基于網(wǎng)絡(luò)毒理學探討蒼耳子的毒性機制※

陳 珂 樊黎麗 侯超峰 杜一杰 孟義人 孟 泳▲

蒼耳子（xanthii Fructus），始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，是菊科植物的成熟帶總苞果實，其味苦、辛，性溫，歸肺經(jīng)，有毒，具有通鼻竅、除濕止痛、祛風散寒之功效，主要用于治療鼻淵、風寒頭痛以及濕痹等病證[1-4]。其成分復(fù)雜，主要包括酚酸類、木脂素類、黃酮類以及氨基酸類等[5-9]?，F(xiàn)代藥理學研究[10-12]表明，其成分具有抗過敏、抗炎、抑菌以及抗腫瘤等作用，但其毒性也不容忽視?！侗静萜穮R精要》《本草新編》等中醫(yī)古籍也記載，蒼耳子有毒?，F(xiàn)代臨床與毒理學研究[13-15]表明，蒼耳子的毒性成分主要是蒼術(shù)苷、羥基蒼術(shù)苷、毒蛋白、倍半萜內(nèi)酯類、氫醌以及羧基蒼術(shù)酸鉀等，其產(chǎn)生毒性的主要機制是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、膽汁淤積、線粒體損傷，此外還會抑制ADP∕ATP 對蛋白質(zhì)在體內(nèi)的轉(zhuǎn)運，影響機體代謝并具有肝腎毒性等[14-18]。蒼耳子對機體的毒性作用并非單一途徑，而是多條途徑、多靶點共同作用的結(jié)果。蒼耳子的主要毒性表現(xiàn)在應(yīng)用中患者出現(xiàn)惡心、嘔吐、心悸、呼吸困難，甚者出現(xiàn)實質(zhì)性臟器損傷，其中尤以肝腎損傷較為嚴重[19-22]，可導(dǎo)致死亡。蒼耳子作為中藥，具有多成分、多靶點的特征，難以用單一角度去解釋其毒理作用。其使用要注意炮制、服用劑量以及服用周期等[23]。

本研究采用網(wǎng)絡(luò)毒理學[24]的方法，通過構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)模型，從多角度對其毒理作用機制進行了研究，以期更好地指導(dǎo)臨床合理應(yīng)用蒼耳子。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫及軟件工具中國系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫與分析平臺[25]（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，www.tcmspw.com∕tcmsp.php）、Uniprot數(shù)據(jù)庫[26]（www.uniport.org）、比較毒物基因組學數(shù)據(jù)庫[27]（Comparative Toxicogenomics Database，CTD，http：∕∕ctdbase.org∕）、Pub Chem 數(shù)據(jù)庫（https：∕∕pubchem.ncbi.nlm.nih.gov∕）、Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫[28]（http：∕∕www.swisstargetprediction.ch∕）、STRING 數(shù)據(jù)庫[29]（https：∕∕string-db.org∕）、生物學信息注釋數(shù)據(jù)庫[30-31]（The Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery，DAVID 6.8，https：∕∕david.ncifcrf.gov∕）以及cytoscape 軟件（version 3.7.2）。

1.2 蒼耳子成分篩選TCMSP是基于系統(tǒng)藥理學的研究方法，對藥物化學、藥物代謝動力學以及藥物-成分-靶標網(wǎng)絡(luò)-疾病網(wǎng)絡(luò)進行整合的分析數(shù)據(jù)庫。CTD數(shù)據(jù)庫提供了影響人類化合物的數(shù)據(jù)信息，首先為全球研究人員提供了不同類型分子和生物體的毒理學數(shù)據(jù)。從TCMSP 中獲取蒼耳子目前已知的成分，進一步根據(jù)生物利用度（OB≥30%）、類藥性（DL≥0.18）獲得符合要求的化合物。通過CTD 數(shù)據(jù)庫將TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選出的蒼耳子的成分進行查詢，獲得蒼耳子的有毒化合物。

1.3 毒性化合物的候選靶點選取Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫是一個根據(jù)化合物的2 D和3 D結(jié)構(gòu)精準預(yù)測化合物作用靶點信息的數(shù)據(jù)庫。使用PubChem 數(shù)據(jù)庫查詢從CTD 數(shù)據(jù)庫中獲得的有毒化合物，將化合物的Canonical SMILES 輸入Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫中，限定物種為人，得到靶點蛋白與Uniprot ID。使用uniprot數(shù)據(jù)庫的Uniprot KB功能，得到靶點基因，將其作為TCMSP 數(shù)據(jù)庫已獲得靶點的補充。

1.4 毒性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建獲得蒼耳子的毒性成分及其相關(guān)靶點后，構(gòu)建毒性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)。并使用Cytoscape 3.7.2軟件使其可視化。

