吳燕鐸，歐密，高丹丹，陳昆慈，羅青，劉海洋，趙建*

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶亞熱帶水產(chǎn)資源利用與養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510380；2.上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306)

斑鱧Channamaculata俗稱生魚、財(cái)魚和文魚，主要分布于珠江流域，以及福建和海南島各水系，有“兩廣生魚”之稱。斑鱧隸屬于鱸形目Perciformes鱧科Channidae鱧屬Channa，其肉嫩味美、肌間刺少，具有適應(yīng)性強(qiáng)、耐低氧等特點(diǎn)及生肌補(bǔ)血、滋補(bǔ)調(diào)養(yǎng)等功效，是一種經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的魚類，同時(shí)也是中國重要的出口魚類之一[1]。斑鱧雄性個(gè)體的生長明顯優(yōu)于雌性個(gè)體，因此，培育具有生長優(yōu)勢的全雄群體將顯著提高單位面積的養(yǎng)殖產(chǎn)量，從而提高經(jīng)濟(jì)效益。目前，雜交鱧的全雄育種已實(shí)現(xiàn)[2]，斑鱧作為全雄雜交鱧的父本也已經(jīng)可以進(jìn)行性別控制，但其性別分化和性腺發(fā)育機(jī)制仍不清楚，相關(guān)研究相對(duì)較少，僅卓孝磊[3]采用組織學(xué)方法研究發(fā)現(xiàn)，雌性雜交鱧性別分化最早發(fā)生于仔魚出膜后13 d，雄性雜交鱧性別分化發(fā)生于仔魚出膜后29 d，其初級(jí)卵母細(xì)胞和初級(jí)精母細(xì)胞的出現(xiàn)，分別發(fā)生在出膜后27、34 d。為了更精準(zhǔn)地開展鱧的性別調(diào)控，需深入研究其性別分化和性腺發(fā)育過程中的關(guān)鍵因子。

Foxl2(forkhead transcription factor gene 2)是最早發(fā)現(xiàn)的脊椎動(dòng)物卵巢分化標(biāo)記基因之一，屬于Fox家族的重要成員，在進(jìn)化過程中非常保守，參與調(diào)控脊椎動(dòng)物卵巢發(fā)育與形態(tài)維持[4]。Fox(forkhead box)屬叉頭框轉(zhuǎn)錄因子家族，因與果蠅頭部基因的叉頭結(jié)構(gòu)相似而得名[5]，具有101個(gè)氨基酸組成的翼狀螺旋結(jié)構(gòu)。該家族基因涉及諸如脊椎動(dòng)物的胚胎發(fā)育、細(xì)胞周期調(diào)控、糖類與脂類代謝、生物老化、免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)過程[6]。Foxl2基因在哺乳動(dòng)物卵巢發(fā)育及卵巢功能維持方面發(fā)揮重要作用，被認(rèn)為是卵泡發(fā)育所必需的細(xì)胞因子[7]。在鳥類中，F(xiàn)oxl2基因主要在生長卵泡的顆粒細(xì)胞中表達(dá)，并參與調(diào)控芳香化酶[8]。在兩棲動(dòng)物皺皮蛙Ranarugosa中，F(xiàn)oxl2蛋白定位于卵母細(xì)胞周圍的體細(xì)胞中，并在卵巢分化早期起關(guān)鍵作用[9]。

許多魚類的生長具有性別二態(tài)性，因此，魚類性別分化機(jī)制一直是研究的熱點(diǎn)。Foxl2基因在硬骨魚類中廣泛存在，對(duì)多種魚類研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxl2基因主要在性腺、腦和鰓中表達(dá)，且卵巢中表達(dá)量最高，其表達(dá)呈現(xiàn)明顯的性別二態(tài)性[10]。對(duì)青鳉Oryziaslatipes[11]、革胡子鲇Clariasgariepinus[12]和尼羅羅非魚Oreochromisniloticus[13]的研究表明，卵巢分化及發(fā)育過程中，F(xiàn)oxl2蛋白持續(xù)表達(dá)于顆粒細(xì)胞，推測該蛋白參與卵巢分化和卵巢功能的維持。Li等[14]對(duì)羅非魚敲除Foxl2基因后發(fā)現(xiàn)，雌性個(gè)體缺失Foxl2，會(huì)導(dǎo)致卵原細(xì)胞不同程度退化、Cyp19a1a表達(dá)量減少和血清中雌激素含量下降，從而導(dǎo)致羅非魚完全性逆轉(zhuǎn)。該結(jié)果表明，F(xiàn)oxl2基因可以通過調(diào)控芳香化酶的表達(dá)水平進(jìn)而影響魚類性別分化的方向。此外，用性類固醇激素處理虹鱒Oncorhynchusmykiss[15]、稀有鮈鯽Gobiocyprisrarus[16]、南方鲇Silurusmeridionalis[17]和紅鰭東方鲀Takifugurubripes[18]的研究發(fā)現(xiàn)，添加雌激素將上調(diào)Foxl2 mRNA表達(dá)水平，而雄激素處理則下調(diào)該基因表達(dá)水平。在對(duì)斑鱧性別控制研究中發(fā)現(xiàn)，性類固醇激素處理可改變斑鱧性別分化的方向，而Foxl2基因在其中的作用尚未明確。

