升角丸水提液對(duì)痤瘡丙酸桿菌體外抑菌作用的實(shí)驗(yàn)研究

何俊輝 伏雨思 蒲文華 劉湘渝 肖銳華

摘要：目的 研究升角丸水提液對(duì)痤瘡丙酸桿菌（ Propionibacterium acnes，P. acnes）的體外抑菌作用。方法 采用肉湯稀釋法測(cè)算升角丸水提液對(duì)痤瘡丙酸桿菌的最低抑菌濃度 （MIC），實(shí)驗(yàn)組升角丸水提液，陽(yáng)性對(duì)照組乳糖酸紅霉素溶液，陰性對(duì)照組生理鹽水。結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組 ，在實(shí)1-實(shí)2血平板上血平板均未見菌落，自實(shí)3血平板起可見菌落生成，故其MIC為201mg/ml;陽(yáng)性對(duì)照組 MIC結(jié)果，在陽(yáng)1-陽(yáng)3血平板均未見菌落，自陽(yáng)4血平板起可見典型菌落，故其 MIC為12.6μg/ml;陰性對(duì)照組 MIC 結(jié)果，在陰1血平板即有典型菌落生成。結(jié)論 應(yīng)用升角丸水提液對(duì)痤瘡丙酸桿菌的體外抑菌作用顯著，值得臨床研究推廣。

關(guān)鍵詞：升角丸水提液;痤瘡丙酸桿菌;痤瘡

痤瘡是一種常見的慢性炎癥性皮膚病，多好發(fā)于面頰部、額部以及下頜部，臨床表現(xiàn)為粉刺、結(jié)節(jié)、囊腫、丘疹、膿皰以及瘢痕等，并多見于青少年，其發(fā)病率高達(dá) 70%～87%（俗稱青春痘）[1]。升角丸是由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)依據(jù)古方犀角升麻丸配伍生產(chǎn)，醫(yī)宗金鑒有言：“宜常服犀角升麻丸，并治一切粉刺、酒刺等證”，現(xiàn)升麻丸已用于痤瘡臨床治療中，并取得了較好療效，本文利用痤瘡丙酸桿菌的體外抑菌試驗(yàn)進(jìn)行觀察與分析，探究升角丸水提液對(duì)痤瘡丙酸桿菌的抑制作用，并為臨床運(yùn)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑 實(shí)驗(yàn)菌株：痤瘡丙酸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株 ;受試藥液：升角丸水提液、乳糖酸紅霉素、滅菌生理鹽水。將升角丸水提液作為實(shí)驗(yàn)組 ， 并以乳糖酸紅霉素溶液作為陽(yáng)性對(duì)照組 ， 以生理鹽水作為陰性對(duì)照組。

1. 2 升角丸水提液的制備 稱取 20 g 升角丸（藥物組成：水牛角、升麻、羌活、防風(fēng)、白附子、白芷、生地黃、川芎、紅花、黃芩、生甘草、玄參等），加入 250 mL 超純水，浸泡 25 min 后，超聲振蕩，75℃提取 1 h，過濾;在濾渣中加入 250 mL超純水，再于相同的條件下振蕩提取 1 h，過濾;合并濾液，離心 20 min（255

000 r·min-1），取上清液濃縮至 20 mL（相當(dāng)于原藥物 1 g·mL-1），置于 4℃冰箱中保存，并在 12 h 內(nèi)使用完畢。

1. 3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1液體培養(yǎng)基的制備：選用改良GAM 肉湯粉 60 mg 以及 1000 ml 蒸餾水于錐形瓶?jī)?nèi)， 加熱溶解滅菌， 降溫至50 ℃后再加入無(wú)菌脫纖維羊血 50 ml，搖勻，封口，制成液體培養(yǎng)基。

