矩鐮莢苜蓿越冬期地下芽的組織化學特征與分化規(guī)律

楊小霞，魏甲科，夏建強，方強恩，張 勃

（甘肅農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院, 甘肅 蘭州 730070）

芽休眠(bud dormancy)是植物芽端分生組織隨環(huán)境變化在活躍生長和休眠狀態(tài)之間轉(zhuǎn)變的動態(tài)過程[1]。在冬季，植物的芽能以休眠的方式應對嚴酷的低溫脅迫，是其經(jīng)過長期演變而獲得的一種環(huán)境適應能力[2]。多年生草本植物主要以地下芽休眠的方式進行越冬[3]。草本植物的越冬芽在休眠發(fā)生時，通常會表現(xiàn)出芽端分生組織生長分化停止、芽內(nèi)部物質(zhì)(如碳水化合物、脂類、蛋白質(zhì))代謝減慢等一系列生理特性的變化[2]。為適應特定的氣候條件，一些植物的越冬芽還會形成特征各異的組織結(jié)構(gòu)與生長節(jié)律。例如，茭白(Zizania latifolia)冬芽在越冬期間會形成特殊的維管結(jié)構(gòu)，其芽生長錐和幼葉細胞分裂活動減弱，代謝活動減緩，同時細胞內(nèi)的淀粉顆粒開始積累增多[4]。芍藥(Paeonia lactiflora)的地下芽在越冬前(秋季)能快速發(fā)育，并完成其營養(yǎng)生長期；在臨近土壤封凍時，地下芽進入休眠狀態(tài)，隨之芽內(nèi)的可溶性糖含量開始增加[5-7]。目前，有關(guān)多年生草本植物地下芽休眠的研究主要集中在人工栽培植物，關(guān)于青藏高原高寒草地多年生野生草本植物地下芽休眠特性的研究鮮有報道。

矩鐮莢苜蓿(Medicago archiducis-nicolai)，又稱青藏扁蓿豆，是豆科苜蓿屬多年生野生優(yōu)質(zhì)牧草，分布于我國西部高寒地區(qū)，其自然生境多處于冬季少雪或無雪覆蓋的極端寒冷區(qū)域，耐寒性極強[8-10]。研究表明，矩鐮莢苜蓿在每年8 月 - 9 月會形成許多地下越冬芽，這些芽能在極端的低溫條件下安全越冬，對寒冷脅迫具有極強的耐受性[9,11]。目前，關(guān)于矩鐮莢苜蓿的研究主要涉及地理分布、栽培技術(shù)[12-13]，營養(yǎng)價值的評價[14]、遺傳多樣性評價[9-10]等方面，對地下芽在自然越冬過程中的組織化學特征與分化及休眠的研究尚未見報道。本研究采用石蠟切片方法，通過組織化學染色，跟蹤觀測了矩鐮莢苜蓿自然越冬過程中地下芽的組織結(jié)構(gòu)與生長變化特征，以期為理解該植物的耐寒越冬機理提供基礎(chǔ)依據(jù)。本研究擬回答兩個問題：1)矩鐮莢苜蓿越冬期地下芽的組織化學特征和芽尖分化特征會發(fā)生哪些變化？2)越冬前后地下芽的休眠態(tài)是如何轉(zhuǎn)變的？

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究材料為青藏高原東緣自然種群中隨機采集的單株個體(芽)，采樣地點位于天?？h甘肅農(nóng)業(yè)大學高山草原試驗站禁牧草地，該地區(qū)海拔2 071 m，年均溫-8～14 ℃，土壤類型為亞高山草甸土，氣候類型為大陸性高原季風氣候、大陸性半干旱氣候。