本研究中，以斑鱧為研究對(duì)象，分析了斑鱧Foxl2基因組織表達(dá)和不同發(fā)育時(shí)期性腺中的表達(dá)模式，并研究了其在外源性類固醇激素處理下雌雄斑鱧性腺中Foxl2的表達(dá)響應(yīng)，初步探索了Foxl2基因在斑鱧性別分化和性腺發(fā)育中的調(diào)控作用，以期為斑鱧性別分化機(jī)制和性腺發(fā)育提供基礎(chǔ)資料，并為鱧科魚類單性育種生產(chǎn)實(shí)踐提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用斑鱧均源自廣東省佛山市南海區(qū)百容水產(chǎn)良種有限公司，試驗(yàn)用成魚及幼魚分別暫養(yǎng)于該公司水泥池(4 m×4 m×2 m)中，每天8∶00、17∶00投喂人工配合顆粒飼料，養(yǎng)殖期間水溫為24～28 ℃。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與樣品的采集處理

1)Foxl2 mRNA在斑鱧不同組織中的表達(dá)試驗(yàn)。取1齡成魚斑鱧，雌雄各3尾，體長為(40.5±3.0)cm，體質(zhì)量為(995.5±255.5)g，經(jīng)MS222麻醉劑(Sigma,美國)麻醉(麻醉劑量為1.25 g/mL)后，用無酶的剪刀、鑷子取其鰓、肝、脾、腸、中腎、肌肉、頭腎、卵巢、精巢、心臟、下丘腦和腦12種組織，用于檢測Foxl2 mRNA在斑鱧不同組織中的表達(dá)情況。

2)不同發(fā)育時(shí)期性腺中Foxl2基因表達(dá)和血清中雌性激素(estrogen,E)總含量測定試驗(yàn)。取孵化出膜45(第Ⅰ期)、75(第Ⅱ期)、105(第Ⅲ期)、135(第Ⅲ期)、165(第Ⅳ期)、195(第Ⅳ期)和365 d(第Ⅳ期)(均處于發(fā)育時(shí)期)的斑鱧幼魚[19]，剪取少量尾鰭提取基因組DNA，根據(jù)趙建等[20]性染色體連鎖標(biāo)記方法鑒定斑鱧遺傳性別。每個(gè)時(shí)期取雌、雄魚各5尾，取其性腺，用于檢測Foxl2在性腺不同發(fā)育時(shí)期斑鱧性腺組織中的表達(dá)情況。從上述不同發(fā)育時(shí)期的斑鱧尾柄靜脈處抽血0.5～2 mL，4 ℃下靜置4～6 h后，以3 000 r/min離心20 min，收集上層血清于-20 ℃下保存，用于檢測不同發(fā)育時(shí)期雌、雄斑鱧血清中雌性激素總含量。

3)外源激素處理后性腺中Foxl2的表達(dá)變化試驗(yàn)。將300尾出膜75 d的斑鱧隨機(jī)分成3組，每組100尾，飼養(yǎng)在3個(gè)水泥池中，試驗(yàn)魚體長為(14.8±0.3)cm，體質(zhì)量為(61.2±3.8)g。通過開展預(yù)試驗(yàn)對(duì)試驗(yàn)溶劑進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)玉米油充當(dāng)溶劑時(shí)，對(duì)魚體無副作用。因此，對(duì)照組注射玉米油，2個(gè)處理組分別注射17α-乙炔基雌二醇(17α-ethynylestradio,EE2，Aladdin，上海)和17α-甲睪酮(17α-methyltestosterone,MT，Aladdin，上海)兩種性激素。EE2和MT粉末均先用少量無水乙醇溶解，再加入玉米油配制成6 mg/mL的工作液。EE2和MT激素處理組的注射劑量均為10 μg/g(體質(zhì)量)，對(duì)照組注射等量玉米油，從腹鰭基部腹腔注射。每組在注射后24、48、72、96、120、144 h，直接用消毒的剪刀鑷子剖開腹部取其性腺。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)至少保證每組雌、雄魚各取5尾，用于檢測外源性類固醇激素處理后性腺中Foxl2的表達(dá)變化。

