黃智慧 王慶敏 馬愛軍 郭曉麗

(1 中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點實驗室，山東省海洋漁業(yè)生物技術(shù)與遺傳育種重點實驗室，青島市海水魚類種子工程與生物技術(shù)重點實驗室，山東青島 266071； 2 青島海洋科學與技術(shù)試點國家實驗室海洋生物學與生物技術(shù)功能實驗室，山東青島 266071)

海洋纖毛蟲在微生物食物環(huán)中占據(jù)重要而又特殊的地位，也是引發(fā)赤潮和養(yǎng)殖動物病害的常見種，從而成為人們?nèi)找骊P(guān)注的對象。盾纖毛蟲隸屬于纖毛門(Ciliophora)、寡膜綱(Oligohymenophorea)、盾纖目(Scuticociliatida)[1]。該類纖毛蟲通常自由生活在海水中，但在一些情況下，如魚體受傷、環(huán)境惡化等，可引起海水養(yǎng)殖動物感染，纖毛蟲表現(xiàn)為寄生性，以宿主細胞或組織為食，并在其組織中生長、繁殖，導致養(yǎng)殖動物大量死亡[2]。目前已有報道，海洋尾絲蟲(Uronemamarinum)、水滴偽康纖蟲(Pseudocohnilembuspersalinus)和貪食邁阿密蟲(Miamiensisavidus)等能夠引起大菱鲆(Scophthalmusmaximus)[3-4]、鱸魚(Dicentrarchuslabrax)[5]、比目魚(Paralichthysolivaceus)[6]、海龍(Phyllopteryxtaeniolatus)[7]、虹鱒(Oncorhynchusmykiss)[8]、藍鰭金槍魚(Thunnusmaccoyii)[9]等海洋魚類發(fā)病[10]。近年來，有關(guān)海洋纖毛蟲分離培養(yǎng)的研究僅限于不同培養(yǎng)液對其種群增長的影響，而對寄生性的纖毛蟲在不同培養(yǎng)液中的毒理學實驗數(shù)據(jù)報道較少。本研究從山東煙臺地區(qū)患病大菱鲆的體表分離出貪食邁阿密蟲，挑取單個蟲體進行純化培養(yǎng)，并篩選了4種盾纖毛蟲常用的體外培養(yǎng)液，研究了不同培養(yǎng)基對其種群生長及復壯毒力的影響。

1 材料和方法

1.1 盾纖毛蟲的分離與純化培養(yǎng)

2018年10月，從山東省煙臺市某大菱鲆養(yǎng)殖場收集被盾纖毛蟲感染的大菱鲆(體長約15 cm)，刮取病魚體表的潰爛組織，鏡檢發(fā)現(xiàn)有大量的盾纖類纖毛蟲，經(jīng)鑒定為貪食邁阿密蟲(Miamiensisavidus)。在實驗室進行蟲體分離。步驟為：剪取魚體部分病灶組織，剪碎，加入50 mL離心管中，置于18～20 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24～36 h。吸取纖毛蟲培養(yǎng)液，滴入裝有濾紙的漏斗進行過濾，反向滴洗濾紙，獲得10 mL蟲體收集液，經(jīng)在顯微鏡下計數(shù)，其密度大于3×102個/mL。

1.2 4種培養(yǎng)液的制備

1.2.1 大腸桿菌培養(yǎng)液(DH)

取-80 ℃凍存的DH5α大腸桿菌100 μL作為細菌母液，于超凈工作臺中進行如下操作：在5個50 mL離心管中分別加入LB培養(yǎng)液，每管40 mL；用移液槍取25 μL細菌母液分至5個離心管中，將離心管放入37 ℃、200 r/min恒溫搖床中搖菌24 h。然后將在恒溫搖床中的LB液體培養(yǎng)基取出，放入離心機，以7 000 g離心10 min。于超凈工作臺中傾倒上清，加滅菌海水至10 mL，重懸大腸桿菌沉淀，再加海水至40 mL，放入離心機，以7 000 g離心10 min，反復沖洗2次。重懸大腸桿菌沉淀，再加海水至30 mL。于4 ℃冷藏備用。