1.2 試驗方法

試驗在2018 年9 月至2019 年5 月進行，根據(jù)試驗地日均氣溫的變化規(guī)律(圖1)，參考Pearce[15]、Taylor 等[16]對植物低溫脅迫的劃分方法，將矩鐮莢苜蓿越冬過程分為4 個時期：秋末冷適應期(coldadaptation stage in late autumn, CA，日均氣溫在5 ℃以上)；初冬冷脅迫期(cold stress stage in early winter,CS，日均氣溫0～5 ℃)；隆冬凍脅迫期(freezing-stress stage in mid-winter, FS，日均氣溫降至0 ℃以下)；返青期(spring growth stage, SS，日均氣溫回升至5 ℃以上)。根據(jù)試驗期試驗地日平均氣溫的變化，4 個時期共設(shè)8 次取樣。由于低溫脅迫期(冷脅迫期和凍脅迫期)是植物休眠態(tài)轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵期[17-18]，為了揭示矩鐮莢苜蓿越冬芽休眠態(tài)的轉(zhuǎn)變規(guī)律，在初冬冷脅迫期設(shè)兩次取樣(2018 年10 月27 日、2018 年11 月10 日)，在隆冬凍脅迫期設(shè)4 次取樣(2018 年11 月24 日、2018 年12 月26 日、2019 年1 月12 日、2019 年3 月24 日)，在秋末冷適應期和返青期各設(shè)1 次取樣，分別是2018 年9 月8 日和2019 年5 月5 日。

圖1 試驗期內(nèi)(2018 年9 月至2019 年5 月)日最高溫、日最低溫Figure 1 Daily maximum temperature, daily minimum temperature (September 8, 2018, to the solstice on May 5, 2019)

在每個時期取樣時，用鐵鍬、鋤頭挖取試驗材料，迅速清洗干凈，并用剪刀隨機剪取生長健康、長勢一致的地下芽10 個，并采集切取頂端長約5 mm片段，立刻用FAA 固定液(70%乙醇 : 冰乙酸 : 甲醛 =18 : 1 : 1)固定，帶回實驗室4 ℃保存，以備后期石蠟切片。

石蠟切片采用常規(guī)法[19]，厚度8 μm。淀粉和蛋白質(zhì)染色用高碘酸 - 錫夫反應法(Periodic acid -Schiff reaction, PAS)[20]，淀粉在堿性品紅染色下呈玫紅色，蛋白質(zhì)在萘酚黃染色下呈黃色。用Motic 生物顯微鏡(型號：Panthera U)觀察地下芽各組織結(jié)構(gòu)以及淀粉粒和蛋白質(zhì)分布情況，拍照。淀粉顆粒的觀察，每次取3 個視野，每個視野5 個細胞。不同時期地下芽頂端生長錐、芽尖、芽體的高度和寬度值，采用Motic 生物顯微鏡自帶測量工具測量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 20.0 軟件對所測數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，用平均值 ± 標準誤表示測定結(jié)果，用最小極差法(LSD)進行差異顯著性分析。并采用Sigmaplot 10.0和Office Excel 2013 制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 矩鐮莢苜蓿地下芽結(jié)構(gòu)組成

根據(jù)地下芽解剖結(jié)構(gòu)(圖2)，把芽最頂端長為1～2 mm 的區(qū)段劃分為芽尖和芽體兩個功能區(qū)。芽尖是分生分化區(qū)，由生長錐(分生區(qū))和芽尖基層組織(分化區(qū))組成。在芽尖基層組織內(nèi)部看不到形成層，外部分化有2～3 個葉原基，沒有腋芽原基。芽體是伸長區(qū)，從第一個腋芽原基分化節(jié)開始到第一個伸長節(jié)，在這一功能區(qū)段，內(nèi)部組織已經(jīng)分化，可以明顯看到皮層、髓與形成層等維管組織；葉原基分化為幼葉，伸長至芽尖頂端，頂部向內(nèi)收攏；節(jié)間伸長，腋芽原基分化為腋芽。比較不同越冬期芽組織后發(fā)現(xiàn)，在冬季，生長錐、芽尖和芽體的高、寬均發(fā)生了變化(圖3、圖4)。

