王梓祎，茍盼盼，楊金，馬明星，楊詩晨，李楠，仇雪梅

(大連海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧 大連 116023)

生長激素釋放激素(growth hormone-releasing hormone,GHRH)由下丘腦合成分泌[1]，廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)。生長激素釋放激素不僅具有調(diào)節(jié)生長激素的釋放和調(diào)節(jié)神經(jīng)的作用，而且能促進(jìn)動物的生長發(fā)育，參與免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)、細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖等生物學(xué)過程[2-4]。在GHRH基因研究中，有關(guān)SNP位點與生長性狀的關(guān)聯(lián)分析在畜牧中報道較多。張存芳[5]發(fā)現(xiàn)，GHRH基因中有3個位于非編碼區(qū)的SNP位點與南陽牛Nanyangcattle的體質(zhì)量、體斜長等生長性狀相關(guān)。Cheong等[6]在韓國本土牛GHRH基因中發(fā)現(xiàn)了1個與胴體相關(guān)的SNPs位點。水產(chǎn)動物GHRH基因的SNP位點與生長性狀的關(guān)聯(lián)分析也有少量報道，如Guo等[7]在點帶石斑魚Epinepheluscoioides的GHRH基因中篩選到2個與生長性狀相關(guān)的SNP位點。

單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)是指基因組中特定位置的單個核苷酸發(fā)生堿基突變引起的DNA序列的多態(tài)性[8-9]。SNP優(yōu)勢在于其一般只由兩種堿基構(gòu)成，因此，可快速、規(guī)?；剡M(jìn)行篩選[10-11]。目前，SNP在水產(chǎn)領(lǐng)域也有較多應(yīng)用，如構(gòu)建遺傳圖譜或關(guān)聯(lián)分析。相關(guān)研究中，張建勇[12]根據(jù)對中國對蝦Fenneropenaeuschinensis的高通量測序結(jié)果，設(shè)計了800組SNP引物，構(gòu)建了中國對蝦親本遺傳連鎖圖譜，其中，父本覆蓋率為 51.94%，母本覆蓋率為53.77%。樊佳佳等[13]在草魚Ctenopharyngodonidella檸檬酸合酶基因上篩選出2個SNPs位點，將其與草魚的6個生長性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果顯示，兩位點不同基因型在6個性狀的平均值上有差異但不顯著，又將其組成7種雙倍型，其中，D6屬生長優(yōu)勢雙倍型。

紅鰭東方鲀Takifugurubripes在分類學(xué)上隸屬于硬骨魚綱Osteichthyes鲀形目Tetraodontiformes鲀亞目 Tetraodontoidei鲀總科Tetraodntoidea鲀科 Tetraodontidae東方鲀屬Takifugu，在中國主要分布于東海、黃海，國外則主要分布于日本、韓國、朝鮮等沿海地區(qū)，屬暖水性海洋底棲魚類[14]。紅鰭東方鲀味道鮮、營養(yǎng)高、肉質(zhì)嫩，富含多種維生素，經(jīng)濟價值較高[15-16]，是中國北方重要的經(jīng)濟魚類之一。目前，國內(nèi)養(yǎng)殖紅鰭東方鲀一直源自日本紅鰭東方鲀及其后代，長期繁育有可能導(dǎo)致該魚生長緩慢、易患疾病，一定程度上影響了紅鰭東方鲀養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展[17-19]。因此，開展紅鰭東方鲀的選育研究，探索分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)勢在必行。本研究中，挑選紅鰭東方鲀與生長相關(guān)的GHRH基因作為候選基因，利用PCR直接測序技術(shù)篩選GHRH基因上的SNPs，分析SNPs與紅鰭東方鲀生長性狀的相關(guān)性，以期為紅鰭東方鲀分子標(biāo)記輔助育種提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用紅鰭東方鲀?yōu)楸狙芯繄F隊在河北省唐山市天正實業(yè)有限公司培育的紅鰭東方鲀?nèi)后w，從中隨機挑選219尾個體，分別于該群體6月齡及12月齡時，參照王新安等[20]的方法測量其體長(BL)、體高(BD)、頭長(HL)、尾柄長(CPL)、尾柄高(CPD)、尾柄寬(CPW)、眼間距(IS)、體寬(BW)、頭長+軀干長(HL+TR)和體質(zhì)量(BWH)共10個生長相關(guān)性狀，并取尾鰭用于提取基因組DNA。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計及合成 參考紅鰭東方鲀GHRH基因序列(GenBank登錄號：101063685)，利用Primer Premier 5.0軟件，針對GHRH基因的6個外顯子和5個內(nèi)含子，共設(shè)計4對引物，覆蓋了GHRH整段基因(表1)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.2 DNA提取及PCR擴增 按照天根海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒說明書，以尾鰭為材料提取基因組DNA，用15 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量。