1.3.2痤瘡丙酸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株菌懸液的制備：將痤瘡丙酸桿菌菌種接種于血瓊脂平板， 放入?yún)捬跖囵B(yǎng)箱，再放入恒溫細(xì)菌培養(yǎng)箱，37°C厭氧培養(yǎng)48h， 取后再將細(xì)菌培養(yǎng)物制作成細(xì)菌涂片 ， 予以革蘭染色法 ， 并在鏡下觀察細(xì)菌的基本形態(tài) ，一般為呈 X狀、Y狀、或柵欄狀，無(wú)莢膜，無(wú)鞭毛的革蘭陽(yáng)性桿菌 ，即為痤瘡丙酸桿菌。再用一次性接種環(huán)挑取血平板上菌落 ， 同時(shí)轉(zhuǎn)種于兩個(gè)血瓊脂平板上 ， 將其中一個(gè)血平板置于厭氧培養(yǎng)箱，再放入恒溫細(xì)菌培養(yǎng)箱， 37°C厭氧培養(yǎng)48h標(biāo)記為 1 號(hào) ， 培養(yǎng)后可見典型菌落 ， 另外一直接放置于恒溫細(xì)菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)37°C培養(yǎng) 48 h 標(biāo)記為 2 號(hào) ， 培養(yǎng)后未見菌落產(chǎn)生。挑取1號(hào)血瓊脂平板上的典型菌落，以蒸餾水稀釋，用麥?zhǔn)媳葷嵊?jì)調(diào)整為0.5個(gè)麥?zhǔn)蠞岫葐挝唬∕CF），其細(xì)菌數(shù)約1.5* 108cfu/ml，備用 。

1.3.3抑菌實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)組：取6支實(shí)驗(yàn)滅菌試管，編號(hào)為實(shí)1-實(shí)6，分別加入不同濃度的升角丸水提液1ml;陽(yáng)性對(duì)照組：取6支實(shí)驗(yàn)滅菌試管，編號(hào)為陽(yáng)1-陽(yáng)6，分別加入不同濃度的乳糖酸紅霉素溶液1ml;陰性對(duì)照組：取1支滅菌試管，編號(hào)為陰1 ，加入生理鹽水1ml，待所有試管滅菌后 ， 再分別于每支試管中加入液體培養(yǎng)基 1 ml，采用移液槍，分別吸取新鮮配置的痤瘡丙酸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株菌懸液100ul分別加入實(shí)驗(yàn)組、陽(yáng)性對(duì)照組各組的1-6試管以及陰性對(duì)照組陰1試管中，均勻振蕩，再將試管置于37°C恒溫厭氧培養(yǎng)箱培養(yǎng) 48 h， 各組試管培養(yǎng)結(jié)束后，取13個(gè)血平板，進(jìn)行編號(hào)方法同試管，再采用平板澆筑法，分別吸取各組試管內(nèi)混懸液lml接種于相同編號(hào)的血瓊脂平板上，放置于37°C 恒溫厭氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h，觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，分別記錄結(jié)果。

1. 4 觀察指標(biāo) 觀察各組受試液對(duì)痤瘡丙酸桿菌的抑菌效果。若血平板未見菌落生成 ， 則表明該濃度的藥液能夠抑制細(xì)菌生長(zhǎng);若平板上可見菌落生成， 則表明該濃度的藥液不能抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，能夠抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度即為該藥物MIC。

2 結(jié)果

2.1實(shí)驗(yàn)組MIC結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組實(shí)1-實(shí)2血平板上均未見菌落 ， 自實(shí)3血平板起可見菌落生成 ， 故其 MIC 為 201mg/ml。結(jié)果見表1。

2.2 陽(yáng)性對(duì)照組MIC結(jié)果 陽(yáng)性對(duì)照組陽(yáng)1-陽(yáng)3血平板上均未見菌落 ， 自陽(yáng)4血平板起可見菌落生成 ， 故其 MIC 為 12.6mg/ml。結(jié)果見表2。

2. 3 陰性對(duì)照組 MIC 結(jié)果 陰性對(duì)照組在陰1血平板即有典型菌落生成。

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為痤瘡是內(nèi)熱偏盛，又外受風(fēng)邪或脾氣不足，濕濁化熱所致，《素問生氣通天論》曰 ：“膏粱之人，內(nèi)臟滯熱。痤......皆肺氣內(nèi)郁所為”“汗出見濕，乃生痤癡 ”具體可分為肺經(jīng)風(fēng)熱、肺經(jīng)血熱、胃腸濕熱、毒熱蘊(yùn)結(jié)、血瘀痰凝、腎陰不足、心火上炎、沖任失調(diào)等，?中醫(yī)常用清肺胃濕熱、涼血解毒的方藥治療[2]。現(xiàn)代青年不良飲食起居習(xí)慣也是導(dǎo)致痤瘡出現(xiàn)的原因，常食用辛辣油膩食物易生痤瘡，經(jīng)常飲酒抽煙，常坐在電腦手機(jī)前也比較易患痤瘡。痤瘡和皮膚的性質(zhì)也有一定的關(guān)系，中性皮膚和偏油性的皮膚患痤瘡的較多。女性化妝品不當(dāng)使用，也易患上痤瘡。

