徐文剛，劉立明，王九龍，張建柏，于文松，真鍋颯一郎，遲守峰

(1.煙臺大學 海洋學院，山東 煙臺 264005；2.煙臺市海洋經(jīng)濟研究院，山東 煙臺 264003；3.長崎大學環(huán)中國東海環(huán)境資源研究所,日本 長崎 851-2213;4.煙臺市海洋環(huán)境監(jiān)測預報中心,山東 煙臺 264000)

硬骨魚類性腺發(fā)育和成熟主要受到下丘腦-垂體-性腺軸(hypothalamic-pituitary-gonadal axis，HPG軸)為中心的內(nèi)分泌系統(tǒng)及外界環(huán)境因子的綜合影響[1-2]。魚類受到水溫和光照等環(huán)境因子刺激后，在下丘腦合成促性腺激素釋放激素(gonadotropin-releasing hormone，GnRH)，GnRH誘導垂體合成促性腺激素(gonadotropins，GtHs)，GtHs中的β亞基單元有兩種類型，即促卵泡激素(follicle stimulating hormone，F(xiàn)SHβ)和黃體生成素(luteinizing hormone，LHβ)。FSHβ和LHβ隨血液到達性腺后，誘導性腺合成類固醇激素，包括雌二醇(17β-estradiol，E2)和睪酮(testosterone，T)，從而促進排卵和排精[1]。有研究表明，魚類性腺發(fā)育成熟過程中，F(xiàn)SHβ和LHβ激素起著關鍵作用[3-6]。

五條鰤Seriolaquinqueradiata隸屬于鱸形目Perciformes鱸亞目Percoidei鲹科Carangidae鰤亞科Seriolinae鰤屬Seriola，俗稱章雄魚、青甘魚、平安魚、油甘魚等，是暖溫帶海洋中上層大型掠食性魚類，具有體型大、生長快和肉質(zhì)佳等特點，有較高的經(jīng)濟價值和市場前景，其分布于日本海至中國臺灣以南海域，在中國黃海、渤海和東海均有分布[7]。已有研究表明，五條鰤通常在4—5月產(chǎn)卵，對其親魚進行19 ℃以上水溫調(diào)節(jié)的同時，持續(xù)短光照(8L∶16D)1個月后再調(diào)整為長光照(18L∶6D)1個月，進行水溫調(diào)節(jié)后可以比自然條件下提前2個月誘導其性成熟[8]，這表明采用人工調(diào)控水溫和光照時間有可能促進其提前成熟和產(chǎn)卵，縮短養(yǎng)殖周期，減少越冬消耗，從而降低養(yǎng)殖成本。為此，本試驗中以五條鰤為研究對象，在以往試驗的基礎上加以改進，綜合運用水溫和光照調(diào)節(jié)，比較了各階段試驗魚的性腺指數(shù)、性腺發(fā)育頻率變化、腦垂體中fshβ和lhβ基因含量的差異，以及血清中類固醇激素E2和T含量的變化，探討了環(huán)境因子對其性腺發(fā)育成熟的影響，以期為五條鰤的人工繁殖和苗種生產(chǎn)提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用魚為從日本五島市購買的同批次卵孵化的性腺尚未發(fā)育成熟的雌性五條鰤成魚，將其運輸至長崎大學環(huán)中國東海環(huán)境資源研究所。于2018年1月5日將其飼養(yǎng)在2個容積為90 000 L的八角形水槽中，每個水槽放置20尾，共計40尾。

1.2 方法

1.2.1 試驗設計 水槽為開放式流水養(yǎng)殖，鹽度為29～31，pH為7.8～8.3，溶解氧為5 mg/L以上，保持24 h增氧。試驗從2018年1月20日開始，3月20日結(jié)束。2個水槽分別設為對照組和處理組，其中，對照組為自然水溫和光照條件飼養(yǎng)，溫度變化為9.2～12.4 ℃，光照周期為12L∶12D。處理組對其進行環(huán)境調(diào)節(jié)，以日光燈作為光源，放置在試驗池上方大約2 m處，每平方米放置2根日光燈管，并在四周用黑布遮擋以避免外界干擾，水面光照度約2 500 lx，利用開、關燈控制光照時間，光照周期為10L∶14D；進行開放式流水養(yǎng)殖并用溫度調(diào)節(jié)器保持水溫恒定為20 ℃。試驗期間在光照條件下每天早晚各投食一次，觀察魚的攝食情況并記錄每日的攝食量，所用飼料為鰤魚1300(Feedone，日本)。試驗期間無個體死亡。