1.5 靶點蛋白網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interaction，PPI）構(gòu)建使用STRING 數(shù)據(jù)庫，將蒼耳子的有毒成分與成分相對應(yīng)的靶點導(dǎo)入其中。選擇人作為其物種，獲得靶點蛋白網(wǎng)絡(luò)關(guān)系互作圖，保存其TSV格式，保存其格式中的node 1、node 2與Combined score。導(dǎo)入cytoscape 3.7.2，并進一步調(diào)整節(jié)點和相連線段的大小與顏色以反映度值（degree）的大小，以獲取PPI。

1.6 代謝通路與生物過程分析使用DAVID 6.8 數(shù)據(jù)庫將蒼耳子毒性成分對應(yīng)靶點的基因進行基因本體（Gene Ontology，GO）生物過程（biological process，BP）功能富集分析與京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析，并選擇人作為物種，得到蒼耳子影響的代謝通路。

2 結(jié)果

2.1 蒼耳子成分篩選從TCMSP 數(shù)據(jù)庫中獲得蒼耳子目前已知的活性成分111種，篩選出具有良好的口服生物利用度（OB≥30%）與類藥性（DL≥0.18）的化合物11 個，見表1。從CTD 數(shù)據(jù)庫中共獲取7 種蒼耳子目前已知的有毒成分，見表2。

2.2 毒性成分靶點查詢結(jié)果蒼耳子的7 種有毒成分從TCMSP 數(shù)據(jù)庫和SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫中共得到367 個靶點蛋白，去除重復(fù)蛋白后獲得215 個靶點蛋白。

表1 蒼耳子成分篩選

表2 蒼耳子中的毒性化合物

2.3 毒性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將蒼耳子的毒性成分和其相關(guān)作用靶點導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 中，構(gòu)建毒性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)。共有222個節(jié)點（215個靶點蛋白和7 個有毒成分）與367 條邊。紫色三角形表示有毒活性成分，綠色方形表示不同成分的同一靶點，藍色八邊形表示同一成分的不同靶點，見圖1。節(jié)點的重要性用degree 值與介數(shù)中心性（Betweenness Centrality）來反映，見表3。

2.4 靶點PPI 構(gòu)建將得到的蒼耳子的215 個靶點導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫里，共有169 個靶點蛋白發(fā)生相互作用，共有2802 條代表靶點蛋白相互作用的邊。節(jié)點越大與之相對應(yīng)的degree值就越大，節(jié)點顏色由藍變橙對應(yīng)的degree值也越大。見圖2。

2.5 生物過程與通路分析使用DAVID 6.8 數(shù)據(jù)庫對蒼耳子的215個靶點基因進行GO生物學過程富集分析和KEGG 信號通路富集分析。篩選得到GO_BP條目392 個（P＜0.05）和KEGG 信號通路91 條（P＜0.05），按照P值從小到大排列，前10 條主要生物過程和前15條的信號通路富集分析分別見表4和表5。

圖1 蒼耳子毒性化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)

表3 蒼耳子主要毒性成分的網(wǎng)絡(luò)拓撲學參數(shù)

3 討論

3.1 蒼耳子毒性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果分析本研究在獲得蒼耳子的有毒成分與靶點后，構(gòu)建毒性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)，獲得PTPN 1、BCHE、CHRM 2 等節(jié)點degree值較高的靶點蛋白。

Degree 值 為5 的PTPN 1（Protein Tyrosine Phosphatese Non-receptor type 1），又稱PTPIB，是一種以調(diào)節(jié)絡(luò)氨酸磷酸蛋白的磷酸化來發(fā)揮其功能的蛋白絡(luò)氨酸磷酸酶，可以調(diào)節(jié)細胞的增殖、生長、分化以及凋亡等過程的多個信號通路。PTPN 1 的異常會導(dǎo)致阿爾茲海默癥、腫瘤、肝損傷[32-34]等多種疾病的發(fā)生和發(fā)展，蒼耳子引起的肝損傷可能與此有關(guān)。

Degree 值為5 的丁酰膽堿酯酶（butyrylcholinesterase，BCHE），是由肝臟合成的，廣泛存在于血漿、神經(jīng)膠質(zhì)細胞的膽堿酯酶，與糖尿病以及精神系統(tǒng)疾病等有關(guān)。據(jù)文獻[35-36]報道，激活膽堿能通路能緩解炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的臟器損傷，蒼耳子導(dǎo)致的肝腎功能損傷可能與此有關(guān)。

