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      白藜蘆醇促進(jìn)人前列腺癌PC-3細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究

      2022-03-21 14:25:50李家萱陳美霓
      關(guān)鍵詞:激酶前列腺癌染色

      李家萱, 陳美霓, 郭 巍

      前列腺癌為男性泌尿系統(tǒng)常見的腫瘤,發(fā)病率和死亡率在40歲后隨年齡的增加而增高。前列腺癌的早期臨床癥狀較輕,發(fā)現(xiàn)時(shí)多已到中晚期。前列腺癌早中期治療以手術(shù)、放化療為主,晚期以保守治療為主,其治療效果不佳[1]。中藥誘導(dǎo)腫瘤凋亡治療是近年來的研究熱點(diǎn)。有研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇(resveratrol,Res)是一種植物抗毒素,主要存在于葡萄、虎杖、花生等植物中,在對(duì)抗炎癥、抗癌癥、保護(hù)機(jī)體功能等方面具有巨大的應(yīng)用前景。近年來,Res的抗腫瘤作用逐漸引起學(xué)者的重視,有望開發(fā)為新的抗腫瘤藥物。目前,關(guān)于Res抗前列腺癌的機(jī)制尚未完全明確,本研究旨在觀察Res對(duì)人前列腺癌PC-3細(xì)胞形態(tài)、增殖、凋亡的影響,對(duì)其可能機(jī)制進(jìn)行初步探討,現(xiàn)報(bào)道如下。

      1 材料與方法

      1.1主要材料與儀器 人前列腺癌PC-3細(xì)胞株、RPMI-1640培養(yǎng)基、碘化丙啶(propidium iodide,PI)、胎牛血清(fetal bovine serum,F(xiàn)BS)購(gòu)自武漢博士德公司。Res、噻唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)引物由上海生工生物工程公司合成。AnnexinV-FITC/PI染色試劑盒購(gòu)自中國(guó)艾美捷科技公司。TransScript Uni All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(One-Step cDNA Removal)和TransStart Tip Green qPCR SuperMix購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。酶標(biāo)儀:美國(guó)BD,型號(hào)spectramax190。流式細(xì)胞儀:德國(guó)System,型號(hào)cobas z 480。

      1.2方法

      1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 PC-3細(xì)胞以含10% FBS、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng),置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中。選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。設(shè)置12.50、25.00、50.00、100.00 μmol/L Res干預(yù)組(分別為A組、B組、C組和D組),以含5% FBS的培養(yǎng)基配置Res進(jìn)行PC-3細(xì)胞干預(yù)處理。設(shè)置對(duì)照組,加入等體積含5% FBS的完全培養(yǎng)基進(jìn)行PC-3細(xì)胞干預(yù)處理。

      1.2.2 MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞活性 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的PC-3細(xì)胞,經(jīng)消化、離心后調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105cells/ml的細(xì)胞懸液,96孔培養(yǎng)板中每孔加入100 μl細(xì)胞懸液,移至培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。按方法1.2.1進(jìn)行分組處理,每組5個(gè)復(fù)孔。在培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后向每孔加入MTT溶液(5 mg/ml)20 μl,移至培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h,終止培養(yǎng)。棄孔內(nèi)上清液,每孔加入二甲基亞砜150 μl,在微量振蕩器上振蕩10~15 min,使用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)為490 nm處的吸光度值。

      1.2.3 PI熒光染色觀察細(xì)胞形態(tài) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC-3細(xì)胞,接種于內(nèi)有干凈無菌蓋玻片的6孔板中,培養(yǎng)24 h后按方法1.2.1進(jìn)行分組處理,培養(yǎng)48 h后棄培養(yǎng)液,以磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)洗滌3次,滴加濃度為100 μg/ml的PI染液于爬片上,染色30 s,夾出蓋玻片置于載玻片上,熒光顯微鏡觀察拍照。

      1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC-3細(xì)胞,接種于6孔板中,培養(yǎng)24 h后按方法1.2.1進(jìn)行分組處理,繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞48 h后按AnnexinV-FITC/PI染色試劑盒說明書步驟進(jìn)行染色,應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡率。重復(fù)3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