將以上樣品組織放入凍存管，迅速投入液氮中速凍后置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

4)細(xì)胞定位分析試驗(yàn)。取出膜105 d的斑鱧雌、雄性腺組織浸于波恩氏液中，固定24 h后轉(zhuǎn)入75%乙醇(體積分?jǐn)?shù)，下同)中，4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 RNA提取和cDNA的合成 采用Trizol法(Invitrogen,美國)，提取斑鱧成魚卵巢總RNA，采用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，采用超微量分光光度計(jì)(NanoDrop2000，博奧生物,北京)檢測其濃度和純度(OD260 nm/OD280 nm≥1.8、OD260 nm/OD230 nm≥1.0，表示RNA質(zhì)量良好)；利用六堿基隨機(jī)引物(TaKaRa,日本)和M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega,美國)合成第一條cDNA鏈；按照SMARTTMRACE cDNA Amplification擴(kuò)增試劑盒(TaKaRa,日本)說明書，合成5′RACE和3′RACE cDNA。分別提取斑鱧成魚各個(gè)組織、性腺發(fā)育時(shí)期、對(duì)照組與激素處理組的性腺組織RNA，采用ReverTra Ace qPCR RT試劑盒(Toyobo,日本)將各RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA樣品，-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 斑鱧Foxl2 cDNA的全長克隆及序列分析 根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期完成的斑鱧轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[19]，獲得預(yù)測的斑鱧Foxl2基因序列，利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)上、下游引物Foxl2-F1和Foxl2-R1，以斑鱧成魚卵巢cDNA為模板，擴(kuò)增獲得Foxl2基因的部分序列；再以合成的5′RACE和3′RACE cDNA為模板，根據(jù)所得部分序列設(shè)計(jì)5′RACE和3′RACE的上、下游引物，PCR擴(kuò)增獲得Foxl2基因的5′UTRs和3′UTRs；最后將所得Foxl2的部分序列與5′UTRs和3′UTRs拼接后，設(shè)計(jì)上、下游特異性引物Foxl2-F2和Foxl2-R2，進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證。PCR反應(yīng)體系(20 μL):2×Taq-Master Mix 10 μL(CWBio，北京)，10 μmol/L上、下游引物各0.8 μL，500 ng/μL cDNA模板0.5 μL，ddH2O 7.9 μL。反應(yīng)條件：94 ℃下預(yù)變性2 min；94 ℃下變性30 s，55 ℃下退火30 s，72 ℃下延伸90 s，共進(jìn)行39個(gè)循環(huán)；最后在72 ℃下再延伸10 min，4 ℃下保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測后，根據(jù)Gel Extraction Kit(Omega,美國)對(duì)目的條帶進(jìn)行純化回收。回收的PCR產(chǎn)物與pMD19-T載體(TaKaRa,日本)連接后，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5α(TaKaRa,日本)。在含氨芐的LB固體培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)12 h，將篩選的陽性克隆測序。經(jīng)測序驗(yàn)證，獲得Foxl2 cDNA全長序列。所用引物見表1。

表1 基因克隆和qRT-PCR引物Tab.1 Primers for gene cloning and qRT-PCR

通過Sequence Manipulation Suite(SMS)(http://www.bio-soft.net/sms/)分析斑鱧Foxl2基因的核苷酸和氨基酸序列，使用簡單模塊化體系結(jié)構(gòu)研究工具(SMART)(http://www.bio-soft.net/sms/)預(yù)測蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域特征；通過NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中的BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)對(duì)斑鱧與其他物種的Foxl2 ORF氨基酸序列進(jìn)行同源比對(duì)，并通過ClustalX 2.1(http://www.ebi.ac.uk/tools/clustalx2.1)序列進(jìn)一步進(jìn)行多重比對(duì)分析；采用MEGA 5.0(http://www.megasoftware.net/)軟件中的鄰近連接法(Neighbor-Joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，采用自展法(Bootstrap)1 000次來檢驗(yàn)樹中各節(jié)點(diǎn)的置信度。

1.2.4 斑鱧Foxl2基因的組織表達(dá) 根據(jù)所得斑鱧Foxl2 cDNA序列，設(shè)計(jì)跨內(nèi)含子的上、下游特異性引物，以成魚各組織和不同發(fā)育時(shí)期性腺組織cDNA為模板，以β-actin(GenBank登錄號(hào):KX655845)及EF1α基因(GenBank登錄號(hào):KY427701)[21]作為內(nèi)參基因(表1)，利用Applied Biosystems Step One Plus Real-Time PCR System(ABI,美國)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)。根據(jù)兩種內(nèi)參基因所得Ct值求其平均值，并作為平均內(nèi)參值，再與目的基因Ct值進(jìn)行計(jì)算，采用2-△△Ct方法計(jì)算Foxl2的相對(duì)表達(dá)量。組織表達(dá)分析時(shí)，以雄魚鰓組織的表達(dá)水平作為PCR的基線(1.0)，不同組織相對(duì)表達(dá)量為相對(duì)于鰓中表達(dá)的比率；發(fā)育時(shí)期表達(dá)分析時(shí)，以雌魚出膜45 d的卵巢表達(dá)水平作為PCR的基線(1.0)，不同發(fā)育時(shí)期性腺的相對(duì)表達(dá)量為相對(duì)于45 d卵巢表達(dá)的比率。同時(shí)，以對(duì)照組、EE2和MT處理24、48、72、96、120、144 h的性腺組織cDNA為模板，以β-actin及EF1α作為內(nèi)參基因，檢測對(duì)照組、EE2處理組和MT處理組的表達(dá)情況，采用2△△Ct方法計(jì)算Foxl2的相對(duì)表達(dá)量。

