新生豬缺氧缺血性腦損傷后腦內(nèi)髓鞘相關(guān)蛋白表達的變化

崔夢旭，鄭陽，王曉明

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院放射科，沈陽 110004）

新生兒缺氧缺血性腦?。╤ypoxic-ischemic encephalopathy，HIE）可引起新生兒圍產(chǎn)期腦功能損傷，包括髓鞘損傷［1］。髓鞘堿性蛋白（myelin basic protein，MBP）在中樞神經(jīng)系統(tǒng)由少突膠質(zhì)細胞合成，在嬰幼兒時期表達量較高，其表達量減少說明髓鞘發(fā)生一定程度的損傷。髓鞘相關(guān)糖蛋白（myelinassociated glycoprotein，MAG）位于髓鞘膜的最內(nèi)層，與軸突膜保持密切接觸。它在外周神經(jīng)系統(tǒng)中的施萬細胞和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的少突膠質(zhì)細胞表達［2］。髓鞘少突膠質(zhì)細胞糖蛋白（myelin oligodendrocyte glycoprotein，MOG）位于髓鞘外膜，與其他主要的髓鞘蛋白相比，MOG的表達延遲24～48 h，且在少突膠質(zhì)細胞表面表達，因此MOG是成熟少突膠質(zhì)細胞的一個很好的標(biāo)志物［3］。本研究觀察新生豬缺氧缺血性（hypoxic-ischemic，HI）腦損傷模型在不同時間點MBP、MOG、MAG表達的變化，探究HI腦損傷對中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘和少突膠質(zhì)細胞的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和分組

選用28頭健康新生約克夏豬，平均體質(zhì)量1.0～1.5 kg，3～5日齡，雌雄不限，隨機分為對照組（n=4）和HI模型組（n=24）。根據(jù)HI后的存活時間，將HI模型組分為6個亞組（n=4），分別為0～2 h、2～6 h、6～12 h、12～24 h、24～48 h、48～72 h亞組。本研究獲得我院倫理委員會審批，所有實驗動物的處理遵守《實驗動物管理條例》和《實驗動物許可證管理辦法》。

1.2 動物模型制作

HI模型組新生豬使用速眠新注射液（長春軍事醫(yī)學(xué)院獸醫(yī)研究所）按0.6 mL/kg劑量肌肉注射麻醉，在28～30 ℃室溫下操作，麻醉后行氣管插管（直徑2.5 mm），使用TKR-200C小動物呼吸機（江西特力麻醉呼吸設(shè)備中國有限公司）機械通氣（100%氧氣），使用Tuff Sat手掌式脈搏血氧儀（美國GE公司）監(jiān)測心率和血氧飽和度。消毒頸部皮膚，取頸部正中切口，游離雙側(cè)頸總動脈，置于保溫箱內(nèi)約30 min，待其狀態(tài)穩(wěn)定，用動脈夾夾閉雙側(cè)頸總動脈，同時機械通入6%含氧濃度的氮氧混合氣（大連大特氣體有限公司），HI狀態(tài)持續(xù)40 min后撤去動脈夾，改為機械通入100%氧氣。操作完成后，縫合切口，新生豬恢復(fù)自主呼吸后停用呼吸機。全程密切監(jiān)控心率和血氧飽和度。對照組新生豬僅游離雙側(cè)頸總動脈，不進行HI操作。

1.3 免疫組化染色

1.3.1 染色過程：HI造模完成后，根據(jù)分組在相應(yīng)時間段處死動物，迅速取出腦組織，使用4%多聚甲醛固定，經(jīng)脫水、二甲苯透明、石蠟包埋后，以冠狀面切成4 mm厚的組織片，進行MBP、MOG、MAG（英國Abcam公司）免疫組化染色。置于37 ℃烤箱烤干切片，行常規(guī)脫水、透明、封片操作。用PBS代替一抗做陰性對照。