PCR總反應(yīng)體系(共25 μL)：10×PCR buffer 2.5 μL，dNTP M Mixture 2 μL，上、下游引物各1 μL，DNA 0.5 μL，TaKaRa Taq 0.3 μL，用ddH2O補足至25 μL。

PCR反應(yīng)程序為：94 ℃下預(yù)變性30 min；94 ℃下循環(huán)變性1 min，退火復(fù)性30 s，72 ℃下延伸1 min，共進(jìn)行35個循環(huán)；最后在72 ℃下再延伸7 min，4 ℃下保存。退火溫度見表1。從紅鰭東方鲀樣本中隨機選取10尾魚的基因組用于PCR擴增，擴增后進(jìn)行PCR產(chǎn)物的分離純化，然后經(jīng)15 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序。

表1 紅鰭東方鲀GHRH基因的引物序列Tab.1 Primers of GHRH gene in tiger puffer Takifugu rubripes

1.2.3 SNP分型及統(tǒng)計分析 試驗結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±S.D.)表示，利用直接測序法對序列進(jìn)行分析，結(jié)合Chromas和DNAman 8軟件查看測序結(jié)果峰圖，查看已知位點的基因型，確定所需的SNP位點，并擴群測序、分型。利用SeqMan軟件對全部基因型進(jìn)行統(tǒng)計。用Excel 2019對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理。采用 SPSS 22 軟件一般線性模型中的多元方差分析模塊進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，因變量為形態(tài)性狀，自變量為篩選到的SNPs位點的不同基因型，顯著相關(guān)性水平設(shè)為0.05，極顯著相關(guān)性水平設(shè)為0.01。

連鎖不平衡是給定群體中不同位點等位基因的非隨機關(guān)聯(lián)現(xiàn)象[24]，利用Hapioview 4.1軟件，對篩選出的GHRH基因SNPs位點進(jìn)行連鎖不平衡分析，結(jié)果由r2和D′表示，其中r2表示重組和突變的程度，D′表示重組程度。當(dāng)D′>0.8且r2>0.33時，兩位點為完全連鎖狀態(tài)，此時兩個位點將作為一個整體進(jìn)行遺傳，若只滿足一個條件，則為連鎖狀態(tài)[25]。用Excel 2019的TTEST、AVERAGE和STDEV.P公式進(jìn)行雙倍型分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 GHRH基因的PCR擴增結(jié)果

將設(shè)計好的4對引物均進(jìn)行PCR試驗，擴增目的片段，用15 g/L瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，PCR條帶單一，特異性好，無雜帶，將4對引物的PCR產(chǎn)物片段純化回收后送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序。

2.2 GHRH基因序列的SNP位點獲得和分析

通過PCR測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在GHRH基因的4對引物中，除G2引物外其余3對引物中均檢測出SNP位點。因此，將G1、G3和G4共3對引物分別進(jìn)行PCR批量擴增,將PCR產(chǎn)物直接測序，對篩選出的SNP位點進(jìn)行分型，采用Chromas軟件查看結(jié)果，如圖1所示，測序結(jié)果用DNAman 8軟件進(jìn)行比對，共發(fā)現(xiàn)7個SNPs位點。將起始密碼子ATG的A堿基命名為1，7個SNPs位點分別為C81T、G315C(外顯子)、C1083T(外顯子)、A1524G(外顯子)、G2107A、T2125C和G2256A。

