子癇前期患者胎盤組織中微RNA-210和Foxp3的表達(dá)及臨床意義

張 澍，王春延，忽 平，姚 利

(南陽(yáng)市中心醫(yī)院/鄭州大學(xué)附屬南陽(yáng)中心醫(yī)院婦產(chǎn)科，河南 南陽(yáng) 473000)

子癇前期(preeclampsia,PE)為妊娠期高血壓疾病的一種類型，多在懷孕20周以后發(fā)生，臨床多表現(xiàn)為血壓升高、蛋白尿等，臨床癥狀隨著孕周增加而逐步加重。PE可進(jìn)一步發(fā)展為重度PE甚至子癇，嚴(yán)重影響母嬰健康，是孕產(chǎn)婦及圍生兒死亡的主要原因[1]。PE的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，其發(fā)生與血管、遺傳、免疫及環(huán)境等因素有關(guān)[2-3]。PE患者易出現(xiàn)炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)過度激活現(xiàn)象，其原因之一為母體調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell,Treg)與輔助性T細(xì)胞(helper T cell,Th)比例失衡，從而對(duì)胎兒產(chǎn)生免疫排斥[4]。Treg細(xì)胞為炎癥免疫抑制因子，可抑制自身免疫和免疫排斥反應(yīng)，高水平的Treg細(xì)胞是成功妊娠的重要保障，Treg細(xì)胞減少可致母胎免疫耐受下降，促使PE發(fā)生，且與流產(chǎn)、早產(chǎn)等產(chǎn)科并發(fā)癥密切相關(guān)[5]。Foxp3為叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，是Treg細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，可維持Treg細(xì)胞分化及功能。Th17細(xì)胞是以分泌白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-17為特征的CD4+T細(xì)胞。Treg與Th17細(xì)胞比例失衡可致PE患者全身性炎癥、免疫反應(yīng)[6]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，微RNA-210(microRNA-210,miR-210)主要在妊娠期表達(dá)，可經(jīng)外分泌進(jìn)入母體循環(huán)，可調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲、胎盤免疫活化及血小板聚集[7]。Foxp3為miR-210的靶基因，miR-210過表達(dá)時(shí)機(jī)體CD4+T細(xì)胞表達(dá)Foxp3下降，Treg細(xì)胞免疫抑制功能受到損傷。本研究旨在探討PE患者胎盤組織中miR-210、Foxp3表達(dá)情況，分析PE的炎癥、免疫激活的可能機(jī)制，以期為PE的病因及臨床診治提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2018年6月至2019年12月南陽(yáng)市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科收治且以剖宮產(chǎn)方式分娩的36例PE患者為PE組，選擇同期正常妊娠孕婦35例為正常妊娠組，另選擇體檢健康的未妊娠女性40例為未妊娠組。PE組和正常妊娠組對(duì)象納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)PE患者符合PE診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]；(2)均為單胎妊娠。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并高血壓、糖尿病等基礎(chǔ)疾病；(2)合并自身免疫性疾病或心血管疾?。?3)合并肝、腎等重要臟器疾??；(4)胎膜早破。PE組36例，年齡22～45(28.54±6.26)歲，體質(zhì)量指數(shù)(body mass index,BMI)21.7～38.6(28.92±5.61)kg·m-2，分娩孕周37～40(37.86±1.36)周；初產(chǎn)婦23例，經(jīng)產(chǎn)婦13例。正常妊娠組35例，年齡23～45(28.71±6.54)歲，BMI 20.5～36.3(26.53±5.30)kg·m-2，分娩孕周38～40(38.40±0.65)周；初產(chǎn)婦21例，經(jīng)產(chǎn)婦14例。未妊娠組40例，年齡23～42(27.95±6.08)歲，BMI 16.8～25.9(21.43±1.85)kg·m-2。PE組與正常妊娠組、產(chǎn)次、分娩孕周比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，PE組、正常妊娠組和未婚妊娠組受試者年齡、BMI比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有入組對(duì)象簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 外周靜脈血Treg細(xì)胞和Th細(xì)胞水平的檢測(cè)采集3組受試者晨起空腹外周靜脈血6 mL(孕婦均于臨產(chǎn)前采集血液)，肝素抗凝，4 h內(nèi)應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周靜脈血CD4+CD25+CD127-Treg細(xì)胞、CD4+Th細(xì)胞水平，計(jì)算CD4+CD25+CD127-Treg細(xì)胞與CD4+Th細(xì)胞的比值(CD4+CD25+CD127-/CD4+)。