1.2.2 牛肉浸膏培養(yǎng)液(BEV)

分別取牛肉浸膏10 g溶于100 mL人工海水中，配制成100 g/L牛肉浸膏培養(yǎng)液，靜置24 h后備用。

1.2.3 米粒培養(yǎng)液(RV)

每100 mL滅菌人工海水中加入30粒消毒米粒，即配制成米粒培養(yǎng)液(RV)。

1.2.4 改良L-15培養(yǎng)液(鹽度為10)(L-15)

配制640 mL的L-15(Leibovitz)培養(yǎng)液。分別添加腺苷(adenosine)、胞啶(cytidine)、尿苷(uridine)各90 mg，鳥苷(guanosine)150 mg，以及葡萄糖(glucose)5 g。添加250 mL脂質(zhì)液(從干粉蛋黃中溶解1.6 mg/mL卵磷脂，以純凈水溶解0.8 mg/mL Tween 80，制備脂質(zhì)液)。通過0.22 μm濾膜過濾。在無菌條件下，添加100 mL的10%胎牛血清FBS，添加前FBS應(yīng)在56 ℃下水浴30 min滅活。最后添加10 mL 100×抗真菌劑(antibiotic antimycotic solution)。調(diào)節(jié)pH到7.2，再用0.22 μm濾膜過濾。

1.3 不同培養(yǎng)液對貪食邁阿密蟲種群生長的影響

試驗在12孔細胞培養(yǎng)板中進行，每孔加入2 mL培養(yǎng)液，參考張立坤等[11]的步驟進行接種：將處于種群生長平衡期的蟲體分別接種至4種培養(yǎng)液中，在23 ℃條件下進行培養(yǎng)，每種培養(yǎng)液設(shè)3個平行試驗組。定時計數(shù)，取3次樣品的平均值。按以下公式[12]計算種群自然增長率。

lnNt=lnN0+rt，

(1)

式(1)中，Nt為經(jīng)過t時長后的種群密度(個/mL)；N0為種群初始密度(N0=1×102個/mL)；以時長為橫坐標，因變量是纖毛蟲密度的自然對數(shù)，其斜率即種群自然增長率r。

將試驗所得數(shù)據(jù)代入以上公式，可求出種群自然增長率r。

1.4 不同培養(yǎng)液對大菱鲆貪食邁阿密蟲復壯毒力的影響

選取健康大菱鲆幼魚[體質(zhì)量為(30.0±7.2)g]共計120尾進行攻毒試驗。將幼魚暫養(yǎng)7 d，饑餓3 d后開始試驗，試驗期間正常投喂。試驗水溫為(16±1)℃，鹽度為30，用氧氣泵連續(xù)充氧，水體溶解氧保持在7.3 mg/L以上。通過腹腔注射貪食邁阿密蟲，即注射不同培養(yǎng)液濃縮獲得的0.1 mL貪食邁阿密蟲PBS懸浮液(蟲的濃度為1×105個/mL)，參照Paramá等[13]的注射步驟進行操作。試驗時間共3周，其間記錄試驗魚首次出現(xiàn)感染的時間、死亡時間，統(tǒng)計死亡率等數(shù)據(jù)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理和分析。用Duncan’s檢驗法進行顯著性分析和多重比較，數(shù)據(jù)結(jié)果以“平均值±標準差”的形式表示，設(shè)P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 不同培養(yǎng)液對貪食邁阿密蟲種群增長曲線分析

試驗結(jié)果顯示，貪食邁阿密蟲在4種培養(yǎng)液中均可以生長，且在種群增長過程中均存在停滯期、指數(shù)期、穩(wěn)定期、衰退期4個時期，其生長情況見圖1所示。其中，BEV和L-15組較先達到密度高峰，DH和RV組則遲24 h才達到密度高峰。L-15組的種群密度最高，且穩(wěn)定期較長，衰退期較晚；RV組次之。由圖1可看出，各組種群增長曲線之間在不同時間點存在不同程度的差異。