qRT-PCR反應(yīng)體系(20 μL)：SYRB Green Ⅰ(Toyobo,日本)10 μL，10 μmol/L正、反向引物各0.8 μL，500 ng/μL cDNA 1 μL，ddH2O 7.4 μL。每個(gè)試驗(yàn)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)。擴(kuò)增程序：94 ℃下預(yù)變性2 min；94 ℃下變性15 s，60 ℃下退火30 s，72 ℃下延伸30 s，共進(jìn)行36個(gè)循環(huán)。熔解曲線程序：94 ℃下反應(yīng)15 s，60 ℃下反應(yīng)30 s，94 ℃下反應(yīng)15 s。

1.2.5 斑鱧血清中雌性激素(E)總含量測定 利用酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測不同發(fā)育時(shí)期雌、雄斑鱧血清中E的含量，具體操作參考試劑盒(貨號(hào)ml003454，96T)說明書。采用MultiskanTMFC酶標(biāo)儀(Thermo Fisher,美國)在450 nm波長下測定吸光度(OD值)，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得出公式并計(jì)算各樣品中E的含量。雌激素檢測試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.2.6 細(xì)胞定位分析 取出用波恩氏液固定的雌、雄斑鱧性腺組織標(biāo)本保存于75%乙醇中，用由低到高濃度梯度乙醇脫水，用二甲苯透明，浸蠟后進(jìn)行石蠟包埋，5 μm厚度連續(xù)切片。組織切片經(jīng)二甲苯脫蠟后，放入0.01 mol/L pH 6.0檸檬酸鈉緩沖液(Sigma,美國)中，微波抗原修復(fù)15 min；滴加體積分?jǐn)?shù)為5%的牛血清，置于37 ℃下濕盒中封閉15 min；濾紙吸去血清后，直接滴加斑鱧Foxl2多克隆抗體(PBS稀釋比例為1∶50)，37 ℃下孵育1 h，陰性對(duì)照用未免疫兔血清代替一抗；PBS反復(fù)洗脫后，滴加HRP Goat Anti-Rabbit二抗(PBS稀釋比例為1∶2 000)，37 ℃下孵育30 min；用PBST和PBS分別洗脫3次，每次5 min；DAB(Millipore,美國)顯色后，用蘇木素進(jìn)行復(fù)染，常規(guī)洗脫后封片，最后利用倒置熒光成像系統(tǒng)(Nikon Ri2,日本)進(jìn)行顯微觀察與拍照。一抗斑鱧Foxl2多克隆抗體根據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶亞熱帶水產(chǎn)資源利用與養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供的蛋白質(zhì)序列，人工合成目的基因插入表達(dá)載體，由武漢戴安生物技術(shù)有限公司制備完成，經(jīng)過Western blot驗(yàn)證，抗體特異性良好。HRP Goat Anti-Rabbit二抗購自美國賽默飛公司。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2019軟件對(duì)qRT-PCR和血清中雌性激素總含量的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±S.E.)表示。使用SPSS 24.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 斑鱧Foxl2基因序列分析

克隆得到斑鱧Foxl2基因的cDNA序列全長為1 939 bp(GenBank登錄號(hào):MW574989)，包括210 bp 5′UTRs、921 bp開放閱讀框及808 bp 3′UTRs，共編碼306個(gè)氨基酸(aa)，含有2個(gè)RNA不穩(wěn)定基序(attta)和2個(gè)多聚腺苷酸序列(aataa)，F(xiàn)orkhead domain區(qū)域位于47 aa～135 aa處(圖1)。

起始密碼子(ATG)和終止密碼子(TAA)用加粗字體表示；RNA不穩(wěn)定基序(attta)用下劃波浪線表示；多聚腺苷酸(aataa)用下劃直線表示；陰影部分氨基酸序列是Forkhead domain區(qū)域。The translation initiation codon (ATG)and the termination codon (TAA)are shown in bold；The motif (attta)associated RNA instability is shown as wavy line;Poly-adenylation signal sequence (aataa)is shown as underline;Forkhead domain is indicated with grey background.圖1 斑鱧Foxl2基因的核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide and deduced amino acid sequences of the Foxl2 gene in blotched snakehead Channa maculata

與其他物種Foxl2氨基酸序列同源性比對(duì)顯示(圖2)，斑鱧Foxl2氨基酸序列與硬骨魚類具有同源性，其中，與烏鱧Channaargus氨基酸序列一致性達(dá)到99.67%，與大黃魚Larimichthyscrocea、尼羅羅非魚、青鳉Oryziaslatipes、黃鱔Monopterusalbus的序列一致性達(dá)到90%以上，與熱帶爪蟾Xenopustropicalis、斑馬魚Daniorerio(Foxl2a)、雞Gallusgallus的序列一致性達(dá)到80%以上，與人類Homosapiens、小鼠Masmusculus、牛Bostaurus等哺乳動(dòng)物的序列一致性分別為56.38%、58.09%、55.82%。