痤瘡丙酸桿菌是一種桿棒狀或略彎曲、無(wú)莢膜，無(wú)鞭毛、革蘭氏染色陽(yáng)性的厭氧菌，其主要寄居于皮膚、皮膚腺、腸道、生殖泌尿道，是一種機(jī)會(huì)性病原體，痤瘡丙酸桿菌（P.acne）局部異常繁殖是痤瘡四大經(jīng)典發(fā)病機(jī)制之一[3]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，P.acne可通過多個(gè)途徑影響到痤瘡的發(fā)病?；畹腜.acne可通過以下3個(gè)方面影響?zhàn)畀彽陌l(fā)?。孩僬T導(dǎo)炎癥的形成，P.acne一方面可通過激活Toll樣受體（TLR）-2/4、上調(diào)抗菌肽（AMPs）表達(dá)、誘導(dǎo)蛋白酶激活受體（PAR）和MMPs表達(dá)以及促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、皮脂腺分泌炎癥因子等途徑激活天然免疫，另一方面通過誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞活化和產(chǎn)生高滴度的抗P.acne激活細(xì)胞和體液免疫，共同促進(jìn)炎癥的形成;②激活皮脂腺功能，P.acne可以直接作用于皮脂腺細(xì)胞，促進(jìn)皮脂分泌增加及胰島素生長(zhǎng)因子及其受體的表達(dá)，激活皮脂腺功能;③促進(jìn)毛囊口角化，P.acne可通過誘導(dǎo)絲聚蛋白、角蛋白1、角蛋白10和角蛋白17等表達(dá)，增強(qiáng)角質(zhì)形成細(xì)胞角化，促進(jìn)毛囊口角化。因此，P.acne在痤瘡發(fā)病中作用不僅重要而且涉及到痤瘡發(fā)病的多個(gè)環(huán)節(jié)，所以有效殺滅抑制 P.acne 是控制痤瘡發(fā)病的重要手段之一。

升角丸是由水牛角、升麻、羌活、防風(fēng)、附子、白芷、生地黃、川芎、紅花、黃苓、玄參、生甘草等藥物，蜜調(diào)為丸。方中重用水牛角，與升麻共為君藥，同起清熱涼血解毒之功效[4]。生地黃、玄參清熱養(yǎng)陰、黃苓涼血解毒，白附子解毒排膿，四藥共為臣藥，能加強(qiáng)君藥清熱涼血解毒之功。羌活、防風(fēng)解表祛風(fēng)勝濕，白芷消腫排膿，紅花、川芎行氣活血祛瘀，五藥共為佐藥。甘草既能清熱解毒、又能調(diào)和藥性，是為佐使藥。綜觀全方，苦寒辛甘合用，于大量苦寒藥中配伍少許辛甘藥，既防止苦寒傷中，又不失清熱涼血之功。諸藥合用，共奏清熱解毒、涼血祛風(fēng)、散瘀之功效。因此，升麻丸對(duì)痤瘡丙酸桿菌的體外抑菌作用非常顯著 ， 值得臨床研究推廣。

參考文獻(xiàn)：

[1]紀(jì)青，張佳賓，蔡宏為，等.中西醫(yī)結(jié)合治療680例尋常性痤瘡的治療體會(huì)[J].內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，32（04）：402-404.

[2]吳美玲，朱延濤.中醫(yī)藥治療痤瘡研究進(jìn)展[J].新中醫(yī)，2020，52（12）：13-15.

[3]許德田，劉瑋.痤瘡丙酸桿菌和痤瘡：進(jìn)展與悖論[J].臨床皮膚科雜志，2016，45（03）：234-237.

[4]綦雪巍. 升角丸治療尋常型痤瘡（肺經(jīng)血熱證）的臨床觀察[D].黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，2012.

項(xiàng)目基金：長(zhǎng)沙醫(yī)學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目：長(zhǎng)醫(yī)教[2021]47號(hào)-109

第一作者：何俊輝（2000.6-），男，本科，針灸推拿學(xué)

*通訊作者：肖銳華（1994.5-），女，本科，助教、針灸推拿學(xué)專業(yè)方向