圖2 矩鐮莢苜蓿地下芽解剖結(jié)構(gòu)(縱切)Figure 2 Anatomical structures of the belowground buds of Medicago archiducis-nicolai (longitudinal sections)

圖3 矩鐮莢苜蓿地下芽細胞內(nèi)淀粉粒和蛋白質(zhì)的分布Figure 3 The distribution of starch and protein in cells of the belowground buds of Medicago archiducis-nicolai

圖4 越冬期矩鐮莢苜蓿地下芽芽端組織生長變化Figure 4 Development of the terminal tissues of belowground buds of Medicago archiducis-nicolai during overwintering

2.2 矩鐮莢苜蓿地下芽組織內(nèi)淀粉粒和蛋白質(zhì)的分布及數(shù)量變化

越冬期間，矩鐮莢苜蓿芽尖、芽體細胞內(nèi)淀粉粒和蛋白質(zhì)分布發(fā)生變化(圖3、圖5)。淀粉粒主要分布在芽尖基層組織、芽尖葉原基底部、芽尖外圍幼葉、芽體髓部和芽體皮層等部位。蛋白質(zhì)主要分布在芽尖生長錐、芽尖葉原基和芽形成層等部位。冷適應期和冷脅迫期，隨日均氣溫的降低，矩鐮莢苜蓿地下芽組織細胞內(nèi)的淀粉粒和蛋白質(zhì)均逐漸減少。不同的是，淀粉粒集中排列在薄壁組織細胞中心，而蛋白質(zhì)的排列沒有明顯的規(guī)律(圖3A-C)。凍脅迫期，隨日均氣溫的降低，淀粉粒幾乎消失殆盡，隨后不再隨氣溫的降低而變化，零散出現(xiàn)在組織細胞中，該時期蛋白質(zhì)的積累極少(圖3D-G)。返青期，隨日均氣溫的逐漸回升，淀粉粒開始逐漸增多。相較于冷適應期和冷脅迫期，其排列不集中。該時期蛋白質(zhì)的含量變化不顯著(P＞ 0.05) (圖3H)。

矩鐮莢苜蓿地下芽在越冬過程中，淀粉粒的數(shù)量在凍脅迫期較其他時期低。在越冬期的某一特定時期，地下芽不同組織部位儲存淀粉粒的數(shù)量存在差異。同一時期，芽尖基層組織淀粉粒較其他組織細胞內(nèi)少，芽體髓部和皮層(圖3a - h)居多，芽尖葉原基細胞內(nèi)淀粉粒始終少于芽尖外圍幼葉細胞內(nèi)淀粉粒(圖5)。不同組織部位細胞內(nèi)淀粉粒數(shù)量在越冬期的變化趨勢是一致的。冷適應期、冷脅迫期和凍脅迫前期，組織內(nèi)淀粉粒數(shù)量顯著降低(P＜0.05)；凍脅迫中期，淀粉粒數(shù)量變化平緩；凍脅迫后期和返青期，淀粉粒數(shù)量開始緩慢增加。冷適應期，蛋白質(zhì)的含量較高，越冬其他時期的蛋白質(zhì)含量變化不明顯。

圖5 越冬期矩鐮莢苜蓿地下芽細胞內(nèi)淀粉粒數(shù)量的變化Figure 5 Variation in the number of starch grains in cells of the belowground buds of Medicago archiducis-nicolai during overwintering

2.3 矩鐮莢苜蓿地下芽芽端組織分化特征

矩鐮莢苜蓿地下芽在越冬期的生長發(fā)生變化(圖4)。冷適應期，隨日均氣溫降低，芽尖和芽體的伸長和增粗顯著增加(P＜ 0.05)。然而，生長錐的伸長和增粗變化不明顯。冷脅迫期，隨日均氣溫的降低，生長錐和芽體的增粗變化不顯著(P ＞0.05)。凍脅迫期，日均氣溫降到最低并保持穩(wěn)定狀態(tài)，生長錐、芽尖的伸長和增粗以及芽體的增粗變化平緩，只有芽體的伸長顯著增加(P＜ 0.05)。返青期，隨日均氣溫的回升，地下芽各部位的增粗和伸長開始緩慢增加。

