分別為丙氨酸(A)和谷氨酸(E)，下游的2位主要為天冬氨酸(D)，3位主要為異亮氨酸(I)。綜合來(lái)看，疏水性氨基酸的比例較大(圖5)。

圖5 中華絨螯蟹微孢子蟲(chóng)分泌蛋白信號(hào)肽剪切位點(diǎn)處氨基酸的組成Fig.5 The composition of amino acids flanking the signal peptide splice site in the secreted proteins in microsporidium H. eriocheir parasited in Chinese mitten crab E. sinensis

2.2.3 分泌蛋白和其信號(hào)肽的基序

對(duì)中華絨螯蟹微孢子蟲(chóng)分泌蛋白信號(hào)肽區(qū)域進(jìn)行基序分析，發(fā)現(xiàn)了一種基序?yàn)镾[NS]N[TI][FI]V[IV][IGD][RG]VRC(圖6)。

圖6 中華絨螯蟹微孢子蟲(chóng)分泌蛋白信號(hào)肽基序Fig.6 Motif in signal peptide of HERI secreted proteins in microsporidium H. eriocheir parasited in Chinese mitten crab E. sinensis

而在分泌蛋白非信號(hào)肽區(qū)域發(fā)現(xiàn)了3種基序，分別為：RIERP[SG]GEWGQVLTGNPVHKKLR LVKTNEDNVRIEPHYNMANPQM、VKGQLSK GLDMLAGSENLKNFMNIKTLCSWIKFVLQFQ QEQKEDVR和TALYTDADTRSICSINLSDPSIR EAMVY(圖7)。

圖7 中華絨螯蟹微孢子蟲(chóng)分泌蛋白非信號(hào)肽區(qū)基序Fig.7 Motif in non-signal peptide of secretory protein in microsporidium H. eriocheir parasited in Chinese mitten crab E. sinensis

2.3 預(yù)測(cè)分泌蛋白功能

對(duì)篩選預(yù)測(cè)所獲得的99個(gè)中華絨螯蟹微孢子蟲(chóng)分泌蛋白通過(guò)BLASTP程序，與Nr和Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)進(jìn)行功能注釋，其中有68個(gè)分泌蛋白未在數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)檢索到明確的功能，可能為中華絨螯蟹微孢子蟲(chóng)分泌的獨(dú)特蛋白質(zhì)，占全部預(yù)測(cè)所得分泌蛋白的68.69%。另外31個(gè)分泌蛋白在數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)檢索到了同源蛋白，其中酶類占比最大，共有19個(gè)，通常為一些具有能夠調(diào)控宿主細(xì)胞的增殖、代謝及免疫反應(yīng)能力的酶類，如ATP磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶調(diào)節(jié)亞基、1,4-葡聚糖分支酶、磷酸核糖焦磷酸合成酶Ⅰ和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，推測(cè)其能夠?yàn)橹腥A絨螯蟹微孢子蟲(chóng)侵入宿主細(xì)胞后的增殖發(fā)育提供幫助。另外，還預(yù)測(cè)到了1個(gè)糖蛋白、1個(gè)交換因子和10個(gè)具有其他功能的分泌蛋白(圖8)。其中，糖蛋白可能與中華絨螯蟹微孢子蟲(chóng)黏附并入侵宿主細(xì)胞有關(guān)，交換因子對(duì)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期產(chǎn)生了一定的影響。

圖8 中華絨螯蟹微孢子蟲(chóng)分泌蛋白的功能分類Fig.8 Functional classification of secretory protein in microsporidium H. eriocheir parasited in Chinese mitten crab E. sinensis

3 討 論

3.1 中華絨螯蟹微孢子蟲(chóng)序列特征

本試驗(yàn)中所使用的EuSecPred 2.0在線流程是十分嚴(yán)謹(jǐn)可靠的，但由于生物信息學(xué)方法對(duì)分泌蛋白在全基因組范圍進(jìn)行的檢測(cè)具有一定的局限性，一些特殊的分泌蛋白無(wú)法被該流程所預(yù)測(cè)出，如以非經(jīng)典途徑分泌的蛋白質(zhì)。

整理分析分泌蛋白、分泌蛋白的信號(hào)肽和信號(hào)肽剪切位點(diǎn)兩側(cè)各3個(gè)氨基酸的組成發(fā)現(xiàn)，含量最多的氨基酸種類為疏水性氨基酸，其中亮氨酸的含量最為突出。在家蠶微孢子蟲(chóng)、兔腦炎微孢子蟲(chóng)、中蜂微孢子蟲(chóng)和畢氏腸道微孢子蟲(chóng)的分泌蛋白比較分析中[11]，也得到了相同的結(jié)論，說(shuō)明疏水性氨基酸的含量高可能是分泌蛋白所具有的共同特性。