方框?yàn)椴骖^框區(qū)域；黑色序列代表一致性為100%，灰色序列代表一致性為80%。Forkhead domain is expressed in box;the black shade represents 100% identity,and dark gray represents 80% identity.圖2 斑鱧與其他物種Foxl2氨基酸的多重序列比對(duì)Fig.2 Multiple alignments of Foxl2 amino acid sequence between blotched snakehead Channa maculata and other species

采用MEGA 5.0軟件以鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖3所示，系統(tǒng)進(jìn)化樹可分為4個(gè)大支，其中，硬骨魚類Foxl2氨基酸序列聚為一支，斑鱧Foxl2與烏鱧的親緣關(guān)系最近，然后與兩棲類聚為一支，與鳥類、哺乳類的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示，斑鱧Foxl2的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系與傳統(tǒng)物種進(jìn)化地位基本一致。

圖3 斑鱧與其他物種Foxl2氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of Foxl2 amino acid sequences in blotched snakehead Channa maculata and other species

2.2 Foxl2 mRNA在斑鱧成魚組織中的表達(dá)分布

通過qRT-PCR技術(shù)，檢測1齡斑鱧雌魚、雄魚各組織中Foxl2基因的表達(dá)情況。從圖4可見：Foxl2在斑鱧卵巢中的表達(dá)量最高且極顯著高于精巢(P<0.01)；在鰓和腦中均有表達(dá)，其中雄魚鰓中的表達(dá)量顯著高于雌魚(P<0.05)，雄魚腦中的表達(dá)量極顯著高于雌魚(P<0.01)；在其他組織中幾乎不表達(dá)。

內(nèi)參基因?yàn)棣?actin和EF1α，以雄魚鰓中的表達(dá)量作為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行倍數(shù)統(tǒng)計(jì)；*表示雌雄個(gè)體間有顯著性差異(P<0.05)；**表示雌雄個(gè)體間有極顯著性差異(P<0.01)，下同。Reference genes are β-actin and EF1α,from the calibrator group，expression level in the gill of male;* the difference between male and female is very significant (P<0.05)，** there is very significant difference between male and female (P<0.01)，et sequentia.圖4 Foxl2基因在斑鱧各組織中的表達(dá)Fig.4 Expression level of Foxl2 gene in various tissues of blotched snakehead Channa maculata

2.3 Foxl2 mRNA在不同發(fā)育時(shí)期性腺中的表達(dá)

從圖5可見：在不同發(fā)育時(shí)期，F(xiàn)oxl2在斑鱧卵巢中的表達(dá)量大多顯著高于精巢(P<0.05)，僅在出膜45、165 d時(shí)稍低于精巢(P>0.05);在雌性個(gè)體中，隨著性腺發(fā)育時(shí)期的延長卵巢中Foxl2的表達(dá)先上升，在出膜105 d時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高且極顯著高于精巢(P<0.01)，此時(shí)Foxl2雌性表達(dá)量約為雄性的117.41倍，隨后緩慢下降至稍高于起始水平；在雄性個(gè)體中，精巢中Foxl2的表達(dá)量在出膜75 d時(shí)達(dá)到最高水平且極顯著低于卵巢(P<0.01)，隨后下降至105 d時(shí)的最低水平，然后緩慢上升，一直保持較低水平的表達(dá)。

圖5 Foxl2基因在斑鱧不同發(fā)育時(shí)期性腺中的表達(dá)Fig.5 Expression level of Foxl2 gene in gonads of blotched snakehead Channa maculata during different developmental stages

2.4 Foxl2蛋白在斑鱧性腺中的表達(dá)細(xì)胞類型

為進(jìn)一步定位Foxl2蛋白在斑鱧性腺中的表達(dá)部位，采用免疫組織化學(xué)方法對(duì)出膜105 d的斑鱧精巢與卵巢進(jìn)行免疫檢測。通過組織切片發(fā)現(xiàn)，斑鱧性腺在出膜105 d時(shí)已經(jīng)完成分化，卵巢中存在卵原細(xì)胞、初級(jí)卵母細(xì)胞、成長期卵母細(xì)胞和成熟卵母細(xì)胞，且以成長期卵母細(xì)胞為主；精巢中存在精原細(xì)胞、精母細(xì)胞、精細(xì)胞和精子，且精子數(shù)量較多。在卵巢成熟卵母細(xì)胞周圍的顆粒細(xì)胞中，檢測到Foxl2蛋白的表達(dá)，呈現(xiàn)明顯較強(qiáng)的陽性信號(hào)(圖6D、E、F)，在其他細(xì)胞中未檢測到信號(hào)；在精巢所有細(xì)胞中都未檢測到Foxl2蛋白的表達(dá)信號(hào)(圖6J、K，L)；此外，斑鱧卵巢(圖6A、B、C)與精巢(圖6G、H、I)的陰性對(duì)照中均未檢測到陽性信號(hào)。