圖中黑色方框代表突變位置。The black box in the figure represents the location of the mutation.圖1 紅鰭東方鲀GHRH基因7個SNPs位點基因型Fig.1 Seven SNPs locus genotypes in GHRH gene of tiger puffer Takifugu rubripes

對3個處于外顯子上的SNPs進(jìn)行突變分析，發(fā)現(xiàn)只有C1083T和A1524G兩位點突變引起氨基酸的變異，屬于錯義突變，其中，C1083T中由ATG(M)變?yōu)锳CG(T)，A1524G中GTC(V)變?yōu)锳TC(I)；而G315C位點無氨基酸的變化，屬于同義突變(圖2)。

圖2 GHRH基因3個外顯子SNPs氨基酸變化Fig.2 Amino acid changes in SNPs of 3 exons of GHRH gene

2.3 GHRH基因SNPs位點與生長性狀關(guān)聯(lián)分析

各SNPs位點與生長性狀相關(guān)性結(jié)果見表2、表3。從表2可見：在6月齡紅鰭東方鲀?nèi)后w中，C81T、G315C和A1524G位點與大多數(shù)生長性狀的關(guān)聯(lián)性均呈顯著狀態(tài)，而G2107A、T2125C和G2256A位點僅與頭長和眼間距兩個性狀顯著相關(guān)；在C81T位點上，TT基因型的體質(zhì)量、頭長+軀干長、眼間距和尾柄寬的平均值顯著高于CC和CT基因型(P<0.05)，TT基因型的體長平均值顯著高于CT基因型(P<0.05)；在G315C位點上，CC基因型的體質(zhì)量、體高、頭長、頭長+軀干長、眼間距和體寬的平均值顯著高于GC和GG基因型(P<0.05)；在A1524G位點上，AA基因型的體質(zhì)量、體長、尾柄高、體高和頭長+軀干長的平均值顯著高于GG基因型(P<0.05)；在G2107A、T2125C和G2256A位點上，GG和GA基因型的頭長和眼間距均顯著高于CC基因型(P<0.05)。

表2 GHRH基因SNP位點基因型與6月齡紅鰭東方鲀生長性狀的關(guān)聯(lián)分析Tab.2 Correlation analysis between the SNP genotype of GHRH gene and the growth traits of 6-month-old tiger puffer Takifugu rubripes

從表3可見：在12月齡紅鰭東方鲀?nèi)后w中，各突變位點與性狀顯著關(guān)聯(lián)性與6月齡群體基本一致；在C81T位點上，TT基因型的體質(zhì)量、頭長和體寬平均值顯著高于CC基因型(P<0.05)；在G315C位點上，CC基因型的體質(zhì)量和頭長平均值顯著高于GC和GG基因型(P<0.05)；在A1524G位點上，AA基因型的頭長平均值顯著低于GG和AG基因型(P<0.05)，而其體長、體寬和尾柄高平均值則顯著高于GG基因型(P<0.05)；在G2256A位點上，GG基因型的頭長平均值顯著高于AA基因型(P<0.05)；在G2107A和T2125C位點上，各基因型生長性狀均無顯著性差異(P>0.05)。

另外，從表2和表3還可以看出，GHRH基因C1083T 位點的多態(tài)性與6月齡和12月齡紅鰭東方鲀的生長性狀均無顯著關(guān)聯(lián)(P>0.05)。

表3 GHRH基因SNP位點基因型與12月齡紅鰭東方鲀生長性狀的關(guān)聯(lián)分析Tab.3 Correlation analysis between the SNP genotype of GHRH gene and the growth traits of 12-month-old tiger puffer Takifugu rubripes

2.4 連鎖不平衡及雙倍型分析

利用Hapioview 4.1軟件對GHRH基因的7個SNPs位點進(jìn)行連鎖不平衡分析(圖3)。從圖3可見，G2256A與T2125C的D′值為0.81，兩位點處于連鎖不平衡狀態(tài)，G2107A與C1083T的D′值為0.83，也處于連鎖不平衡狀態(tài)，然而二者的r2值分別為0.311和0.089，不能同時滿足D′>0.8且r2>0.33的條件，這說明這些位點并非完全連鎖；其他位點兩兩間既不能滿足D′>0.8，也不能滿足r2>0.33，說明位點間處于彼此獨立的狀態(tài)。