3.2 中華絨螯蟹微孢子蟲(chóng)分泌蛋白功能分析

對(duì)分泌蛋白進(jìn)行功能注釋中，比對(duì)得到一些表面糖蛋白，如血凝素酯酶，它是病毒的一種膜囊糖蛋白，有研究認(rèn)為它與病毒早期吸附有關(guān)[20-21]，另外有報(bào)道稱它類似于流感病毒分泌的神經(jīng)氨酸苷酶，可促進(jìn)新生病毒順利從感染細(xì)胞中退出[22]，推測(cè)該分泌蛋白可能在中華絨螯蟹微孢子蟲(chóng)黏附入侵宿主細(xì)胞和胞內(nèi)增殖后擴(kuò)散中發(fā)揮了重要作用。

此外，中華絨螯蟹微孢子蟲(chóng)侵染宿主細(xì)胞時(shí)，還需要考慮宿主免疫系統(tǒng)的排斥，預(yù)測(cè)所得的分泌蛋白中，有一些具有抑制宿主免疫反應(yīng)的能力，例如，甲基轉(zhuǎn)移酶EZH1。Jia等[23]研究表明，該分泌蛋白可以通過(guò)修飾巨噬細(xì)胞極化來(lái)調(diào)控免疫反應(yīng)，從而避免在侵染過(guò)程被宿主的免疫系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)并清除，為微孢子蟲(chóng)入侵宿主細(xì)胞提供條件，但其對(duì)巨噬細(xì)胞具體產(chǎn)生的影響和調(diào)控宿主免疫反應(yīng)的功能，還需進(jìn)一步研究才能明確。

除了黏附和侵染宿主細(xì)胞及抑制宿主細(xì)胞免疫反應(yīng)以外，一些分泌蛋白還可以參與調(diào)控宿主細(xì)胞的增殖和代謝，為微孢子蟲(chóng)侵染宿主細(xì)胞后的生命活動(dòng)和繁衍后代提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如在預(yù)測(cè)中比對(duì)到了1,4-葡聚酶分支糖。糖原為生物體存儲(chǔ)了大量能量，D-葡萄糖通過(guò)α-(1,4)糖苷鍵和α-(1,6)糖苷鍵能鏈接聚合成高分子聚糖，而1,4-葡聚酶分支糖廣泛存在于原核動(dòng)物和真核動(dòng)物體內(nèi)，是催化合成糖苷鍵分支的關(guān)鍵酶，糖原分支越多，糖原的水溶性越大，非還原端的數(shù)目越多，有利于糖原儲(chǔ)存和分解產(chǎn)生作用[24]，在李曉旭等[25]的研究中發(fā)現(xiàn)，1,4-葡聚酶分支糖含量增加可使糖原合成酶的活性及糖原含量均先增加再減少。另外，還比對(duì)到了絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，它不僅可以使一些與細(xì)胞分裂、機(jī)體中心代謝和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)有關(guān)的蛋白質(zhì)磷酸化而激發(fā)其功能，還具有合成嘌呤及嘧啶、修復(fù)DNA、合成谷氨酰胺、氧化應(yīng)激反應(yīng)等作用[26-27]。絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶在中華絨螯蟹微孢子蟲(chóng)的增殖和代謝中具體扮演何種角色有必要開(kāi)展深入研究進(jìn)行解答。除了上述幾種分泌蛋白之外，同時(shí)預(yù)測(cè)到了鳥(niǎo)嘌呤核苷酸交換因子，有研究表明，鳥(niǎo)嘌呤核苷酸交換子可能作為一種促癌因子參與癌癥的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程[28]，在一定程度上影響細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡。

4 結(jié) 論

從2700個(gè)中華絨螯蟹微孢子蟲(chóng)蛋白質(zhì)序列中，篩選出99個(gè)分泌蛋白，這些分泌蛋白平均長(zhǎng)度為142.84 aa，信號(hào)肽平均長(zhǎng)度為18.63 aa。分泌蛋白與其信號(hào)肽的氨基酸組成中，均以疏水性氨基酸為主，截取的信號(hào)肽剪切位點(diǎn)前后各3個(gè)氨基酸殘基中，含量最多的種類也為疏水性氨基酸。

對(duì)99個(gè)預(yù)測(cè)所得的分泌蛋白進(jìn)行比對(duì)分析和功能注釋發(fā)現(xiàn)，其中有68個(gè)未檢測(cè)出同源蛋白的分泌蛋白、19個(gè)酶類物質(zhì)、1個(gè)糖蛋白、1個(gè)交換因子和10個(gè)具有其他功能的分泌蛋白。預(yù)測(cè)獲得的這些重要分泌蛋白可能與中華絨螯蟹微孢子蟲(chóng)侵染宿主、調(diào)控宿主細(xì)胞周期及免疫反應(yīng)等生理活動(dòng)相關(guān)，研究結(jié)果可為進(jìn)一步研究微孢子蟲(chóng)侵染宿主細(xì)胞的過(guò)程及宿主—寄生蟲(chóng)相互作用提供參考。