A～F、G～L分別為卵巢、精巢的免疫組化圖；A～C、G～I(xiàn)為陰性對(duì)照圖。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ分別為卵原細(xì)胞、初級(jí)卵母細(xì)胞、生長期卵母細(xì)胞和成熟卵母細(xì)胞；棕色為陽性信號(hào)(圖中箭頭所指位置)。A-F and G-L are the immunohistochemical map of ovary and testis,respectively;A-C and G-I are the negative control map.Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ and Ⅳ represent the oogonia and the early primary oocytes,growing oocytes and mature oocytes,respectively;Brown is the positive signal(the position indicated by the arrow).圖6 Foxl2蛋白在斑鱧性腺中的表達(dá)部位Fig.6 Location of Foxl2 protein in gonads of blotched snakehead Channa maculata

2.5 不同發(fā)育時(shí)期斑鱧血清中雌性激素總含量變化

從圖7可見：在不同發(fā)育時(shí)期，雌性個(gè)體血清中雌性激素總含量總體上高于雄性，血清中E水平呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，但在出膜45、165 d時(shí)，雄性個(gè)體血清中E含量分別高于雌性，這與性腺不同發(fā)育時(shí)期卵巢中Foxl2基因的表達(dá)相似；出膜105 d時(shí)，雌性斑鱧血清中的E含量達(dá)到最高且極顯著性高于雄性個(gè)體(P<0.01)。

圖7 雌、雄斑鱧血清中雌性激素(E)的含量Fig.7 Contents of serum estrogen in female and male blotched snakehead Channa maculata

2.6 EE2、MT處理對(duì)性腺中Foxl2表達(dá)的影響

以對(duì)照組Foxl2基因表達(dá)量為參照，分析EE2和MT處理24、48、72、96、120、144 h后，75日齡斑鱧雌、雄性腺中Foxl2的表達(dá)(圖8)。

*表示與對(duì)照組有顯著性差異(P<0.05)；**表示與對(duì)照組有極顯著性差異(P<0.01)。* means significant difference compared with the control(P<0.05)；** means very significant difference compared with the control(P<0.01).圖8 EE2、MT對(duì)雌、雄斑鱧性腺中Foxl2表達(dá)的影響Fig.8 Effects of EE2 and MT on the expression level of Foxl2 in gonads of female and male blotched snakehead Channa maculata

從圖8(a)可見：在雌性斑鱧中，注射EE2和MT后，卵巢中Foxl2的表達(dá)受到抑制，EE2處理組的Foxl2表達(dá)先緩慢上升,72 h時(shí)達(dá)到最高峰，隨后下降至初始表達(dá)水平，MT處理組的Foxl2表達(dá)呈現(xiàn)波動(dòng)變化，但其表達(dá)量總體低于對(duì)照組；注射EE2和MT后144 h內(nèi)，F(xiàn)oxl2的表達(dá)量總體上低于對(duì)照組，但在注射MT后96 h時(shí)，MT處理組Foxl2的表達(dá)量極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)；除此之外，120 h內(nèi)，EE2和MT處理均極顯著下調(diào)了卵巢中Foxl2 mRNA表達(dá)水平(P<0.01)。

從圖8(b)可見：在雄性斑鱧中，EE2處理組精巢中的Foxl2表達(dá)量總體上高于對(duì)照組和MT組，MT處理組的Foxl2表達(dá)量總體上低于對(duì)照組或與對(duì)照組水平持平；注射EE2后，F(xiàn)oxl2的表達(dá)顯著上升，72 h時(shí)出現(xiàn)峰值，此時(shí)EE2極顯著上調(diào)了精巢中Foxl2的表達(dá)(P<0.01)，隨后逐漸下降至對(duì)照組水平；隨著時(shí)間的變化，對(duì)照組呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢；而注射MT后，精巢中Foxl2的表達(dá)一直呈下降趨勢，最后下降至對(duì)照組水平，這說明其表達(dá)被抑制。

3 討論

3.1 Foxl2基因在斑鱧不同組織和性腺發(fā)育時(shí)期的表達(dá)變化

Foxl2基因是雌性發(fā)育過程中的一個(gè)關(guān)鍵因子。大多數(shù)硬骨魚類性腺中，F(xiàn)oxl2基因呈現(xiàn)明顯的性別二態(tài)性表達(dá)模式，并在腦和鰓組織中有不同程度地表達(dá)[10，22-25](表2)。

表2 不同魚類中Foxl2基因的組織表達(dá)比較Tab.2 Comparison of expression of Foxl2 gene in tissues of different fishes

