彭冰冰，賓東超，周于娜，楊志會，蔡小輝，彭銀輝

( 1.北部灣大學 海洋學院，廣西北部灣海洋生物多樣性養(yǎng)護重點實驗室，廣西 欽州 536011; 2.北海市漁業(yè)技術(shù)推廣站，廣西 北海 536000; 3.邢臺市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，河北 邢臺 054000 )

方格星蟲(Sipunculusnudus)，也稱光裸方格星蟲，又名“海人參”，屬星蟲動物門、方格星蟲科、方格星蟲屬，廣泛分布在灘涂或淺海區(qū)域，廣西北部灣海域自然資源最豐富[1]。方格星蟲營養(yǎng)豐富、味道鮮美，含豐富的蛋白質(zhì)、多種氨基酸以及多種微量元素，具有抗疲勞、抗氧化、抗病毒、降血壓、祛濕、清肺補虛等醫(yī)藥價值，素有“海洋冬蟲夏草”的美譽[2-4]。

實時熒光定量PCR(qRT-PCR)是一種核酸定量技術(shù)，可以實現(xiàn)對初始模板的定量分析，具有定量準確、靈敏度高、特異性強等優(yōu)點，在分子生物學研究領(lǐng)域的基因表達分析中發(fā)揮著重要作用[5]。但是在用實時熒光定量PCR技術(shù)對某一目的基因的不同樣品的表達量進行數(shù)據(jù)處理和分析時，會受到起始RNA質(zhì)量和數(shù)量、反轉(zhuǎn)錄效率、擴增效率以及不同細胞和組織間的差異等變量的影響[6]。因此要選擇表達水平相對穩(wěn)定的內(nèi)參基因?qū)δ康幕虻谋磉_量進行參考和校正，確保結(jié)果的可信度[7]。同一組織的內(nèi)參基因的表達基本沒有差別，但是不同種類、不同試驗條件的內(nèi)參基因表達量并不一致，用不同內(nèi)參基因校正會得到不一樣的結(jié)果，所以選擇合適的內(nèi)參基因是試驗的必要前提。

通過查閱相關(guān)文獻并結(jié)合前期獲得的方格星蟲發(fā)育轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，共篩選出肌動蛋白家族(Actin1)、微管蛋白家族(α-Tub1)、核糖體蛋白(RPL13-b)、延伸因子1-α(EF1-α2)、H3-b(組蛋白)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH1)6個方格星蟲生命活動所必需的基因作為候選內(nèi)參基因。肌動蛋白是一種細胞骨架蛋白，對細胞分裂、細胞運動以及細胞骨架的維持有重要作用，在多種植物的不同發(fā)育時期的花瓣和不同組織中均表現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性[8]；α-Tub1基因是控制表達維持細胞骨架的基本組分蛋白基因[9]，一些研究者指出，其為表達較為穩(wěn)定的內(nèi)參基因[10]；核糖體蛋白是真核生物核糖體中表達豐富的一類蛋白，在蛋白合成、核糖體裝配以及細胞的增殖和分化中起重要作用，RPL13-b基因作為穩(wěn)定的內(nèi)參基因用于多個物種實時熒光定量PCR中[11]；延伸因子1-α是在mRNA翻譯時促進肽鏈延伸的蛋白因子，具有保守性和穩(wěn)定性[12]；H3-b基因參與染色質(zhì)的組裝，協(xié)調(diào)折疊、包裝DNA，通過調(diào)節(jié)基因的表達調(diào)控細胞的分裂、凋亡以及DNA的修復等細胞生命過程，在進化過程中高度保守[13]；甘油醛-3-磷酸脫氫酶是糖酵解反應中的一種反應酶，具有修復DNA、促進細胞凋亡、調(diào)節(jié)組蛋白等多種作用[14]，有較好的穩(wěn)定性[15]。應用實時熒光定量PCR對方格星蟲組織中的內(nèi)參基因的表達量進行檢測，篩選出相對穩(wěn)定表達的內(nèi)參基因并驗證，結(jié)果將為方格星蟲目的基因的定量分析提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗所用方格星蟲個體采自北部灣福成海域。使用鹽酸普洛卡因(0.25%～0.5%)浸泡方格星蟲5～10 min用于麻醉[16]。使用1 mL一次性注射器抽取方格星蟲體腔液于裝有CAD抗凝劑的離心管中，12 000 r/min離心5 min(離心機型號：sigma 2-16KP)，獲取血淋巴細胞，-80 ℃保存?zhèn)溆?。使用剪刀剖取方格星蟲蟲體的體壁肌肉、吻、腎管、腦、腸道、收吻肌、食道，立即投入到液氮中，并轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存待用。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取

