次氯酸鈉對(duì)白刺開放式組培苗生理特性的影響

扁紅英，蘇世平，李 毅，王鑫鑫

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院, 甘肅 蘭州 730070）

唐古特白刺(Nitraria tangutorum)為蒺藜科(Zygophyllaceae)白刺屬(Nitraris)植物，分布于我國的西北沙漠及華北地區(qū)，適應(yīng)性極強(qiáng)，具有較強(qiáng)的防風(fēng)固沙、耐干旱、耐鹽堿、抗嚴(yán)寒、耐瘠薄等優(yōu)良特性。作為干旱荒漠區(qū)典型的耐旱鄉(xiāng)土樹種，在固沙固土、水源涵養(yǎng)中起著極其重要的作用[1-3]。此外，白刺還具有抑制胃癌MGC-803 細(xì)胞的作用[4]，其果實(shí)具有較高的營養(yǎng)價(jià)值[5]。白刺作為荒漠、半荒漠草地植被的重要建群種之一，主要依靠種子繁殖，但種間雜交混亂，差異較大。因此，近年來研究者在采取組織培養(yǎng)解決白刺無性繁殖問題，建立完善的白刺快繁技術(shù)體系，以及實(shí)現(xiàn)白刺遺傳改良等方面進(jìn)行了大量的研究[6-9]。

開放式組培[10-13]作為一種簡單易行的組培方法，近幾年被廣泛應(yīng)用于多種植物組織培養(yǎng)中，具有操作程序簡單，試驗(yàn)成本低、污染率低的特點(diǎn)，在杉木(Cunninghamia lanceolata)、相思(Acacia)、甘蔗(Saccharum officinarum)、馬鈴薯(Solanum tuberosum)等多種植物[14-27]組織培養(yǎng)中被廣泛應(yīng)用。目前，在開放式組培研究中，主要著眼于抑菌劑[28]種類和濃度的篩選，張艷[14]研究表明，62.5 mg·L-180%代森錳 鋅 + 62.5 mg·L-1菌 殺 保 果 + 0.5%次 氯 酸 鈉(NaClO)混合抑菌劑在杉木開放式組培中抑菌效果最好；陳亞蘭等[20]研究表明，70%甲基硫菌靈可濕性粉劑和50%多菌靈可濕性粉劑對(duì)馬鈴薯組培苗生產(chǎn)中最常見的青霉菌、細(xì)菌和酵母菌3 種菌均有較強(qiáng)抑制作用，并且對(duì)馬鈴薯試管苗的生長以及生根產(chǎn)生的不良影響最小。雖然開放式組培中抑菌劑有效降低了污染率，但它還是有一定的不良影響，如解輝[29]等在‘巴西’香蕉開放式組培中發(fā)現(xiàn)NaClO 明顯降低培養(yǎng)基的污染率，但試管苗生根率卻低于傳統(tǒng)組培苗；吳桂容等[30]研究發(fā)現(xiàn)，NaClO能降低荸薺(Eleocharis tuberosa)組培中培養(yǎng)基污染率，荸薺組培苗的誘導(dǎo)率也低于對(duì)照組；李婷婷等[18]在馬鈴薯開放式組培的研究中發(fā)現(xiàn)，高濃度NaClO 浸泡試驗(yàn)器具后的藥品殘留會(huì)對(duì)組培苗產(chǎn)生毒害作用。盡管有關(guān)抑菌劑種類與濃度篩選的研究比較多，但抑菌劑對(duì)組培苗在生理生化方面的影響或毒害機(jī)理方面的研究目前比較少見，僅見王凱[31]對(duì)山丹丹(Lilium pumilum)組培方式增值培養(yǎng)生理生化的動(dòng)態(tài)變化研究。因此，本研究通過在白刺開放式組培中添加不同濃度NaClO，探索NaClO對(duì)白刺組培苗生長及生理特性的影響，揭示其相應(yīng)機(jī)理，為白刺開放式組培技術(shù)體系的優(yōu)化提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)種源實(shí)驗(yàn)林采集的唐古特白刺外植體經(jīng)傳統(tǒng)組織培養(yǎng)獲得的無菌苗和NaClO 固體結(jié)晶。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 植物開放式組織培養(yǎng)法培養(yǎng)