矩鐮莢苜蓿地下芽在越冬前后，芽體部位會形成腋芽或腋芽原基。越冬不同時期，腋芽和腋芽原基的發(fā)育進度不同(圖6)。冷適應期和冷脅迫期，芽體部位形成腋芽，且腋芽已分化出芽尖生長錐和葉原基(圖6A-C)。凍脅迫前期和中期，在芽體部位分化出腋芽原基(圖6D-F)，但腋芽原基未進一步分化出芽尖生長錐和葉原基。凍脅迫后期和返青期，芽體部位又逐漸恢復分化生長，形成了腋芽并分化出葉原基(圖6G、H)。

圖6 越冬期矩鐮莢苜蓿地下芽芽體部位腋芽原基的發(fā)育變化Figure 6 Developmental changes in the axillary primordia of the belowground buds of Medicago archiducis-nicolai during overwintering

3 討論

3.1 矩鐮莢苜蓿越冬期地下芽組織化學特征變化

淀粉是植物體內(nèi)碳水化合物貯藏的主要形式，主要存在于植物的種子和根莖中。研究表明，淀粉的積累貯藏是植物越冬的先決條件。植物可通過淀粉的水解，增加細胞內(nèi)的可溶性糖含量，以此提高細胞液濃度，降低植物細胞的冰點，從而提高其抗寒力[21-22]。本研究結(jié)果顯示，矩鐮莢苜蓿地下芽在秋末冷適應期，隨氣溫的下降，其淀粉粒數(shù)量顯著降低，在隆冬時期芽內(nèi)的淀粉粒幾乎消失；在返青期，芽內(nèi)的淀粉粒又開始緩慢積累。這與前人研究結(jié)果相類似，例如，劉芳等[23]對百合(Lilium pumilum)鱗莖花芽分化的研究發(fā)現(xiàn)，在溫度較高時，百合鱗莖中淀粉含量較高且變化平緩，隨著溫度的降低，百合鱗莖中淀粉含量急速下降。同樣，Nagao 等[24]對小立碗蘚(Physcomitrella patens)的研究發(fā)現(xiàn)，該植物隨低溫脅迫，其原絲體細胞內(nèi)的淀粉含量也呈現(xiàn)出降低趨勢。研究表明，受低溫誘導后，植物體內(nèi)淀粉含量的水解與淀粉酶活性的提高密切相關(guān)，因為溫度降低能激活植物體內(nèi)的淀粉酶活性，從而加快了淀粉水解成葡萄糖的速率；反過來，糖的增加可以提高細胞液濃度，從而降低植物組織結(jié)冰的冰點，以此抵御寒冷環(huán)境的脅迫[23,25]。

可溶性蛋白質(zhì)是植物體內(nèi)另一種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，能在逆境下大量積累，以此提高細胞濃度、增強細胞保水能力，從而提高植物的抗逆性[26]。例如，王穎等[27]對彩葉芋(Caladium bicolor)葉片以及魏娜等[28]對宿根花卉根系低溫脅迫的研究均表明，隨著溫度降低，這些植物體中均會積累大量的可溶性蛋白質(zhì)。本研究中，矩鐮莢苜蓿在秋末冷適應期，其地下芽內(nèi)積累了較多蛋白質(zhì)，但是，在整個越冬期芽內(nèi)的蛋白質(zhì)含量無明顯變化；也就是說，該植物的地下芽在越冬期并未通過改變可溶性蛋白質(zhì)含量應對低溫脅迫。同樣，在擬南芥(Arabidopsis thaliana)和樟子松(Pinus sylvestris)幼苗中也發(fā)現(xiàn)，可溶性蛋白質(zhì)的含量不會因為低溫脅迫而發(fā)生顯著的變化[29-30]。有研究認為，在低溫脅迫下，植物體內(nèi)的蛋白質(zhì)可能參與了多個代謝過程，從而導致其積累少、含量相對較低[31]。由此可見，不同植物在應對低溫脅迫時，其蛋白質(zhì)代謝響應機制不盡相同。