      1.2.5 RT-qPCR檢測(cè)凋亡相關(guān)基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的PC-3細(xì)胞接種于6孔板,按方法1.2.1進(jìn)行分組處理PC-3細(xì)胞,每組3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)48 h后棄上清液,經(jīng)消化、離心收集細(xì)胞。采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA。反轉(zhuǎn)錄、熒光定量檢測(cè)嚴(yán)格按照試劑盒說明書步驟進(jìn)行。反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性60 s,然后95 ℃變性10 s,60 ℃退火60 s,40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參,所用引物序列見表1。檢測(cè)結(jié)果以2-△△CT法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

      表1 引物序列

      2 結(jié)果

      2.1各組PC-3細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率比較 MTT比色法檢測(cè)結(jié)果顯示,以對(duì)照組作為參照,各實(shí)驗(yàn)組PC-3細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率均隨干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)而升高,且B組、C組和D組在干預(yù)48 h后PC-3細(xì)胞增殖抑制作用明顯。見表2。

      表2 各組PC-3細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率比較

      2.2各組PC-3細(xì)胞形態(tài)情況 PI熒光染色結(jié)果顯示,對(duì)照組PC-3細(xì)胞狀態(tài)良好,細(xì)胞質(zhì)豐富,細(xì)胞核大小均一,呈均勻紅色熒光。A組PC-3細(xì)胞開始出現(xiàn)少量的亮紅色圓形凋亡小體。B組和C組PC-3細(xì)胞數(shù)量明顯開始減少,可見細(xì)胞核碎裂、染色質(zhì)固縮的凋亡細(xì)胞,并出現(xiàn)無細(xì)胞輪廓的壞死細(xì)胞。D組見PC-3細(xì)胞稀疏,亮紅色圓形凋亡小體明顯增多。見圖1。

      圖1 熒光顯微鏡下各組PC-3細(xì)胞形態(tài)圖(PI熒光染色,×200)

      2.3各組PC-3細(xì)胞凋亡率比較 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示,A組、B組、C組和D組的PC-3細(xì)胞凋亡率分別為(1.35±0.65)%、(5.17±1.18)%和(10.74±2.24)%和(21.16±3.13)%,對(duì)照組為(0.77±0.11)%,總體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=64.332,P=0.000)。經(jīng)兩兩比較,B組、C組、D組PC-3細(xì)胞凋亡率顯著高于對(duì)照組(P<0.05),A組與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

      圖2 各組流式細(xì)胞檢測(cè)PC-3細(xì)胞凋亡結(jié)果圖

      2.4各組凋亡相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 RT-qPCR結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,C組、D組Caspase-3、Caspase-9、Caspase-8、Bax mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05),Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。見表3。

      表3 各組凋亡相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

      3 討論

      3.1前列腺癌的發(fā)病率和死亡率在全球范圍內(nèi),尤其是亞洲地區(qū),呈上升趨勢(shì)。1992—2017年,中國(guó)男性前列腺癌粗死亡率從3.39/105上升到7.17/105。轉(zhuǎn)移性前列腺癌對(duì)藥物不敏感,預(yù)后差,生存率低,迫切需要開發(fā)有效的治療藥物。研究發(fā)現(xiàn),Res在保護(hù)心肌缺血損傷[2]、抑制脂肪細(xì)胞葡萄糖利用防治肥胖[3]、防治阿爾茨海默病等神經(jīng)退行性疾病[4]、抗病毒[5]和抗炎癥[6]等方面具有廣泛的積極生物活性。在抗癌方面發(fā)現(xiàn),Res對(duì)非小細(xì)胞肺癌[7]、黑色素瘤[8]、乳腺癌[9]、胰腺癌[10]、膀胱癌[11]等惡性腫瘤具有促凋亡、抑增殖的效果,并且可增強(qiáng)多種抗腫瘤藥的抗腫瘤效果[12-14]。但Res對(duì)前列腺癌的作用研究較少,抑癌機(jī)制尚不清楚。