在培養(yǎng)基MS + IAA 0.01 mg·L-1+ 蔗糖15 g·L-1+瓊脂6 g·L-1+ NaClO (5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 mg·L-1)進(jìn)行開放式組織培養(yǎng)，待煮沸的培養(yǎng)基冷卻至室溫凝固時(shí)，加入NaClO，攪拌均勻、裝瓶、放置超凈工作臺(tái)備用。以常規(guī)組培為對(duì)照(CK)，每個(gè)濃度3 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)30 瓶，每瓶接種一個(gè)無菌苗莖段。培養(yǎng)環(huán)境：溫度(23 ± 2) ℃，光照16 h·d-1，光強(qiáng)1 500～2 000 lx，培養(yǎng)27 d。

1.2.2 測(cè)定指標(biāo)與方法

株高、根長采用直尺測(cè)量，根數(shù)直接計(jì)數(shù)。

可溶性糖(soluble sugar, SS)含量參考蒽酮-乙酸乙酯比色法測(cè)定，可溶性蛋白(soluble protein,SP)含量采用考馬斯亮藍(lán)G-250 染色法測(cè)定，游離脯氨酸(free proline, Pro)含量采用磺基水楊酸法測(cè)定[32]。超氧物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性采用氮藍(lán)四唑光化還原法測(cè)定，過氧化物酶(peroxidase, POD)活性參考愈創(chuàng)木酚法測(cè)定；過氧化氫酶(catalase, CAT)活性參考紫外吸收法測(cè)定，超氧陰離子(superoxide anion, O2·-)含量采用羥胺氧化法測(cè)定，丙二醛(malondialdehyde, MDA)、過氧化氫(hydrogen peroxide, H2O2)含量、苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine ammonia lyase, PAL)、 多 酚 氧 化 酶(polyphenol oxidase, PPO)酶活性測(cè)定參考高俊鳳等[33]的方法測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理與作圖采用Excel 2010 軟件完成，方差分析與多重比較采用SPSS 19.0 軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 NaClO 對(duì)唐古特白刺開放式組培苗形態(tài)指標(biāo)的影響

在NaClO 濃度處理范圍內(nèi)，組培苗生長特性總體呈先升高后降低的趨勢(shì)(表1)。根數(shù)在NaClO濃度為25 mg·L-1時(shí)達(dá)到最大，為4.5 條，比對(duì)照高出31.20%，且與對(duì)照差異顯著(P＜ 0.05)，之后隨NaClO濃度升高，根數(shù)逐漸降低，至NaClO 濃度為50 mg·L-1時(shí)根數(shù)最少，為2.23 條，且顯著低于對(duì)照34.99% (P＜0.05)。白刺組培苗根長在NaClO 濃度為15 mg·L-1時(shí)達(dá)到最大，為4.23 cm，比對(duì)照增加了13.10%，且差異顯著(P＜ 0.05)。NaClO 濃度高于20 mg·L-1時(shí)根長均顯著低于對(duì)照(P＜ 0.05)。苗高在NaClO 濃度為15 mg·L-1時(shí)最大，為8.32 cm，但是與10、20、25、30 mg·L-1處理差異不顯著 (P＞ 0.05)。

表1 NaClO 對(duì)白刺開放式組培苗形態(tài)特性的影響Table 1 Effect of sodium hypochlorite on morphological characteristics of Nitraria tangutorum open tissue culture plantlets

2.2 NaClO 對(duì)白刺開放式組培苗MDA、H2O2、O2·-的影響

丙二醛(MDA)是膜脂過氧化作用的產(chǎn)物。在白刺開放式組培中，MDA 的含量隨NaClO 濃度的增加逐漸降低，其中對(duì)照最高，為0.53 mmol·g-1，NaClO 濃度低于25 mg·L-1時(shí)，MDA 的含量與對(duì)照相比下降不顯著(P＞ 0.05)，高于20 mg·L-1時(shí)，MDA含量顯著低于對(duì)照(P＜ 0.05) (表2)。

表2 NaClO 對(duì)白刺開放式組培苗MDA、H2O2、O2·-含量的影響Table 2 Effect of sodium hypochlorite on malondialdehyde, hydrogen peroxide, and superoxide anions in Nitraria tangutorum open tissue culture plantlets

H2O2和O2·-在植物體內(nèi)伴隨著膜脂過氧化跟膜脂脫氧化反應(yīng)大量產(chǎn)生。隨著NaClO 濃度的增加，白刺組培苗中H2O2含量均高于對(duì)照 ，且與對(duì)照差異顯著(P＜ 0.05)，在20 mg·L-1時(shí)降到最小，為1 178.67 μmol·L-1，比對(duì)照高出27.14%。