3.2 矩鐮莢苜蓿越冬期地下芽休眠態(tài)的變化

休眠是指植物外表停止生長，而體內(nèi)仍然進行著最低限度的生理代謝活動的現(xiàn)象[32]。Rohde 和Bhalerao[33]從植物組織發(fā)育的角度認為，休眠是植物在不良環(huán)境或季節(jié)來臨之時，其分生組織結(jié)構(gòu)極度減緩或者暫時停止的一種狀態(tài)，以此適應惡劣的外界環(huán)境。根據(jù)Rohde 和Bhalerao[33]的觀點，研究者可通過越冬期跟蹤觀測芽內(nèi)分生組織的生長變化判斷出植物的休眠狀態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn)，矩鐮莢苜蓿地下芽的生長錐、芽尖、芽體以及芽體腋芽的生長分化在越冬前后發(fā)生明顯變化。在秋末冷適應期，地下芽的伸長和增粗顯著增加，芽體部位腋芽分化程度高；冷脅迫期，地下芽的伸長和增粗顯著減小，芽體部位腋芽分化程度高；凍脅迫期，地下芽增粗和伸長變化平緩，地下芽生長幾乎停滯，芽體部位只分化出腋芽原基；返青期，地下芽增粗和伸長顯著增加，地下芽又開始生長，芽體部位又分化出了腋芽。綜合分析表明，矩鐮莢苜蓿地下芽在越冬前后，共經(jīng)歷了快速生長期(10 月下旬之前)、休眠進入期(11 月)、休眠保持期(12 月至1 月中旬)、休眠解除期(1 月 - 4 月) 4 個階段，從休眠進入到休眠解除長達6 個月。另外，有研究表明，植物休眠的起始與體內(nèi)淀粉含量的變化密切相關(guān)[34-35]。本研究中，有關(guān)矩鐮莢苜蓿地下芽內(nèi)淀粉含量在不同時期的變化結(jié)果也支持了該觀點。矩鐮莢苜蓿芽組織細胞內(nèi)的淀粉含量在越冬前快速生長期處于較高水平，進入休眠后隨休眠態(tài)的轉(zhuǎn)變，淀粉含量顯著下降，在休眠保持期接近于零，隨休眠解除，淀粉粒數(shù)量又開始逐漸積累上升。趙長山等[36]對苣荬菜(Sonchus brachyotus)芽根休眠過程的研究也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果。一方面，如前面所討論，越冬期間地下芽內(nèi)淀粉含量的這種變化可能與細胞調(diào)節(jié)滲透壓、降低組織冰點以抵御低溫脅迫有關(guān)；另一方面，芽休眠發(fā)生后，淀粉能通過水解過程為休眠解除提供物質(zhì)基礎(chǔ)和能量需要[37-38]。由此表明，高寒草地矩鐮莢苜蓿地下芽在越冬期間能通過進入休眠狀態(tài)抵御低溫脅迫，同時通過水解芽內(nèi)淀粉以滿足其維持生命的物質(zhì)和能量需要。

4 結(jié)論

矩鐮莢苜蓿在越冬前地下芽基本組織內(nèi)會積累大量淀粉，芽生長快速；進入冬季，芽尖分化與伸長生長開始減慢，隨低溫脅迫，地下芽內(nèi)儲存的淀粉?？焖俳到?，芽生長停止；翌年返青期(5 月)，芽開始恢復生長。矩鐮莢苜蓿越冬期間地下芽生長停滯和芽內(nèi)淀粉含量降低是其休眠態(tài)轉(zhuǎn)變的重要標志，休眠芽通過淀粉粒水解代謝，增加細胞可溶性糖濃度、降低細胞冰點是其抵御冬季低溫脅迫的適應機制。