1.3.2 圖像采集和結(jié)果分析：使用日本Nikon Edipse E800顯微鏡和日本NIS-Elements F2.30圖像采集軟件，400倍光鏡下觀察，每張切片觀察5～6個視野。鏡下觀察到棕黃色染色為陽性表達。使用Image Pro Plus6.0軟件半定量分析免疫組化圖像光密度（optical density，OD）值。對采集的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，判斷各組中MBP、MOG、MAG的表達情況。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 24.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。計量資料經(jīng)Kolmogorov-Smirnov檢驗均服從正態(tài)分布，以±s表示。采用單因素方差分析比較各組間MBP、MOG、MAG的表達是否存在差異，兩兩比較使用LSD-t檢驗。采用雙側(cè)檢驗，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MBP免疫組化染色結(jié)果和表達變化趨勢

MBP免疫組化染色結(jié)果（圖1）顯示，與對照組相比，HI模型組0～2 h、2～6 h、6～12 h、12～24 h、24～48 h、48～72 h亞組染色均變淺。MBP的表達整體呈先降低后升高的趨勢，6～12 h達到最低值，而后升高，24～48 h后再次降低。與對照組相比，HI模型組0～2 h、2～6 h、6～12 h、12～24 h、24～48 h、48～72 h亞組MBP的表達水平均降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）。與HI模型組0～2 h亞組相比，HI模型組2～6 h、6～12 h、12～24 h、24～48 h、48～72 h亞組MBP的表達水平均降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）。2～6 h亞組、6～12 h亞組、12～24 h亞組、24～48 h亞組、48～72 h亞組間兩兩比較，MBP的表達水平均無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。見表1。

2.2 MOG免疫組化染色結(jié)果和表達變化趨勢

MOG免疫組化染色結(jié)果（圖1）顯示，MOG陽性表達為棕黃色顆粒。MOG表達整體呈先升高再降低再升高的趨勢，6～12 h達到最高值，而后降低，24～48 h后略有升高。與HI模型組6～12 h亞組相比，對照組和HI模型組0～2 h、2～6 h、12～24 h、24～48 h、48～72 h亞組MOG的表達水平均降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）。與HI模型組2～6 h亞組相比，對照組和HI模型組0～2 h亞組MBP表達水平均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）。見表1。

圖1 MBP、MOG、MAG免疫組化染色結(jié)果 ×400Fig.1 Immunohistochemical staining of myelin basic protein（MBP），myelin oligodendrocyte glycoprotein（MOG），and myelinassociated glycoprotein（MAG） ×400

表1 各組MBP、MOG、MAG的OD值比較Tab.1 Comparison of OD values of myelin basic protein（MBP），myelin oligodendrocyte glycoprotein（MOG），and myelin-associated glycoprotein（MAG） among the groups

2.3 MAG的免疫組化染色結(jié)果及表達變化趨勢

MAG免疫組化染色結(jié)果（圖1）顯示，MAG表達整體呈先降低后升高再降低的趨勢，12～24 h達到最低值，而后升高，24～48 h后再次降低。與對照組相比，HI模型組0～2 h、2～6 h、6～12 h、12～24 h、24～48 h、48～72 h亞組MAG的表達水平均降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）；2～6 h亞組、6～12 h亞組、12～24 h亞組、24～48 h亞組、48～72 h亞組間兩兩比較，MAG的表達水平均無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞ 0.05）。見表1。

3 討論

既往對新生兒HI腦損傷的研究多集中于神經(jīng)元的損傷和修復(fù)，較少關(guān)注髓鞘的損傷。事實上，少突膠質(zhì)細胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的髓鞘形成細胞，容易受到腦缺血的影響。