從上述6月齡和12月齡紅鰭東方鲀的SNPs位點與生長性狀關(guān)聯(lián)分析中可知，7個SNPs位點中，C81T、G315C和A1524G位點與大多數(shù)生長性狀的關(guān)聯(lián)性均呈顯著狀態(tài)，因此，可用這3個位點進(jìn)行雙倍型與體質(zhì)量的關(guān)聯(lián)分析。在雙倍型分析中，若一種雙倍型組合的個體數(shù)小于10尾，則結(jié)果不具有參考價值，經(jīng)排除，最終形成5種雙倍型(理論雙倍型數(shù)為8種)，結(jié)果如表4所示。其中，雙倍型D3出現(xiàn)頻率最低(0.09)，雙倍型D5出現(xiàn)頻率最高(0.48)。6月齡群體中，雙倍型D3的體質(zhì)量平均值最低且顯著低于雙倍型D4和D5(P<0.05)，雙倍型D4體質(zhì)量平均值最高；12月齡群體中，雙倍型D3的體質(zhì)量平均值最低且顯著低于雙倍型D5(P<0.05)(表4)。推測6月齡時，雙倍型D3對體質(zhì)量有負(fù)相關(guān)影響，雙倍型D4和D5對體質(zhì)量有正相關(guān)影響，12月齡時，雙倍型D4和D5對體質(zhì)量有正相關(guān)影響。

圖中數(shù)值為D′值，單位為%。The numerical value in the figure is D′ value expressed as a percentage.圖3 GHRH基因SNPs連鎖不平衡分析Fig.3 Linkage disequilibrium analysis about the SNPs of GHRH gene

表4 GHRH基因雙倍型與6月齡及12月齡紅鰭東方鲀體質(zhì)量的關(guān)聯(lián)分析Tab.4 Correlation analysis between GHRH gene diplotypes and body mass traits of 6-month-old and 12-month-old tiger puffer Takifugu rubripes

3 討論

GHRH是下丘腦分泌的肽類激素，其通過與垂體前葉生長激素受體結(jié)合來調(diào)節(jié)生長激素的合成和分泌。Farmer等[21]通過給不同年齡的豬注射GHRH，得出GHRH有促進(jìn)個體生長效果的結(jié)論。張永亮等[22]通過直接注射將改良的生長激素釋放因子導(dǎo)入兔和鼠的骨骼肌中，發(fā)現(xiàn)可增強其體內(nèi)的GH濃度。在水產(chǎn)動物方面，Tao等[8]在北極紅點鮭的GHRH基因中發(fā)現(xiàn)，特定 SNP 等位基因與早期生長之間存在顯著關(guān)聯(lián)。在紅鰭東方鲀中，僅見王艷玲[23]利用PCR-SSCP方法和DNA測序方法研究GHRH基因突變的報道，但未發(fā)現(xiàn)SNPs。因此，本研究中首次發(fā)現(xiàn)了紅鰭東方鲀GHRH基因突變與生長性狀間的關(guān)聯(lián)。