1.2.2 樣品的采集 試驗開始時及試驗進行1個月和2個月后，每月采樣一次，從對照組和處理組每次各取5尾。用2-苯氧乙醇將魚麻醉后，測量其全長和體質(zhì)量。從尾柄部采血約5 mL，血液在12 000g、4 ℃下離心20 min后，取上層血清保存于-80 ℃超低溫冰箱中。采血后解剖取其性腺，測定質(zhì)量后將其立即置于波恩試劑中固定24 h，后于體積分數(shù)為70%的乙醇中保存用于組織學分析。

性腺指數(shù)(GSI，%)計算公式為

GSI=WG/WB×100%。

其中：WG為生殖腺質(zhì)量(g)；WB為體質(zhì)量(g)。

隨后打開頭蓋骨取出腦垂體，將其保存在200 μL RNAlater試劑(Ambion，日本)中后于4 ℃下保存，一周后廢棄RNAlater試劑，轉(zhuǎn)移至-80 ℃超低溫冰箱中長期保存，用于qRT-PCR試驗。

1.2.3 性腺的組織學觀察 組織學分析步驟參照Shein等[9]的方法。對五條鰤性腺進行常規(guī)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋和連續(xù)切片，厚度為5 μm。采用蘇木精-伊紅(H.E)染色，中性樹膠封片，用光學顯微鏡(Olympus FX380型)觀察并拍照，以各個體中卵母細胞最發(fā)達階段為性腺的發(fā)育階段。參照文獻[10-12]中的方法及試驗需要，將其卵母細胞發(fā)育分為3個時相，其中，第Ⅰ時相為性腺發(fā)育未成熟階段，第Ⅱ和第Ⅲ時相為性腺發(fā)育成熟階段。

1)第Ⅰ時相(初級卵母細胞生長期，primary yolk stage，Py)。細胞體積小；細胞質(zhì)少，顯強嗜堿性；核仁1～2個，分布在核的中央或邊緣。細胞質(zhì)被蘇木精染色深，核呈現(xiàn)巨大化，核中出現(xiàn)許多較小的核仁。

2)第Ⅱ時相(次級卵母細胞生長期，secondary yolk stage，Sy)，大生長期。核周細胞質(zhì)出現(xiàn)油滴，環(huán)形帶狀分布，并向胞質(zhì)邊緣擴散；雙層濾泡膜。卵母細胞快速生長，卵黃球迅速累積，并占細胞質(zhì)的大半。

3)第Ⅲ時相(次級卵母細胞生長晚期，tertiary yolk stage，Ty)，大生長晚期。卵黃顆粒形成，油滴增多，逐漸充滿細胞質(zhì)；細胞質(zhì)中已經(jīng)積累了大量卵黃，但核移動還尚未開始。

1.2.4 腦垂體中fshβ和lhβ基因含量的檢測

1)總RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄。取凍存的五條鰤腦垂體組織，參照TRIzol試劑盒(Life Technologies Corp.，美國)說明書進行總RNA提取，經(jīng)10 g/L瓊脂凝膠電泳檢測RNA完整度，用分光光度計(NanoDrop 2000，美國Thermo Scientific公司)檢測RNA濃度。根據(jù)Transcriptor first strand cDNA synthesis(德國Roche Diagnostic公司)說明書操作，取500 ng腦垂體總RNA作為反轉(zhuǎn)錄模板合成第一鏈cDNA，用于PCR的擴增。