圖1 貪食邁阿密蟲在4種培養(yǎng)液中的種群增長曲線

2.2 不同培養(yǎng)液對貪食邁阿密蟲的復壯毒力分析

在不同培養(yǎng)液條件下貪食邁阿密蟲感染大菱鲆的毒力分析見表1。結(jié)果顯示，在DH與RV兩種培養(yǎng)液中生長的貪食邁阿密蟲毒力較弱，其致死率分別為43.80%和49.30%，而BEV和L-15組毒力顯著高于其他2組(P<0.05)，其中L-15致死率最高，達85.10%。從感染時間來看，BEV和L-15組感染較早。4種培養(yǎng)基的首末尾感染歷時沒有顯著差異(P>0.05)。L-15首尾死亡時間最早，僅(6.00±0.66)d即死亡，其次為BEV、RV、DH，而4種培養(yǎng)基的首末尾死亡歷時沒有顯著差異(P>0.05)。因此可以判斷，L-15培養(yǎng)液最符合貪食邁阿密蟲的寄生環(huán)境，BEV次之。

表1 不同培養(yǎng)液下貪食邁阿密蟲感染大菱鲆的情況比較

3 討論

貪食邁阿密蟲屬于兼性或機會寄生種盾纖毛蟲，通常情況下營自由生活，在特定條件下可在養(yǎng)殖魚類體內(nèi)外營寄生生活，如在養(yǎng)殖魚類傷殘，養(yǎng)殖環(huán)境水溫、酸堿度等發(fā)生較大變化，魚體免疫力降低等情況下，纖毛蟲會直接危害魚體[14]。貪食邁阿密蟲對環(huán)境變化有很強的適應(yīng)力，且有較高的種群自然增長率，這是纖毛蟲病傳染迅速的原因。本研究從養(yǎng)殖場患病大菱鲆體表分離出盾纖毛蟲，經(jīng)初步鑒定為貪食邁阿密蟲，之后對其進行了實驗室培養(yǎng)，研究不同培養(yǎng)液對其毒力的影響。結(jié)果顯示，在培養(yǎng)液篩選試驗中，改良L-15組貪食邁阿密蟲種群密度最高，且穩(wěn)定期較長，衰退期較晚，因此判斷該培養(yǎng)液更適合于盾纖毛蟲的體外培養(yǎng)。本研究結(jié)果與高延奇等[10]的研究結(jié)果相似。推測其原因是L-15中含有無機鹽、氨基酸、維生素，而且氨基酸含量較高，高水平的氨基酸對體外培養(yǎng)纖毛蟲的生存和繁殖很重要。復壯后的毒力分析發(fā)現(xiàn)，L-15組培養(yǎng)的纖毛蟲死亡率最高，達到85.10%，而L-15組的感染時間較早，首尾魚死亡時間也最早，表明改良L-15組蟲體毒力更強。筆者推測，改良后的L-15中含有胎牛血清，這樣的環(huán)境條件模擬了盾纖毛蟲的寄生環(huán)境。這一結(jié)果與Paramá等[13]的研究結(jié)果相似。因此可以判斷，改良L-15培養(yǎng)液最符合貪食邁阿密蟲的寄生環(huán)境，BEV次之。

纖毛蟲病是我國大菱鲆、牙鲆養(yǎng)殖中普遍發(fā)生的1種疾病，而目前我國對海洋中有關(guān)致病性纖毛蟲原生動物個體及其實驗生態(tài)學的研究較薄弱，仍無特效防治方法[11]。在實驗室研究中，保持寄生蟲的種群自然增長率及寄生毒力是免疫診斷等試驗順利開展的前提，也是試驗數(shù)據(jù)科學準確的重要保障。本研究探討了實驗室常用的纖毛蟲培養(yǎng)液對纖毛蟲的生長及毒力的影響，為開展新型殺蟲物質(zhì)研究和開發(fā)增強魚體自身免疫力的抗蟲藥物提供了安全、高效的蟲體培養(yǎng)方案。