      3.2研究發(fā)現(xiàn),Res抗癌的機(jī)制可能與以下幾條途徑有關(guān):(1)調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,如絲裂原細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(mitogen-activated extracellular signal-regulated kinase,MEK)/細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)、Janus激酶1(Janus kinase 1,JAK1)/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)、磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)、蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A,PP2A)-細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2,ERK1/2)等;(2)調(diào)控細(xì)胞周期蛋白(cyclin)/細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶7(cyclin-dependent kinases 7,CDK7)/原癌基因c-Myc的表達(dá),影響細(xì)胞周期;(3)調(diào)節(jié)Caspase-3/9、P53、白介素(interleukin,IL)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)和Bax/Bcl-2家族等因子介導(dǎo)的凋亡通路,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡;(4)調(diào)控金屬蛋白酶類(matrix metalloproteinases,MMPs)、缺氧誘導(dǎo)因子α(hypoxia inducible factor α,HIF-α)等的表達(dá),抑制血管形成;(5)抑制細(xì)胞內(nèi)過量的活性氧(reactive oxygen species,ROS)/ERK,降低聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(poly adenosine diphosphate ribose polymerase,PARP)、環(huán)氧合酶2(cyclooxygenase-2,COX-2)水平,修復(fù)細(xì)胞內(nèi)氧化的失衡;(6)影響肝激酶B1(liver kinase B1,LKB1)-腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)-雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)、Akt-mTORC1、沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulator 1,SIRT1)/SIRT3-叉頭盒轉(zhuǎn)錄因子O(forkhead box O,FoxO)、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)-Ⅱ以及STAT3信號(hào)通路,調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬[15-17]。本研究采用不同濃度的Res對(duì)PC-3細(xì)胞進(jìn)行干預(yù),結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)干預(yù)濃度達(dá)到25.00 μmol/L及以上時(shí)可顯著抑制PC-3細(xì)胞增殖,并與藥物劑量和干預(yù)時(shí)間呈依賴性關(guān)系,提示Res具有治療前列腺癌的應(yīng)用前景。

      3.3細(xì)胞凋亡屬于自穩(wěn)機(jī)制,其調(diào)控失衡可能是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要因素。本研究通過PI熒光染色發(fā)現(xiàn),Res濃度達(dá)到12.50 μmol/L以上時(shí),對(duì)PC-3細(xì)胞核形態(tài)產(chǎn)生影響,且隨著藥物濃度增加,PC-3細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢,排列較稀疏,細(xì)胞核固縮,凋亡細(xì)胞比例逐漸增高,提示Res可能具有促進(jìn)PC-3細(xì)胞凋亡作用。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果也顯示,B組、C組、D組PC-3細(xì)胞凋亡率顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。Caspase-3/Bax/Bcl-2是細(xì)胞凋亡的重要信號(hào)通路之一。Bcl-2家族中Bcl-2/Bax形成異源二聚體,通過抑制氧化和細(xì)胞內(nèi)Ca2+跨膜流動(dòng),促進(jìn)細(xì)胞色素C釋放等方式誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[18],同時(shí)活化Caspase-9。在Caspase家族中Caspase-3是凋亡過程的主要執(zhí)行蛋白之一,而Caspase-8和Caspase-9屬于細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)蛋白,可激活Caspase-3,使細(xì)胞內(nèi)重要蛋白酶失活,導(dǎo)致細(xì)胞功能和形態(tài)變化,促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Xu等[19]發(fā)現(xiàn),Res可以通過調(diào)節(jié)Bax/Bcl-2比例和Caspase-3的活性等方式誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡。本研究RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示,當(dāng)Res干預(yù)濃度達(dá)到50.00 μmol/L及以上時(shí)能夠提高Bax、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9基因的表達(dá)量水平,并下調(diào)Bcl-2基因的表達(dá),提示Res可能是通過調(diào)控相關(guān)凋亡基因表達(dá)而發(fā)揮抗前列腺癌的作用。

      綜上所述,Res能夠抑制PC-3細(xì)胞增殖,并通過調(diào)控Caspase-3/Bax/Bcl-2信號(hào)通路促進(jìn)凋亡的發(fā)生,具有治療前列腺癌的應(yīng)用前景。Res的藥理作用較為復(fù)雜,需要進(jìn)一步研究。

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