將方格星蟲組織轉(zhuǎn)移至500 μL Trizol中，按照TransZol Up說明書(Invitrogen，USA)提取各方格星蟲組織的RNA。取2 μL RNA樣品用核酸蛋白測定儀測定濃度和純度，1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測完整性。

1.2.2 cDNA合成

按照北京全式金生物技術(shù)有限公司的TransScript?One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix 說明書將提取到的方格星蟲組織的RNA合成為cDNA。反應體系(20 μL)：2×TS Reaction Mix 10 μL，500 ng total RNA, Random Primer 1 μL，EasyScript?RT/RI Enzyme Mix 1 μL, gDNA Remover 1 μL。擴增程序為：42 ℃反應59 min；85 ℃ 5 s，使EasyScript?RT/RI Enzyme和gDNA Remover失活；4 ℃保存。合成的cDNA于-20 ℃保存?zhèn)溆?，用于實時熒光定量PCR分析。

1.2.3 基因引物選擇和實時熒光定量PCR擴增

方格星蟲6個候選內(nèi)參基因(EF1-α2、α-Tub1、RPL13-b、Actin1、H3-b和GAPDH1)和免疫球蛋白(IgGFc-binding protein)基因序列為本課題組構(gòu)建的方格星蟲肌肉組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，根據(jù)在線軟件Primer3設(shè)計(表1)，并于江蘇東玄基因科技有限公司合成。實時熒光定量PCR檢測內(nèi)參基因特異性，以方格星蟲腦組織的cDNA為模板，反應體系(12.5 μL)：cDNA 0.5 μL，引物F和R各0.5 μL，r Taq 6 μL，超純水5 μL。反應程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min，16 ℃ 保存。反應完成后，取5 μL的擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢驗。

表1 本試驗所用的引物序列Tab.1 Primer sequences used in this study

1.2.4 實時熒光定量PCR擴增

參照北京全式金生物技術(shù)有限公司的TransScript?Green qPCR SuperMix試劑盒說明書，QuantStudioTM 6 Flex Real-Time PCR System儀器上進行反應。反應體系(10 μL)： cDNA 0.5 μL，引物F和R各0.4 μL，Passive Reference Day 0.2 μL，Nuclease-free water 3.5 μL。反應程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，56 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，40個循環(huán)；95 ℃ 5 s，70 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。每個反應設(shè)置3個平行。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用QuantStudioTM 6 Flex Real-Time PCR System軟件獲取引物熔解曲線和Ct值。統(tǒng)計各組平均值，減去每組中最小Ct值，得到ΔCt，并利用公式2-ΔCt得到Q值。應用geNorm、NormFinder和BestKeeper軟件篩選出最穩(wěn)定的內(nèi)參基因并進行內(nèi)參基因驗證試驗。

2 結(jié) 果

2.1 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

6個候選內(nèi)參基因擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖1，每個候選內(nèi)參基因的引物均擴增出了單一正確的產(chǎn)物，無可見的引物二聚體，說明引物的特異性良好。

圖1 候選內(nèi)參基因擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.1 Amplification products electrophoresis of candidate internal reference genesM.DNA maker; 1—6.Actin1, EF1-α2，H3-b,RPL13-b,GAPDH1 and α-Tub1.

2.2 熔解曲線

6個候選內(nèi)參基因的熔解曲線見圖2，均為單一的信號峰，說明6個候選內(nèi)參基因擴增后未產(chǎn)生引物二聚體和非特異性條帶。

圖2 內(nèi)參基因的熔解曲線Fig.2 Melt curves of internal reference genesa—f.Actin1, EF1-α2, H3-b, RPL13-b, GAPDH1 and α-Tub1; RFU.relative fluorescence unit.