隨著NaClO 濃度的增加，白刺組培苗中O2·-含量在40 mg·L-1時(shí)達(dá)到最大，為59.45 μg·g-1，之后含量下降。其中NaClO 濃度為5、10、15、35、50 mg·L-1時(shí)與對(duì)照不顯著(P＞ 0.05)。

2.3 抑菌劑NaClO 對(duì)白刺開放式組培苗代謝產(chǎn)物的影響

可溶性糖(SP)、可溶性蛋白(SS)、脯氨酸(Pro)均是植物體內(nèi)的代謝調(diào)節(jié)產(chǎn)物。隨著NaClO 濃度的增加，白刺組培苗SS 含量，除5、30、35、45 mg·L-1濃度處理與對(duì)照差異不顯著(P＞ 0.05)外，其余濃度梯度處理下SS 含量均顯著低于對(duì)照(P＜ 0.05)，在NaClO 濃度為15 mg·L-1時(shí)，白刺組培苗SS 含量積累量最低，為64.92 mg·g-1(表3)。

表3 NaClO 對(duì)白刺開放式組培苗代謝產(chǎn)物的影響Table 3 Effect of sodium hypochlorite on metabolites of Nitraria tangutorum open tissue culture plantlets

白刺組培苗中SP 含量除50 mg·L-1處理與對(duì)照沒有顯著差異(P＞ 0.05)外，其他濃度處理均與對(duì)照均產(chǎn)生顯著性差異(P＜ 0.05)，在30～45 mg·L-1濃度范圍內(nèi)，隨著NaClO 濃度的增加SP 含量呈上升趨勢(shì)，在20 mg·L-1NaClO 處理下，白刺組培苗SP 含量最低，為24.37 mg·g-1。

隨著NaClO 濃度的增加，白刺組培苗中Pro含量受到抑制，除5、30 mg·L-1處理下組培苗的Pro 含量與對(duì)照不顯著(P＞ 0.05)外，其他濃度處理下的Pro 含量均顯著低于對(duì)照(P ＜0.05)，在NaClO 濃度為20 mg·L-1處理下， Pro 含量最低，為1 602.12 μg·g-1。

2.4 抑菌劑NaClO 對(duì)白刺開放式組培苗SOD活性的影響

超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)等抗氧化酶類在植物體內(nèi)具有自由基清除劑的作用。隨著開放式組培中NaClO 濃度的增加，白刺組培苗SOD 的活性升高，均高于對(duì)照(圖1)。其 中，5 和 10 mg·L-1NaClO 處 理 下SOD 活性與對(duì)照相比不顯著(P＞ 0.05)，其余濃度處理下開放式組培苗中SOD 活性均顯著高于傳統(tǒng)組培苗(P＜ 0.05)。

圖1 NaClO 對(duì)白刺開放式組培苗超氧化物歧化酶活性的影響Figure 1 Effect of sodium hypochlorite on superoxide dismutase in Nitraria tangutorum open tissue culture plantlets

隨著NaClO 濃度的增加，在5～35 mg·L-1濃度梯度處理下，白刺開放式組培苗的POD 活性相較于對(duì) 照 顯 著 升 高(P＜ 0.05) (圖2)；在15 mg·L-1時(shí)，POD 活性達(dá)到最大值，增加為對(duì)照的1.45 倍，NaClO濃度為40、45、50 mg·L-1時(shí)，POD 活性相對(duì)于對(duì)照差異不顯著(P＞ 0.05)。

圖2 NaClO 對(duì)白刺開放式組培苗過氧化物酶活性的影響Figure 2 Effect of sodium hypochlorite on peroxidase in Nitraria tangutorum open tissue culture plantlets

在NaClO 作用下，白刺開放式組培苗中CAT活性均高于對(duì)照，且與對(duì)照產(chǎn)生顯著差異(P＜ 0.05)(圖3)。其中，10 mg·L-1NaClO 處理下的白刺開放式組 培 苗 中CAT 活 性 最 高，為444.096 U·(mg·min)-1，是對(duì)照的1.85 倍。其余濃度處理，除30 mg·L-1與50 mg·L-1處理CAT 的活性差異顯著(P＜ 0.05)外，各處理間CAT 的含量無顯著差異(P＞ 0.05)。