1.2.2 血清細(xì)胞炎癥因子水平的檢測(cè)采集3組受試者晨起空腹外周靜脈血3 mL(孕婦均于臨產(chǎn)前采集血液)，3 000 r·min-1離心10 min，取上層血清，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)血清IL-6、IL-10、IL-17水平，試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)法檢測(cè)PE組和正常妊娠組孕婦胎盤組織中Foxp3 mRNA、miR-210表達(dá)胎盤娩出后，生理鹽水反復(fù)漂洗，剪取母面正中1 cm×1 cm×1 cm組織塊數(shù)塊，組織包括胎盤全層，但不包括羊膜層，采集時(shí)需要避開鈣化區(qū)、出血點(diǎn)。將組織塊置入凍存管中，每例4管，取好后立即置于液氮罐中，過夜后再置于-80 ℃冰箱保存。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)胎盤組織中Foxp3 mRNA和miR-210表達(dá)。應(yīng)用TRIzol試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司)提取總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海生工生物工程有限公司)合成cDNA，操作按說明書嚴(yán)格執(zhí)行。PCR反應(yīng)體系20 μL：0.5 μL上游引物、0.5 μL下游引物、2.0 μL cDNA、7.0 μL ddH2O、10.0 μL SYBR Green Mixture。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s，40個(gè)循環(huán)，重復(fù)3次。miR-210檢測(cè)以U6為內(nèi)參基因，F(xiàn)oxp3 mRNA檢測(cè)以3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)為內(nèi)參基因。miR-210上游引物序列為5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′，下游引物序列為5′-CTGTGCGTGTGACAGCGGCTGA-3′；U6上游引物序列為：5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′，下游引物序列為5′-TATGGTTGTTCTGCTCTCTGTCTC-3′；Foxp3上游引物序列為5′-CACTTCTGCTGTGGGTAGGT-3′，下游引物序列為5′-AAGGCAGCGGGACGATATGT-3′；GAPDH上游引物序列為5′-CCAAGAGTGATGGTGACGTC-3′，下游引物序列為5′-TCGTCGTTTGTCACCAACCTC-3′。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，采用凝膠成像系統(tǒng)(英國(guó)Syngene公司)進(jìn)行圖像分析，采用2-ΔΔCt法計(jì)算Foxp3 mRNA、miR-210的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 Western blot法檢測(cè)PE組和正常妊娠組孕婦胎盤組織中Foxp3蛋白表達(dá)取待測(cè)人胎盤組織，剪碎收集組織，加入總蛋白提取試劑，應(yīng)用超聲波細(xì)胞儀破碎組織細(xì)胞，冰上裂解30 min，12 000 r·min-1離心5 min，取上清，采用二喹啉甲酸法檢測(cè)蛋白濃度。取50 μg樣品蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，使用 Tris 洗膜緩沖液洗滌2次，每次5 min；室溫下封閉2 h；Tris洗膜緩沖液洗滌3次，每次10 min；滴加Foxp3單克隆抗體(滴度為11 000，英國(guó)Abcam公司)，4 ℃孵育過夜；Tris 洗膜緩沖液洗滌3次，每次10 min；滴加二抗(12 000，英國(guó)Abcam公司)，室溫下孵育2 h；Tris 洗膜緩沖液洗滌3次；每次 10 min；滴加超敏增強(qiáng)化學(xué)液進(jìn)行顯影，拍照，保存圖片。應(yīng)用GDS8000型凝膠成像分析系統(tǒng)(美國(guó)UVP公司)掃描蛋白質(zhì)條帶，以GAPDH為內(nèi)參蛋白，測(cè)定目的條帶的吸光度值。Foxp3蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白條帶吸光度值/內(nèi)參蛋白條帶吸光度值。

2 結(jié)果

2.1 3組受試者外周靜脈血CD4+CD25+CD127-/CD4+水平比較PE組、正常妊娠組與未妊娠組受試者外周靜脈血CD4+CD25+CD127-/CD4+分別為(6.72±0.31)%、(8.92±0.37)%、(8.85±0.34)%，3組受試者外周靜脈血CD4+CD25+CD127-/CD4+水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=491.260，P<0.001)。PE組受試者外周靜脈血CD4+CD25+CD127-/CD4+顯著低于正常妊娠組和未妊娠組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=27.136、28.581，P<0.05)；正常妊娠組與未妊娠組受試者外周靜脈血CD4+CD25+CD127-/CD4+比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.849，P>0.05)。

2.2 3組受試者血清IL-6、IL-10和IL-17水平比較結(jié)果見表1。3組受試者血清IL-6、IL-10、IL-17水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=53.584、133.925、42.392，P<0.05)。PE組受試者血清IL-6水平顯著高于正常妊娠組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.170，P<0.05)；正常妊娠組受試者血清IL-6水平顯著低于未妊娠組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.844，P<0.05)；PE組與未妊娠組受試者血清IL-6水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.608，P>0.05)。PE組受試者血清IL-10水平顯著低于正常妊娠組和未妊娠組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=14.929、4.892，P<0.05)；正常妊娠組受試者血清IL-10水平顯著高于未妊娠組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.914，P<0.05)。PE組受試者血清IL-17水平顯著高于正常妊娠組和未妊娠組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.184、3.038，P<0.05)；正常妊娠組受試者血清IL-17水平顯著低于未妊娠組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.325，P<0.05)。