2)腦垂體中fshβ和lhβ基因?qū)崟r熒光定量檢測。參照Higuchi等[13]的方法，根據(jù)GenBank中五條鰤fshβ(LC102206)和lhβ(LC102207)基因序列，用Primer Express軟件設計熒光定量引物，由美國Integrated DNA Technologies公司合成，引物序列如表1所示。

表1 實時熒光定量PCR反應中的引物序列Tab.1 Sequences of primers for quantitative real-time PCR

fshβ和lhβ基因測定按照FastStart Essential DNA Probe Master(Roche Diagnostics，Mannheim，Germany)試劑盒說明書操作。PCR反應體系(共10 μL)：cDNA模板2.5 μL，Probe Master(2×concentrate)5 μL，探針引物(Primer-F 10 pmol/μL，Primer-R 10 pmol/μL，Probe 5 pmol/μL)0.5 μL，滅菌超純水2 μL。在Light Cycler?480進行PCR反應。反應程序：95 ℃下預變性10 min；95 ℃下變性15 s，60 ℃下延伸1 min，共進行45個循環(huán)；95 ℃下加溫 5 s，65 ℃ 下熔解1 min；最后在50 ℃下冷卻30 s。PCR反應后獲得熔解曲線，檢測數(shù)據(jù)用絕對定量法進行統(tǒng)計分析。

1.2.5 血清中雌二醇和睪酮含量的檢測 參照文獻[13-14]中的檢測方法。即將冷凍的血清樣品經(jīng)過4 ℃解凍后再次離心取得上層血清，然后血清經(jīng)過甲醇-乙醚低溫冷凍蒸發(fā)系統(tǒng)進行類固醇的提純，經(jīng)過3次冷凍蒸發(fā)后的血清樣品可用于檢測。采用Estradiol EIA Kit和Testosterone EIA Kit的EIA(Enzyme immunoassy)酶聯(lián)免疫試劑盒(均購自Cayman Chemical公司)測定E2和T的含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)均以平均值±標準差(mean ± S.D.)表示。采用SPSS 23.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，采用Kolmogorov-Smirnov法進行正態(tài)分布檢測，利用ANOVA檢驗及Tukey’s HSD法進行差異性比較分析，顯著性水平設為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 對照組和處理組五條鰤體長、體質(zhì)量、性腺質(zhì)量和性腺指數(shù)的差異

從表2可見：試驗期間，對照組和處理組中不同采樣時間點間魚的體長和體質(zhì)量無顯著性差異(P>0.05)；隨著試驗的進行，各組性腺質(zhì)量和性腺指數(shù)均呈增加趨勢，試驗進行1個月(2018-02-20)和2個月(2018-03-20)后，處理組魚的性腺質(zhì)量和性腺指數(shù)均顯著高于對照組(P<0.05)。

表2 試驗期間對照組和處理組五條鰤的體長、體質(zhì)量、性腺質(zhì)量和性腺指數(shù)差異Tab.2 Differences in total length,body mass,gonad mass,and GSI in yellowtail Seriola quinqueradiata between control group and treatment groups during experimental period

2.2 對照組和處理組五條鰤性腺發(fā)育差異

五條鰤性腺在不同發(fā)育階段的切片如圖1所示,試驗期間，對照組魚的性腺發(fā)育在各采樣階段均為初級卵母細胞生長期(圖1A)。處理組魚的性腺在不同發(fā)育階段的比例變化如圖2所示。試驗開始時，處理組中5尾魚性腺發(fā)育均為初級卵母細胞生長期(圖1B，圖2)；1個月后，5尾魚中3尾魚為次級卵母細胞生長期，2尾魚為次級卵母細胞生長晚期(圖1C，圖2)；2個月后，5尾魚中2尾魚為次級卵母細胞生長期，3尾魚為次級卵母細胞生長晚期(圖1D，圖2)。

A和B—第I時相；C—第Ⅱ時相；D—第Ⅲ時相。Py—初級卵母細胞生長期；Sy—次級卵母細胞生長期；Ty—次級卵母細胞生長晚期。A and B—the phase I；C—the phaseⅡ；D—the phase Ⅲ.Py—growth phase of primary oocyte；Sy—growth phase of secondary oocyte；Ty—later growth phase of secondary oocyte.圖1 五條鰤性腺在不同發(fā)育階段的切片圖Fig.1 Histological sections of yellowtail Seriola quinqueradiata at different gonadal developmental stages