3.1 紅鰭東方鲀GHRH基因的SNPs位點篩選及其與生長性狀的關(guān)聯(lián)分析

本試驗中結(jié)果顯示，紅鰭東方鲀GHRH基因上共有7個SNP位點，分別為C81T、G315C、C1083T、A1524G、G2107A、T2125C及G2256A，其中，G315C、C1083T、A1524G存在于外顯子上，C1083T位點所在的序列由ATG(M)變?yōu)锳CG(T)，A1524G中GTC(V)變?yōu)锳TC(I)，位點突變導(dǎo)致氨基酸種類的改變，屬于錯義突變。外顯子上的突變?nèi)绻麑?dǎo)致氨基酸的改變，通常會導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與活性的變化，甚至導(dǎo)致蛋白質(zhì)翻譯提前終止，從而發(fā)生一系列生物學(xué)效應(yīng)并對動物機體產(chǎn)生影響。本研究中位于外顯子上的3個SNP突變位點G315C、C1083T和A1524G，尤其是C1083T與A1524G 2個多態(tài)位點導(dǎo)致了氨基酸的改變，可能是紅鰭東方鲀個體生長性狀差異的主要原因。本研究結(jié)果顯示，GHRH基因上只有3個突變位點G315C、A1524G和C81T與2個階段的生長性狀顯著相關(guān)，且CC、AA、TT基因型分別為優(yōu)勢基因型，該研究結(jié)果也證實了GHRH基因是一個魚類生長性狀的功能候選基因，相似的研究結(jié)果在斑點交叉尾鮰Ictaluruspunetaus中也有報道。張世勇等[24]對斑點交叉尾鮰采用DNA混池測序法篩選其GHRH基因的SNP位點,并進(jìn)行連鎖不平衡和單倍型分析，最終在GHRH基因中發(fā)現(xiàn)了4個與生長性狀相關(guān)的SNPs標(biāo)記位點。因此，筆者推測本試驗中獲得的3個與生長性狀顯著相關(guān)的位點可以作為紅鰭東方鲀的分子標(biāo)記輔助選擇位點。

3.2 SNPs位點的連鎖不平衡及雙倍型分析

連鎖不平衡是給定群體中不同位點等位基因的非隨機關(guān)聯(lián)現(xiàn)象。本研究中，G2256A與T2125C兩位點及G207A與C083T兩位點間都滿足D′>0.8，處于連鎖不平衡狀態(tài)，然而其他位點兩兩間既不能滿足D′>0.8，也不能滿足r2>0.33，說明位點間處于彼此獨立的狀態(tài)，這表明這7個SNPs位點更趨向于獨立遺傳。生物的生長性狀并非受單一位點調(diào)控，而是多個位點或微效基因互相作用共同影響，因此，分析某一單個位點并不能準(zhǔn)確得到相關(guān)性，應(yīng)將多個位點組成雙倍型組合共同分析[26-27]。本研究中對C81T、G315C和A1524G 3個SNPs位點進(jìn)行雙倍型與體質(zhì)量的關(guān)聯(lián)分析，去除個體數(shù)少于10的雙倍型組合，共得到5種雙倍型，將雙倍型組合與紅鰭東方鲀的體質(zhì)量進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果表明，6月齡群體中雙倍型D4、D5的平均值顯著高于雙倍型D3，12月齡群體中雙倍型D5的平均值顯著高于雙倍型D3，推測6月齡時，雙倍型D4、D5可能對紅鰭東方鲀的體質(zhì)量有正相關(guān)影響，12月齡時，雙倍型D4、D5可能對紅鰭東方鲀的體質(zhì)量有正相關(guān)影響，雙倍型D3可能有負(fù)相關(guān)影響。C81T的優(yōu)勢基因型為TT，G315C的優(yōu)勢基因型為CC，A1524G的優(yōu)勢基因型為AA。然而，TT、CC、AA的雙倍型組合個體太少而無法進(jìn)行分析，從雙倍型分析結(jié)果上看，6月齡時雙倍型D4、D5為優(yōu)勢基因型，12月齡時雙倍型D5為優(yōu)勢基因型。

4 結(jié)論

1)本研究中根據(jù)紅鰭東方鲀GHRH基因序列設(shè)計引物，用直接測序法在GHRH基因上共篩選到7個SNP位點，這表明紅鰭東方鲀?nèi)后w中GHRH基因存在較為豐富的突變。

2)C81T、G315C和A1524G 3個位點是對紅鰭東方鲀生長有正向影響的優(yōu)勢位點，雙倍型D4和D5為優(yōu)勢基因型，說明在后續(xù)紅鰭東方鲀選育過程中可以優(yōu)先選擇這些位點及基因型，本研究結(jié)果為紅鰭東方鲀的分子標(biāo)記輔助選育提供了科學(xué)依據(jù)。