表1 3組受試者血清IL-6、IL-10和IL-17水平比較

2.3 PE組和正常妊娠組受試者胎盤組織中Foxp3 mRNA和miR-210相對(duì)表達(dá)量比較結(jié)果見表2。PE組受試者胎盤組織中Foxp3 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著低于正常妊娠組，miR-210相對(duì)表達(dá)量顯著高于正常妊娠組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=13.948、16.565，P<0.05)。

表2 PE組和正常妊娠組受試者胎盤組織中Foxp3 mRNA和miR-210相對(duì)表達(dá)量比較

2.4 PE組和正常妊娠組受試者胎盤組織中Foxp3蛋白相對(duì)表達(dá)量比較PE組和正常妊娠組受試者胎盤組織中Foxp3蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.97±0.11、1.38±0.18，PE組受試者胎盤組織中Foxp3蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著低于正常妊娠組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=11.625，P<0.05)。

3 討論

PE早期患者臨床癥狀不明顯，多表現(xiàn)為輕度血壓升高、蛋白尿及水腫[9]；隨著病情進(jìn)展，患者可出現(xiàn)惡心、嘔吐及明顯的血壓升高和蛋白尿等，甚者發(fā)生抽搐、昏迷，可危及生命[10]。

PE的誘因?yàn)槟阁w免疫系統(tǒng)對(duì)滋養(yǎng)層父系來源的抗原異常反應(yīng)。胚胎生長(zhǎng)的重要因素之一為免疫耐受，母體對(duì)胚胎所產(chǎn)生的免疫耐受無法滿足生長(zhǎng)要求是PE發(fā)病機(jī)制之一[11]。CD4+CD25+Treg細(xì)胞具有抑制機(jī)體免疫功能的作用，在免疫耐受中承擔(dān)著重要作用，可維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，抑制機(jī)體對(duì)異體物質(zhì)的排斥[12-13]。Foxp3屬于叉頭轉(zhuǎn)錄因子家族，僅在CD4+CD25+Treg細(xì)胞中表達(dá)，同時(shí)，CD4+CD25+Treg細(xì)胞會(huì)受到Foxp3基因及其轉(zhuǎn)錄蛋白質(zhì)的特異性作用[14]。正常狀態(tài)下，妊娠早期CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞明顯增多，到中期稍微下降，分娩后則明顯減少；然而，PE患者CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞明顯減少，且與PE病情嚴(yán)重程度密切相關(guān)[15]。本研究結(jié)果顯示，PE組受試者外周靜脈血CD4+CD25+CD127-/CD4+顯著低于正常妊娠組和未妊娠組，正常妊娠組與未妊娠組受試者外周靜脈血CD4+CD25+CD127-/CD4+比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；提示PE患者存在Treg細(xì)胞減少，母體對(duì)胎兒所產(chǎn)生的免疫耐受無法滿足生長(zhǎng)要求可能與此變化有關(guān)。

當(dāng)機(jī)體無炎癥損傷時(shí)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)可抑制效應(yīng)T細(xì)胞形成，誘導(dǎo)Foxp3+Treg細(xì)胞產(chǎn)生，以維持自身耐受能力[16]；然而，當(dāng)機(jī)體天然免疫系統(tǒng)被炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)激活后，其產(chǎn)生的IL-6可抑制TGF-β1誘導(dǎo)Treg細(xì)胞產(chǎn)生這一過程，同時(shí)可誘導(dǎo)促炎性T細(xì)胞(以Th17細(xì)胞為主)產(chǎn)生[17]。本研究結(jié)果顯示，PE組受試者血清IL-6水平顯著高于正常妊娠組，正常妊娠組受試者血清IL-6水平顯著低于未妊娠組；PE組受試者血清IL-17水平顯著高于正常妊娠組和未妊娠組，正常妊娠組受試者血清IL-17水平顯著低于未妊娠組；PE組受試者血清IL-10水平顯著低于正常妊娠組和未妊娠組，正常妊娠組受試者血清IL-10水平顯著高于未妊娠組；說明孕婦血清炎癥因子會(huì)因妊娠發(fā)生改變，相比于未妊娠者，孕婦血清IL-6、IL-17水平明顯降低，IL-10水平明顯升高；而當(dāng)孕婦發(fā)生PE時(shí)，血清IL-6、IL-17水平明顯升高，IL-10水平明顯降低，提示炎癥反應(yīng)參與了PE的發(fā)生及進(jìn)展。此外，本研究結(jié)果顯示，PE組受試者胎盤組織中Foxp3 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著低于正常妊娠組，miR-210相對(duì)表達(dá)量顯著高于正常妊娠組，PE組受試者胎盤組織中Foxp3蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著低于正常妊娠組；說明PE患者胎盤組織中Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Foxp3 mRNA表達(dá)顯著減低，提示Treg/Th17失衡，其可能導(dǎo)致母體對(duì)胎兒的免疫耐受遭到破壞。

綜上所述，PE患者Treg細(xì)胞顯著減少，Treg/Th17細(xì)胞失衡，引起母體對(duì)胎兒的免疫耐受遭到破壞；胎盤組織中Foxp3表達(dá)水平下降可能與miR-210表達(dá)升高有關(guān)，但仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。