圖2 處理組五條鰤性腺在不同發(fā)育階段的比例變化Fig.2 Changes in the proportion of different gonadal developmental stages of yellowtail Seriola quinqueradiata in the treatment groups

2.3 各組五條鰤腦垂體fshβ和lhβ基因含量變化

從圖3可見：試驗期間,對照組五條鰤腦垂體fshβ和lhβ基因含量均無顯著性變化(P>0.05)；隨著試驗的進行，各組fshβ和lhβ基因含量均呈增加趨勢，試驗進行1個月(2018-02-20)和2個月(2018-03-20)后，處理組試驗魚腦垂體中fshβ基因含量顯著高于對照組(P<0.05)，試驗進行2個月后，處理組腦垂體中l(wèi)hβ基因含量顯著高于對照組(P<0.05)。

標有不同字母者表示組間有顯著性差異(P<0.05)，標有相同字母或無字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05)。The means with the different letters are significantly different between groups at the 0.05 probability level,and means with the same letter or without letters are not significantly different between groups at the 0.05 probability level.圖3 各組五條鰤腦垂體fshβ和lhβ基因含量變化Fig.3 Changes in fshβ and lhβ genes content in each group of yellowtail Seriola quinqueradiata

2.4 對照組和處理組五條鰤血清E2和T含量差異

從表3可見：試驗期間，對照組五條鰤血清E2和T含量均無顯著性變化(P>0.05)；隨著試驗的進行，各組E2和T含量總體呈增加趨勢，試驗進行1個月(2018-02-20)和2個月(2018-03-20)后，處理組中五條鰤血清E2和T含量均顯著高于對照組(P<0.05)。

表3 試驗期間各組五條鰤血清E2和T含量的差異Tab.3 Differences in the concentrations of serum E2 and T in yellowtail Seriola quinqueradiata in each group during experimental period ng/mL

3 討論

3.1 水溫和光照調(diào)節(jié)對五條鰤性成熟的影響

本試驗期間，對照組中五條鰤的性腺發(fā)育一直處于未成熟階段，但通過水溫和光照的調(diào)節(jié)，處理組中魚的性腺在試驗進行1個月和2個月后均處于成熟階段，且GSI均顯著增加，這表明綜合運用水溫20 ℃和光照(10L∶14D)調(diào)節(jié)有助于促進五條鰤性腺發(fā)育成熟。研究表明，在秋冬季節(jié)通過綜合運用水溫(15～18 ℃)和光照(15L∶9D)調(diào)節(jié)，能成功誘導紅鰭東方鲀Takifugurubripes提前達到性成熟[15]。大西洋鮭Salmosalar在水溫12.7 ℃和持續(xù)光照飼養(yǎng)條件下，其生長和成熟比例均獲得顯著提高[16]。在2齡鱸Dicentrarchuslabrax中，持續(xù)短光照比自然光照或長光照更能加速其性腺發(fā)育成熟并產(chǎn)卵[17]。此外，通過提高水溫和延長光照時間，可促使牙鲆Paralichthysolivaceus親魚提前 1～5個月成熟和產(chǎn)卵[18]。恒溫26 ℃條件下有助于加速赤點石斑魚Epinephelusakaara生長從而提前達到性成熟，而28 ℃水溫反而降低其性成熟比例[19-20]，由此表明，合適的水溫可能會加快魚類新陳代謝，從而促進其性腺發(fā)育成熟。但光照調(diào)節(jié)對紅點鮭Salvelinusalpinus性成熟的比例無影響[21]。本試驗結(jié)果表明，通過水溫和光照綜合調(diào)節(jié)有助于促進五條鰤性成熟，可能原因是水溫促進五條鰤新陳代謝從而促進其提前發(fā)育成熟，但水溫和光照中何種因子起主要作用還有待進一步研究。