2.3 內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定分析

使用geNorm軟件評估6個候選內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性(M)，基因的表達穩(wěn)定值越小，表明穩(wěn)定性越高。根據(jù)geNorm軟件計算的表達穩(wěn)定值排列順序為：α-Tub1>Actin1>GAPDH1>EF1-α2>RPL13-b=H3-b(圖3)，候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性順序為：RPL13-b=H3-b>EF1-α2>GAPDH1>Actin1>α-Tub1，說明表達最穩(wěn)定的基因是RPL13-b和H3-b。

圖3 內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定值Fig.3 The expression stability of internal reference gene

利用geNorm程序分析內(nèi)參基因的配對差異值Vn/n+1，結(jié)果顯示V2/3值最小，為0.267，大于程序推薦值0.15(圖4)，因此需要3個內(nèi)參基因才能達到校正的目的。

圖4 內(nèi)參基因的配對差異值Fig.4 The pairing differences of internal reference genes

進一步使用NormFinder軟件對6個內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性進行分析，表達穩(wěn)定值越小基因表達就越穩(wěn)定。表達穩(wěn)定值的順序為：α-Tub1>Actin1>H3-b>GAPDH1>EF1-α2>RPL13-b。結(jié)果表明，候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性順序為：RPL13-b>EF1-α2>GAPDH1>H3-b1>Actin1>α-Tub1，RPL13-b的表達穩(wěn)定值最小(表2)，是表達最穩(wěn)定的基因。

表2 內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定值Tab.2 The expression stability of the internal reference genes

使用BestKeeper軟件評估6個候選內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性，變異系數(shù)越小表示穩(wěn)定性越高，根據(jù)BestKeeper軟件計算的變異系數(shù)排列順序為：α-Tub1>Actin1>GAPDH1>EF1-α2>H3-b>RPL13-b(表3)，則候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性順序為：RPL13-b>H3-b>EF1-α2>GAPDH1>Actin1>α-Tub1。結(jié)果表明，RPL13-b的變異系數(shù)最小，是表達最穩(wěn)定的基因。

表3 內(nèi)參基因的變異系數(shù)Tab.3 Coefficient of variation in internal reference genes

2.4 內(nèi)參基因穩(wěn)定性的驗證

為驗證內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，在方格星蟲組織試驗體系中分別選擇穩(wěn)定性排名最高和最低的內(nèi)參基因RPL13-b和α-Tub1，對免疫球蛋白基因的表達水平進行分析。采用穩(wěn)定性好的內(nèi)參基因RPL13-b對實時熒光定量PCR數(shù)據(jù)進行校準時，免疫球蛋白基因在吻中表達量最高，在其他組織中表達量較低(圖5)。但是采用最不穩(wěn)定的內(nèi)參基因α-Tub1對實時熒光定量PCR數(shù)據(jù)校準時，免疫球蛋白基因表達水平在收吻肌中表達量最高，血淋巴細胞和吻中次之，其他組織均較低。因此，使用不同內(nèi)參基因標準化免疫球蛋白基因的表達會呈現(xiàn)不同模式。

圖5 不同內(nèi)參基因校準后的目的基因IgGFc-binding protein在方格星蟲組織中的相對表達量Fig.5 Relative expression level of target gene IgGFc-binding protein in peanut worm S. nudus after calibration with different internal reference genes

3 討 論

3.1 實時熒光定量PCR及內(nèi)參基因的特性

實時熒光定量PCR是一種靈敏度高、特異性強、重現(xiàn)性好的常用的基因表達分析方法[17-18]，但是容易受到試驗中多種變量的影響，需要選定合適的內(nèi)參基因作為校正，內(nèi)參基因即內(nèi)部參照基因，它們在各組織和細胞中的表達相對恒定，在檢測基因的表達水平變化時常以其作為參照物。但是在所有試驗條件下普遍適用的內(nèi)參基因基本不存在[19]，董曉麗等[20]在小鼠研究中發(fā)現(xiàn)，同一個體不同組織中基因的表達穩(wěn)定性會不同；鮑相渤等[21]在蝦夷扇貝(Patinopectenyessoensis)的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，在不同處理條件下基因的表達穩(wěn)定性存在差異；王忠偉等[22]在籽鵝的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，不同發(fā)育時期基因的表達穩(wěn)定性也會不一樣；因此對內(nèi)參基因進行評估和篩選是保證試驗結(jié)果準確性的必要前提[23]。然而，有關(guān)方格星蟲內(nèi)參基因的研究非常少，張家煒等[24]分別對方格星蟲不同發(fā)育時期卵細胞和全組織的內(nèi)參基因進行分析篩選，分別得出了18S rRNA和GAPDH基因為最優(yōu)內(nèi)參基因的結(jié)論。