Degree 值為5 的CHRM 2，可調(diào)節(jié)鈣離子或鉀離子通路，從而影響神經(jīng)元的興奮性，可能會引起抑郁癥等病[37-38]。

3.2 蒼耳子有毒成分對應(yīng)靶點PPI 構(gòu)建結(jié)果分析由蒼耳子有毒活性成分對應(yīng)靶點互作網(wǎng)絡(luò)可得到其中degree 值較高的靶點蛋白，如MAPK 3、TP 53 以及EGFR 等，蒼耳子可能通過這些靶點蛋白而產(chǎn)生毒性作用。

Degree 值為77 的是絲裂原活化蛋白激酶3（mitogen-activated protein kinase 3，MAPK 3）。絲裂原活化蛋白激酶是細胞的重要傳遞者，對細胞生長、分化具有調(diào)節(jié)作用，還能調(diào)節(jié)細胞的應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng)等多種細胞過程。其異常表達會導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生、發(fā)展（如腫瘤、膽汁淤積等）。從CTD 數(shù)據(jù)庫中得知，某些藥物還會通過此靶點造成肝腎功能損傷[39-40]。

圖2 靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

表4 生物過程富集分析結(jié)果

Degree 值為72 的是細胞腫瘤抗原53（Tumor Protein 53，TP 53），位于17 號染色體上。其主要功能是調(diào)節(jié)細胞分裂與增殖、維護基因的完整性與促進細胞凋亡。TP 53 的異常會誘導(dǎo)多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，此外，蒼耳子造成的肝腎損傷與TP 53 也有一定關(guān)系[41-42]。

Degree 值為69 的是表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）。EGFR 作為信號傳導(dǎo)的受體，其功能是調(diào)節(jié)細胞的生理、生化過程，與腫瘤密切相關(guān)。此外，EGFR的異常會影響呼吸系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)以及消化系統(tǒng)的正常功能[43-44]。

表5 KEGG信號通路富集分析結(jié)果

3.3 蒼耳子毒理作用機制及原理分析在臨床應(yīng)用中，蒼耳子的不良反應(yīng)主要有：以惡心、嘔吐為主要表現(xiàn)的消化系統(tǒng)功能損害；以呼吸困難、咳嗽為主要表現(xiàn)的呼吸系統(tǒng)功能損害；以少尿、血尿、蛋白尿為主要表現(xiàn)的泌尿功能損害；以頭暈、昏迷為主要表現(xiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)功能損害；以血壓升高和心悸為主要表現(xiàn)的循環(huán)系統(tǒng)功能損傷。此外，蒼耳子外用還會出現(xiàn)局部瘙癢和紅腫等毒性作用[15]。GO 生物過程富集分析結(jié)果表明，蒼耳子可能通過調(diào)節(jié)多種生物過程而產(chǎn)生毒性作用。通過KEGG通路富集分析得出，蒼耳子可能通過氮素代謝、雌激素信號、鈣離子信號、TNF信號以及cAMP信號等通路而產(chǎn)生毒性。

氮素代謝（nitrogen metabolism）是機體內(nèi)一種重要的合成與代謝生理途徑，對維持細胞內(nèi)外的穩(wěn)態(tài)起著重要的作用[45]。從CTD數(shù)據(jù)庫得知，多種疾病的發(fā)生、發(fā)展與此有關(guān)。

雌激素信號通路不僅與維持雌性機體的第二性征有關(guān)，還與骨質(zhì)疏松、乳腺癌以及心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展有很大關(guān)系。此外，還可通過調(diào)控多個基因（如ADCY 5、ITPR 1、EGFR），造成肝腎功能損傷及對循環(huán)系統(tǒng)產(chǎn)生影響[46-47]。

細胞內(nèi)外鈣離子的濃度與細胞生理活動和維持細胞的存活密切相關(guān)。某些藥物可破壞細胞膜的通透性以及細胞膜上相關(guān)的酶，導(dǎo)致細胞內(nèi)外鈣離子的濃度改變，從而引起血壓升高、肝腎損傷等一系列生理病理改變。蒼耳子亦可能通過調(diào)控鈣離子信號通路導(dǎo)致毒性的發(fā)生發(fā)展。

腫瘤壞死因子（TNF）信號通路不僅參與殺傷腫瘤細胞，還與全身炎癥反應(yīng)有關(guān)。肝腎功能損傷和膽汁淤積等多種生理損傷可能與TNF 信號通路有關(guān)[48-49]。此外，有研究[50]證實，TNF 會導(dǎo)致肝損傷小鼠的腎小球濾過率降低。

綜上，蒼耳子對機體的毒性作用是多種組分經(jīng)多條途徑、多種靶點而產(chǎn)生的。本研究使用網(wǎng)絡(luò)毒理學的方法報告了蒼耳子對人體可能產(chǎn)生的毒性機制和途徑，對今后蒼耳子的研究與臨床應(yīng)用具有一定的意義。