本研究表明，F(xiàn)oxl2基因在斑鱧卵巢中高度特異性表達(dá)，其mRNA表達(dá)水平極顯著高于精巢，說明Foxl2在斑鱧中的表達(dá)和其他魚類一樣，表現(xiàn)出明顯的性別二態(tài)性。同時(shí)，本試驗(yàn)中Foxl2在斑鱧腦和鰓組織中均有較高程度的表達(dá)，且雄魚的表達(dá)量顯著高于雌魚，這一結(jié)果與對(duì)烏鱧的研究結(jié)果完全一致；同時(shí)，該結(jié)果也與極邊扁咽齒魚Platypharodonextremus[22]和白斑狗魚Esoxlucius[25]雄魚鰓中表達(dá)量高于雌魚的結(jié)果一致。綜上所述，F(xiàn)oxl2基因可能不僅對(duì)斑鱧卵巢分化起到一定的調(diào)控作用，還可能參與腦-垂體-性腺軸的調(diào)節(jié)。對(duì)網(wǎng)紋石斑魚Epinephelusmerra[26]、三斑海豬魚Halichoerestrimaculatus[4]的研究也得出相似的結(jié)果。此外，本研究中斑鱧鰓中Foxl2的表達(dá)水平較高，推測與鰓的發(fā)育有關(guān)，該部分內(nèi)容尚需進(jìn)一步研究。

Foxl2蛋白主要表達(dá)于青鳉雌性發(fā)育性腺中的體細(xì)胞；成體中，F(xiàn)oxl2蛋白定位在卵巢卵泡細(xì)胞，包括顆粒細(xì)胞、鞘膜細(xì)胞和卵母細(xì)胞周圍的體細(xì)胞[11,27]。對(duì)革胡子鲇[12]、黃鱔Monopterusalbus[28]和尼羅羅非魚[13]的研究證實(shí)，F(xiàn)oxl2蛋白的表達(dá)僅限于顆粒細(xì)胞，而在卵母細(xì)胞中不表達(dá)；對(duì)烏鱧成熟性腺中Foxl2蛋白定位發(fā)現(xiàn)，在卵母細(xì)胞周圍的顆粒細(xì)胞中檢測到Foxl2蛋白表達(dá)，這與對(duì)早期性腺的研究結(jié)果一致[23]。本研究中，斑鱧Foxl2蛋白主要在成熟卵母細(xì)胞周圍的顆粒細(xì)胞中表達(dá)，而在卵母細(xì)胞中不表達(dá)。這與對(duì)黃鱔、青鳉、烏鱧的研究結(jié)果相同，推測Foxl2可能對(duì)斑鱧卵細(xì)胞維持具有重要作用。

對(duì)尼羅羅非魚[13]和刀鱭Coilianasus[29]的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxl2基因在卵巢發(fā)育早期開始表達(dá)，隨著卵巢的發(fā)育，其表達(dá)量逐漸增加，在卵巢發(fā)育后期Foxl2的表達(dá)量逐漸降低；對(duì)青鳉的研究表明，F(xiàn)oxl2表達(dá)量在卵巢發(fā)育初期至接近成熟期略微升高[11]；在出膜49 d的大黃魚卵巢中，F(xiàn)oxl2基因開始持續(xù)高表達(dá)，隨后在出膜123 d之后下降至高于起始表達(dá)水平，精巢中，前期Foxl2表達(dá)量處于較低水平，出膜84 d時(shí)表達(dá)量有所上升，隨后下降至較低水平的表達(dá)，其表達(dá)量始終遠(yuǎn)低于卵巢[30]；在金錢魚Scatophagusargus[31]精巢中，F(xiàn)oxl2的表達(dá)量在起始達(dá)到最大值后，隨后出現(xiàn)較低表達(dá)甚至不表達(dá)。本研究表明，在斑鱧性腺發(fā)育過程中，F(xiàn)oxl2的表達(dá)量同樣存在上述時(shí)空差異性，F(xiàn)oxl2基因在卵巢發(fā)育過程中持續(xù)上升表達(dá)，在出膜105 d時(shí)，卵巢中以成長期卵母細(xì)胞為主，處于卵巢發(fā)育的第Ⅲ期，此時(shí)Foxl2的表達(dá)量達(dá)到最高；隨著卵巢的發(fā)育，接近成熟期時(shí)，即卵巢中以成熟卵母細(xì)胞為主，處于卵巢發(fā)育的第Ⅳ期，F(xiàn)oxl2表達(dá)量逐漸降低，出膜365 d時(shí)下降至稍高于起始表達(dá)水平；精巢中Foxl2的表達(dá)量顯著低于卵巢，其表達(dá)呈現(xiàn)波動(dòng)變化且一直維持較低水平的表達(dá)。由此推測，該基因可能在斑鱧卵巢中起促進(jìn)卵母細(xì)胞成長成熟的作用。