MBP是中樞髓鞘的一種結(jié)構(gòu)性蛋白，約占髓鞘蛋白質(zhì)總量的30%，具有中樞神經(jīng)系統(tǒng)特異性，存在于有髓神經(jīng)髓鞘的漿膜面，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損的標(biāo)志物［4］。MBP起到維持髓鞘結(jié)構(gòu)和功能、促進神經(jīng)快速傳導(dǎo)、維持神經(jīng)傳導(dǎo)絕緣的作用［5］。本研究中，HI模型組MBP的表達較對照組降低，提示HI后可能發(fā)生了髓鞘損傷，在6～12 h達到最低值后出現(xiàn)了小幅度升高，而后又降低，說明可能同時存在少突膠質(zhì)細胞持續(xù)性損傷以及髓鞘再生。體外細胞研究［6］提示，缺氧可引起神經(jīng)干細胞向少突膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞分化而抑制其向神經(jīng)元分化。研究［7］表明，側(cè)腦室下區(qū)的少突膠質(zhì)細胞前體細胞在生理和缺血條件下可以分化為髓鞘形成的少突膠質(zhì)細胞，但體內(nèi)環(huán)境更加復(fù)雜，具體作用機制有待進一步明確。MBP具有強堿性，當(dāng)發(fā)生大量髓鞘損傷時，MBP進入血液和腦脊液，并作為抗原激活免疫系統(tǒng)，誘導(dǎo)繼發(fā)性炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致神經(jīng)細胞凋亡［8］。因此，進行早期干預(yù)保護神經(jīng)膠質(zhì)細胞，抑制脫髓鞘進程，促進中樞神經(jīng)系統(tǒng)再髓鞘化，對改善HIE患兒的預(yù)后尤為重要。

MOG在中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘和少突膠質(zhì)細胞的外表面表達，因此更容易受到免疫系統(tǒng)攻擊，被認為和一些自身免疫性疾病相關(guān)［9］。MOG的表達比其他髓鞘蛋白開始得晚，因此可以作為少突膠質(zhì)細胞成熟的標(biāo)志［10］。本研究中，對照組少突膠質(zhì)細胞中MOG的表達量極少，HI模型組MOG的表達呈先升高后降低的趨勢，在6～12 h達到最高值，其可能原因是MOG表達的時間較晚，在HI過程中成熟的少突膠質(zhì)細胞逐漸增多，同時也存在少突膠質(zhì)細胞損傷，在6～12 h前少突膠質(zhì)細胞的生成大于缺失，MOG的表達增加可能會干擾受損神經(jīng)的修復(fù)。在 6～12 h后，少突膠質(zhì)細胞的生成減弱，損傷加強，MOG的表達逐漸減少。

MAG在最內(nèi)層髓磷脂膜包裹物上表達，直接包裹在軸突表面［11］。MAG具有雙重特性，既是軸突生長因子，又能抑制軸突再生；在胎兒時期，MAG是一種刺激劑，當(dāng)髓鞘形成完成時，MAG變成一種抑制劑。它可以增強軸突-髓鞘的長期穩(wěn)定性，并調(diào)節(jié)軸突細胞骨架。除在軸突-髓鞘穩(wěn)定方面的作用外，MAG還抑制損傷后軸突的再生［12］。MAG通過與特定的神經(jīng)元糖脂（神經(jīng)節(jié)苷脂）相互作用來維持髓鞘-軸突間距，抑制軸突再生并控制髓磷脂的形成。本研究中，HI模型組MAG的表達較對照組減少，但HI模型組各亞組間無統(tǒng)計學(xué)差異，說明在新生兒HIE中，會發(fā)生MAG丟失。

綜上所述，新生豬HI后可發(fā)生腦白質(zhì)損傷，其發(fā)病機制可能與氧化應(yīng)激、興奮性氨基酸積累、小膠質(zhì)細胞激活有關(guān)。本研究使用新生豬HI模型，很好地模擬了新生兒HIE的病理生理過程。本研究中，HI后MBP、MAG的表達均降低，MOG的表達先升高再降低，說明HI可引起髓鞘和少突膠質(zhì)細胞的損傷。這也提示臨床在治療新生兒HIE時，在挽救神經(jīng)細胞的同時，還應(yīng)該關(guān)注髓鞘的損傷，以及脫髓鞘改變對神經(jīng)元的繼發(fā)性損傷和對軸突再生的抑制作用。保護髓鞘、促進小膠質(zhì)細胞對髓鞘裂解產(chǎn)物的清除、阻斷介導(dǎo)MAG和MOG對神經(jīng)軸突抑制作用的下游信號分子，對改善HIE患兒的遠期預(yù)后也會起到一定作用。