圖3 NaClO 對(duì)白刺開放式組培苗過氧化氫酶活性的影響Figure 3 Effect of sodium hypochlorite on catalase in Nitraria tangutorum open tissue culture plantlets

2.5 抑菌劑NaClO 對(duì)白刺開放式組培苗PPO活性的影響

多酚氧化酶(PPO)可在植物組織受損傷后表現(xiàn)出活性。白刺開放式組培中，隨著NaClO 濃度的增加PPO 活性呈緩慢上升又下降的趨勢(shì)(圖4)，5、10、15 mg·L-1NaClO 濃度處理下組培苗PPO 活性與對(duì)照相比無顯著差異(P＞ 0.05)，當(dāng)NaClO 濃度增加到20 mg·L-1及以上處理時(shí)，組培苗PPO 活性均顯著高于對(duì)照(P＜ 0.05)，40 mg·L-1NaClO 處理下PPO 活性最高，相比于對(duì)照增加了40%。

圖4 NaClO 對(duì)白刺開放式組培苗多酚氧化酶活性的影響Figure 4 Effect of sodium hypochlorite on polyphenol oxidase in Nitraria tangutorum open tissue culture plantlets

2.6 抑菌劑NaClO 對(duì)白刺開放式組培苗PAL活性的影響

苯丙氨酸解氨酶(PAL)對(duì)植物次生產(chǎn)物代謝積累與生理作用產(chǎn)生巨大影響。白刺開放式組培苗中PAL 活性隨著NaClO 濃度的增加整體呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)(圖5)，在NaClO 濃度為15 mg·L-1時(shí)，組培苗中PAL 活性相比于對(duì)照顯著增加并達(dá)到最大值，比對(duì)照增加了26%，濃度為25、30、40、45 mg·L-1時(shí)，組培苗的PAL 活性與對(duì)照無顯著差異(P＞ 0.05)，而在處理50 mg·L-1下，PAL 活性降到最低。

圖5 NaClO 對(duì)白刺開放式組培苗苯丙氨酸解氨酶活性的影響Figure 5 Effect of sodium hypochlorite on phenylalanine ammonia lyase in Nitraria tangutorum open tissue culture plantlets

3 討論與結(jié)論

植物開放式組培是就簡化組培環(huán)節(jié)，以降低組培成本為目的，建立的一套比較完善的植物開放式組織培養(yǎng)模式[13]，其關(guān)鍵在于抑菌劑的選擇和濃度的篩選。在植物組織培養(yǎng)過程中不同營養(yǎng)物質(zhì)配比、不同濃度激素的使用均會(huì)影響組培苗的生長，開放式組培中抑菌劑的加入也同樣會(huì)對(duì)外植體的生長產(chǎn)生一定的影響。本研究通過分析不同濃度NaClO 對(duì)白刺開放式組培苗生理特性的影響發(fā)現(xiàn)，NaClO 濃度為20 mg·L-1時(shí)對(duì)白刺組培苗生長具有促進(jìn)作用，濃度為50 mg·L-1時(shí)對(duì)根長、根數(shù)、苗高均產(chǎn)生明顯的抑制作用。這說明適當(dāng)濃度NaClO 的加入會(huì)使白刺組培苗代謝增強(qiáng)，吸收營養(yǎng)物質(zhì)增多，促進(jìn)其生長。但當(dāng)NaClO 濃度較高時(shí)，具有強(qiáng)氧化性的NaClO 會(huì)產(chǎn)生新生態(tài)氧在抑制微生物的同時(shí)，對(duì)外植體產(chǎn)生毒害作用，抑制組培苗的生長。解輝等[29]通過向培養(yǎng)基中添加不同濃度的NaClO 溶液作為抑菌劑，發(fā)現(xiàn)0.01%以上濃度的NaClO 對(duì)培養(yǎng)基的污染起到有效的抑制作用，濃度超過0.02%時(shí)外植體的存活率降低，試管苗的生根率低于傳統(tǒng)組培苗。李松等[16]在甘蔗的開放式組培中發(fā)現(xiàn)，抑菌劑菌類的繁衍有較好的抑制作用的同時(shí)甘蔗組培苗的生長也受到一定程度的抑制和傷害，其抑制傷害機(jī)理需進(jìn)一步研究。以上研究結(jié)果均與本研究結(jié)果相近。