3.2 水溫和光照調(diào)節(jié)對五條鰤腦垂體中fshβ和lhβ基因含量及血清中E2和T含量的影響

本試驗中，通過水溫和光照的調(diào)節(jié)，處理組五條鰤腦垂體中fshβ基因含量在試驗進行1個月和2個月后顯著高于對照組，lhβ基因含量在2個月后顯著高于對照組，這表明合適的水溫和光照有利于促進fshβ和lhβ含量的增加。研究表明，當條件從長光照變?yōu)槎坦庹諘r，山女鱒Oncorhynchusmasou下丘腦中GnRH[22]及腦垂體中fshβ和lhβ基因含量增加[23]，從而促進性成熟。恒溫26 ℃條件下有助于加速赤點石斑魚提前達到性成熟，主要原因為適宜的水溫利于促進腦垂體中fshβ和lhβ基因含量顯著增加[19]。這表明，本試驗中五條鰤性腺能提前發(fā)育成熟，可能與水溫和光照有利于促進其腦垂體中fshβ和lhβ含量的增加有關。

此外，本試驗中通過水溫和光照的調(diào)節(jié)，處理組五條鰤血清中E2和T含量在試驗進行1個月和2個月后均顯著高于對照組，這表明合適的水溫和光照有利于促進E2和T含量的增加。已有研究表明，斜帶石斑魚E.coioides血清中E2和T的濃度在繁殖季節(jié)(6月)顯著增加，且GSI迅速提高，這表明E2能夠誘導肝細胞中卵黃磷蛋白的合成，促進卵巢發(fā)育成熟[24]。在烏蘇里擬鲿Pseudobagrusussuriensis中，雌魚血清的E2和T在5月份達到最高值；雄魚的E2在5月份達到最高值，而T的最高值則出現(xiàn)在4月份，這表明雌、雄魚性腺發(fā)育成熟度與E2和T基本同步[25]。在太平洋鱈Gadusmacrocephalus性腺發(fā)育成熟期，其血清中E2和T含量變化顯著，且與GSI變化趨勢呈正相關，這說明E2和T對太平洋鱈的性腺發(fā)育成熟具有重要作用[26]。這表明，本試驗中，五條鰤性腺能提前發(fā)育成熟可能與水溫和光照有利于促進其血清中E2和T含量的增加也有關。

已有研究表明，魚類發(fā)育過程中，E2是促進卵黃磷蛋白合成的重要激素，T是合成E2的前體，E2和T的合成受到腦垂體中fshβ和lhβ的調(diào)節(jié)，并隨fshβ和lhβ分泌的增加而增加[1-2]。因此，本試驗中五條鰤性成熟可能是由于水溫和光照調(diào)節(jié)促進腦垂體中fshβ和lhβ含量的增加，進而促進血清中E2和T含量上升，最終誘導性成熟。類似的結(jié)果出現(xiàn)在牙漢魚Odontesthesbonariensis中，當光照周期由8L∶16D調(diào)整到16L∶8D時，腦垂體中gpα、fshβ和lhβ含量顯著增加，血清中E2和T濃度亦顯著上升[27]。在高體鰤Serioladumerili中，當光照周期由6L∶18D調(diào)整到18L∶6D時，血清中E2濃度有增加的傾向，gpα、fshβ和lhβ基因含量增加[28]。

綜上可見，在今后五條鰤的人工繁殖中，可以考慮綜合運用水溫和光照調(diào)節(jié)，以促進其腦垂體中fshβ和lhβ基因含量及血清中E2和T含量的增加，從而加速誘導其性腺發(fā)育成熟。

4 結(jié)論

1)綜合運用水溫20 ℃和光照(10L∶14D)調(diào)節(jié)有助于促進五條鰤性腺發(fā)育成熟。

2)綜合運用水溫20 ℃和光照(10L∶14D)調(diào)節(jié)有助于促進五條鰤腦垂體中fshβ和lhβ基因含量及血清中E2和T含量的增加，從而加速誘導其性腺發(fā)育成熟。