3.2 方格星蟲內(nèi)參基因的篩選

本試驗利用實時熒光定量PCR對Actin1、α-Tub1、RPL13-b、EF1-α2、H3-b、GAPDH1共6個候選內(nèi)參基因在方格星蟲不同組織中的表達情況進行分析，并利用相關(guān)統(tǒng)計軟件GeNorm、NormFinder、BestKeeper[25]對這6個候選內(nèi)參基因進行穩(wěn)定性分析。結(jié)果顯示，RPL13-b基因的表達穩(wěn)定性最高，這與在尖裸鯉(Oxygymnocyprisstewartii)[26]和鱖(Sinipercachuatsi)[27]中的研究結(jié)果一致，篩選出RPL13基因為適宜內(nèi)參基因。而費越越等[28]發(fā)現(xiàn)，在健康異育銀鯽(Carassiusauratusgibelio)的不同組織中，EF1-α2基因表達最為穩(wěn)定；吳萍等[29]在鱖的研究中發(fā)現(xiàn)，18S rRNA和GAPDH基因的表達最穩(wěn)定；張家煒等[30]在方格星蟲全組織中篩選出TATA結(jié)合蛋白TBP(1)基因為實時熒光定量PCR的最適單內(nèi)參基因。這可能是選擇不同物種和不同內(nèi)參基因?qū)е碌慕Y(jié)果。

3.3 內(nèi)參基因的穩(wěn)定性分析

geNorm與NormFinder軟件的算法相似[31]，都是通過比較平均表達穩(wěn)定值的大小來進行候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性評價，表達穩(wěn)定值越小表示越穩(wěn)定。geNorm可以引入1個新的內(nèi)參基因的配對差異值V，根據(jù)配對差異分析Vn/n+1來確定最合適的內(nèi)參基因數(shù)量。當Vn/n+1<0.15時，最適內(nèi)參基因數(shù)為n；當Vn/n+1>0.15時，最適內(nèi)參基因數(shù)為n+1[32]。本試驗中，V2/3=0.267>0.15，故需要3個內(nèi)參基因做校正，分別是RPL13-b、H3-b、EF1-α2。BestKeeper軟件直接導入Ct計算標準差和變異系數(shù)，比較標準差和變異系數(shù)的大小。標準差和變異系數(shù)越小，內(nèi)參基因的穩(wěn)定性越高。不同軟件計算的穩(wěn)定性分析不完全一致[33]，但綜合來說，RPL13-b內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性高。為了進一步驗證所篩選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，使用最穩(wěn)定的內(nèi)參基因RPL13-b和最不穩(wěn)定的內(nèi)參基因α-Tub1，對免疫球蛋白基因的表達水平進行分析，結(jié)果表明使用不同內(nèi)參基因標準化免疫球蛋白基因的表達呈現(xiàn)不同模式。

4 結(jié) 論

本試驗利用實時熒光定量PCR對方格星蟲Actin1、α-Tub1、RPL13-b、EF1-α2、H3-b、GAPDH1共6個候選內(nèi)參基因在不同組織中的表達情況進行分析，利用統(tǒng)計軟件GeNorm、NormFinder、BestKeeper分析了候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性，并使用最穩(wěn)定的內(nèi)參基因RPL13-b和最不穩(wěn)定的內(nèi)參基因α-Tub1，對免疫球蛋白基因的表達水平進行分析，結(jié)果表明，RPL13-b基因在方格星蟲各組織中的表達最穩(wěn)定，可作為方格星蟲的最適單內(nèi)參基因。