在生理特性方面，植物在受脅迫后，體內(nèi)活性氧代謝系統(tǒng)的平衡被破壞，膜脂過氧化跟膜脂脫氧化作用啟動(dòng)，隨著NaClO 濃度的增加，白刺組培苗中H2O2含量均高于對(duì)照，含量在20～30 mg·L-1時(shí)顯著高于對(duì)照，說明NaClO 的加入使組培苗活性氧自由基增多，代謝增強(qiáng)。MDA 作為膜脂過氧化作用的產(chǎn)物，含量呈明顯的下降趨勢(shì)，可能是NaClO的加入，使白刺組培苗細(xì)胞受害，造成電解質(zhì)外滲，由于滲透調(diào)節(jié)與抗氧化酶共同的作用下，減弱了膜細(xì)胞的傷害[34]，從而其含量低于對(duì)照，相對(duì)于傳統(tǒng)組培長勢(shì)更好。植物體內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)通過調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透勢(shì)而維持細(xì)胞吸水能力，在受脅迫條件下，透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量會(huì)大量積累[35]，王凱[31]對(duì)兩種山丹丹組培方式增殖培養(yǎng)生理生化的動(dòng)態(tài)變化研究發(fā)現(xiàn)開放式組培可溶糖含量隨著培養(yǎng)天數(shù)增加先降后升，這是由于不定芽接入培養(yǎng)基初期，未適應(yīng)新環(huán)境，先消耗自身可溶糖，之后長勢(shì)恢復(fù)，開始吸收培養(yǎng)基提供的營養(yǎng)物質(zhì)，不定芽內(nèi)可溶糖含量開始積累回升。但本研究開放式組培苗中可溶性糖積累沒有高于傳統(tǒng)組培，可能是因?yàn)椴煌参飳?duì)糖吸收速率不同或者是本研究培養(yǎng)期超過20 d。并且SP 與SS 含量在 30～45 mg·L-1范圍內(nèi)均得到了積累，說明高濃度NaClO 處理下，組培苗受抑制，培養(yǎng)前期消耗減弱，積累量增加，在低濃度NaClO 處理時(shí)由于受脅迫作用不是很強(qiáng)，在自身代謝消耗大的同時(shí)參與調(diào)節(jié)活性氧自由基，從而導(dǎo)致積累量減少。同時(shí)，Pro 與MDA 作為對(duì)于植物逆境環(huán)境的生化參數(shù)，含量也均低于對(duì)照，是因?yàn)橛捎诎状炭购敌暂^強(qiáng)，對(duì)Pro 調(diào)節(jié)能力較強(qiáng)[36]，在培養(yǎng)周期內(nèi)，脯氨酸含量的動(dòng)態(tài)變化已經(jīng)達(dá)到平衡。

抗氧化酶系統(tǒng)通過清除活性氧來保護(hù)膜系統(tǒng)，因此在植物受脅迫時(shí)，抗氧化酶活性會(huì)增強(qiáng)[37]，SOD、CAT、POD、PPO 的活性均有所升高，說明NaClO的加入對(duì)白刺組培苗產(chǎn)生了一定的脅迫。POD、PAL 活性呈先上升后下降的趨勢(shì)，王凱[14]認(rèn)為開放式組織培養(yǎng)由于NaClO 的加入，對(duì)不定芽產(chǎn)生脅迫作用，會(huì)造成POD、SOD 活性的升高，同時(shí)其動(dòng)態(tài)變化可能和不定芽的生長有關(guān)。本研究中所測(cè)抗氧化酶活性在NaClO 濃度高于20 mg·L-1時(shí)均產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，加速合成，同時(shí)50 mg·L-1NaClO 濃度處理下對(duì)植物的毒害作用較強(qiáng)，生理特性與生長特性均受到抑制作用。

在不同濃度NaClO 對(duì)白刺開放式組培苗的作用下，處理濃度為50 mg·L-1時(shí)對(duì)白刺組培苗產(chǎn)生的脅迫作用最強(qiáng)，抑制組培苗的生長?？傮w上，組培苗在高濃度NaClO 作用下受害嚴(yán)重，造成代謝下降，滲透物質(zhì)積累，抗氧化酶活性升高。結(jié)合生理特性，在NaClO 濃度為15～20 mg·L-1時(shí)白刺組培苗生長最佳，最適宜作為白刺開放式組培抑菌劑。