3.2 斑鱧血清中雌性激素總含量的變化

雌激素是一種由內(nèi)分泌系統(tǒng)產(chǎn)生的多效性類固醇激素，在脊椎動(dòng)物中的作用主要是促進(jìn)性腺的發(fā)育和生殖細(xì)胞的成熟。周惠強(qiáng)[32]對(duì)大刺鰍Mastacembelusarmatus研究發(fā)現(xiàn)，雌、雄魚血清中雌性激素含量隨著性腺發(fā)育逐漸增加，第Ⅴ期時(shí)達(dá)到最大值，成熟期(第Ⅵ期)開始下降至較低水平；何飛祥[33]研究發(fā)現(xiàn)，在金錢魚性腺發(fā)育過程中，雌魚中雌激素水平整體比雄魚高，雌魚雌激素水平從Ⅱ期至Ⅳ期逐漸增加，而雄魚血清中雌激素含量從Ⅲ期至Ⅳ期呈現(xiàn)上升的趨勢，兩者均在Ⅳ期達(dá)到最大值后出現(xiàn)下降；閆浩[34]對(duì)灘頭雅羅魚Tribolodonbrandti研究顯示，雌魚血清中雌性激素含量隨卵巢的發(fā)育而不斷升高，雄魚血清中雌激素含量總體上低于雌性，兩者均在第Ⅳ期達(dá)到峰值，到達(dá)成熟期后呈下降趨勢。本研究中，斑鱧雌性激素水平的變化與上述研究結(jié)果類似，雌、雄魚血清中雌性激素水平呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，且雌性個(gè)體血清中的雌性激素含量整體高于雄性，隨著性腺的發(fā)育，在卵巢發(fā)育的第Ⅲ期(出膜105 d)，雌雄魚血清中雌性激素總含量均達(dá)到最高，且雌魚血清中雌性激素總含量極顯著高于雄性個(gè)體，到達(dá)成熟期第Ⅳ期后，雌性個(gè)體中的激素水平則逐漸下降，推測雌性激素在斑鱧雌魚的性腺發(fā)育和維持性別特征方面發(fā)揮著重要作用[35]。

3.3 外源性激素對(duì)斑鱧Foxl2基因表達(dá)的影響

外源性類固醇激素一般用來探究對(duì)性別相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)節(jié)作用以及獲得性逆轉(zhuǎn)個(gè)體。本研究中，外源性類固醇激素的注射可以引起斑鱧Foxl2在雌、雄魚性腺中的表達(dá)變化，說明Foxl2可能是通過響應(yīng)類固醇激素調(diào)節(jié)調(diào)控斑鱧性腺的分化和發(fā)育。本研究中發(fā)現(xiàn)，雄性個(gè)體中EE2處理后Foxl2 mRNA的表達(dá)水平被上調(diào)，MT處理后則下調(diào)。Foxl2是雌性高表達(dá)基因，EE2處理后雄性Foxl2的表達(dá)出現(xiàn)上調(diào)，說明雌激素促進(jìn)了雄魚中Foxl2的表達(dá)，這與對(duì)虹鱒[36]、稀有鮈鯽[16]、黃顙魚Pelteobagrusfulvidraco[37]的研究結(jié)果一致。在雌性斑鱧中，EE2和MT均抑制Foxl2的表達(dá)，這與南方鲇[17]、稀有鮈鯽[38]中EE2促進(jìn)Foxl2表達(dá)的研究結(jié)果相悖。李國超[39]在探究不同濃度雌二醇處理對(duì)斑馬魚雌性相關(guān)基因的表達(dá)影響中推測，外源激素濃度過高，會(huì)抑制內(nèi)源激素的分泌，從而影響雌性相關(guān)基因的表達(dá)；朱陽陽等[40]利用不同濃度雌二醇處理雄性大黃魚的研究結(jié)果與其類似。因此，推測注射EE2后，雌性體內(nèi)雌激素過高，通過負(fù)反饋機(jī)制抑制了雌性斑鱧內(nèi)源雌激素的分泌，故而雌性斑鱧中Foxl2的表達(dá)也受到抑制。呂晴霽[41]對(duì)出膜90 d的斜帶石斑魚研究發(fā)現(xiàn)，投喂MT后，F(xiàn)oxl2的表達(dá)量較對(duì)照組出現(xiàn)了下降；李廣麗等[42]對(duì)出膜18 d的胡子鲇Clariasfuscus研究表明，MT處理后，下調(diào)了Foxl2 mRNA的表達(dá)水平，這與對(duì)斑鱧的研究結(jié)果一致。

4 結(jié)論

1)Foxl2基因在斑鱧性腺中的表達(dá)模式呈現(xiàn)明顯的性別二態(tài)性，且其表達(dá)量隨著卵巢發(fā)育時(shí)期變化，這說明Foxl2基因在斑鱧卵母細(xì)胞成長成熟和維持卵巢正常發(fā)育過程中起重要作用。

2)外源性激素EE2促進(jìn)斑鱧精巢中Foxl2的表達(dá)，MT抑制Foxl2的表達(dá)，說明Foxl2可響應(yīng)性類固醇激素的調(diào)節(jié)，推測Foxl2基因在斑鱧性別分化與性腺發(fā)育中起重要作用，但需要進(jìn)一步研究予以證實(shí)。

3)Foxl2蛋白主要在斑鱧成熟卵母細(xì)胞周圍的顆粒細(xì)胞中表達(dá)，推測Foxl2可能通過顆粒細(xì)胞對(duì)生殖細(xì)胞發(fā)揮作用。