白藜蘆醇分離檢測方法的研究進展

李同夢，李明雪

(徐州開放大學(xué)，江蘇 徐州 221000)

白藜蘆醇以反式和順式異構(gòu)體形式存在，是一種植物抗毒素，存在于葡萄藤及其產(chǎn)物、葡萄酒和大量植物中。由于白藜蘆醇具有多種藥理活性，包括抗癌和抗心血管疾病活性以及延長壽命的特性，其定量方法正在迅速發(fā)展，包括高效液相色譜液法(high performance liquid chromatography，HPLC)、氣相色譜(gas chromatography，GC)和毛細管電泳法(capillary electrophoresis，CE)相關(guān)技術(shù)。本文對基于分離技術(shù)的白藜蘆醇的分析方法進行了綜述，并對各種方法的優(yōu)缺點進行了比較。

1 白藜蘆醇的來源與代謝

白藜蘆醇(3，4’，5-反式三羥基-苯乙烯)是一種天然的從多種植物中提取的非類黃酮的多酚化合物，已被證實具有抗氧化、抗炎、抗癌癥、抗衰老、減肥、抗糖尿病、心臟保護等多種生物學(xué)功能[1-2]。白藜蘆醇最初于1940年在白?？斜环蛛x提取。在1963年，蓼科植物的根中也分離出白藜蘆醇[3]。1997年，Jang等[4]首先報道了白藜蘆醇的抗白血病作用，隨后對其廣泛的生物學(xué)和藥理活性進行了大量的研究。目前，在天然來源中，白藜蘆醇已在超過72種植物中被發(fā)現(xiàn)，包括葡萄、日本虎杖、花生、桉樹、云杉、百合、桑樹和花生等[5]。其中，葡萄及葡萄酒被證實是白藜蘆醇最豐富的來源[6]。

雖然白藜蘆醇以反式和順式異構(gòu)體的形式存在，但大部分研究已經(jīng)證實反式白藜蘆醇的健康作用更大。反式白藜蘆醇的穩(wěn)定性比順式好，順式只有在完全遮光的情況下才在中性pH下穩(wěn)定。相反，反式白藜蘆醇在避光條件下至少穩(wěn)定42 h，除非在高pH緩沖液中[7]。一般來說，在嚴格的波長和光照時間條件下，在強紫外光的照射下，順式白藜蘆醇很容易從其過渡體生成順式白藜蘆醇[8]。但在空氣和不同的光照條件下，反式白藜蘆醇的減少并不總是與順式白藜蘆醇的增加相關(guān)，這可能是由于順式白藜蘆醇對大氣氧化更加敏感導(dǎo)致的[9]。事實上，最近有報道稱，反式白藜蘆醇在365 nm處的紫外光線下能催化異構(gòu)體，除了順式異構(gòu)體外，還會產(chǎn)生反式-白藜蘆醇的氧化衍生物。因此，與其他抗氧化劑一樣，白藜蘆醇非常不穩(wěn)定，暴露在陽光下往往會作為還原劑，暴露在空氣中會被氧化。由于氧化可能最終導(dǎo)致白藜蘆醇的完全降解和生物活性的大幅喪失，因此需要一種快速的分析方法來減少白藜蘆醇氧化的機會。本文綜述了白藜蘆醇分析的現(xiàn)狀，包括白藜蘆醇的樣品制備和分離檢測方法，并對各種方法的優(yōu)缺點進行了總結(jié)。

2 白藜蘆醇分析樣品的制備

由于不同植物樣品中的白藜蘆醇含量各不相同，因此在白藜蘆醇的分析檢測前要先進行白藜蘆醇提取或濃縮等前處理，以減少基質(zhì)影響。在已報道的方法中，固相萃取(solid phase extraction，SPE)和液-液萃取(liquid-liquid extraction，LLE)是應(yīng)用最廣泛的技術(shù)。

SPE是一種快速、高效的方法，只需要最少的樣品即可操作，并且可以完全自動化[10]。因此，它被廣泛應(yīng)用于從生物樣品中濃縮目標(biāo)分析物[11]。不同的研究人員已成功地將該方法用于白藜蘆醇的分析前的濃縮。LLE不像固相萃取那樣被廣泛使用，但LLE也被用于白藜蘆醇的分析。Minuti等[12]使用分離漏斗和乙酸乙酯作為溶劑進行了液-液萃取，在葡萄酒樣品中加入氯化鈉(20 mg)和焦亞硫酸鈉(20 mg)，成功地分析了葡萄酒中22種成分的濃度，包括反式白藜蘆醇，平均回收率為73%～107%。有趣的是，當(dāng)對反式白藜蘆醇的本身進行回收時，這種方法可以得到114%的最好的回收率，顯著好于用同溶質(zhì)C18(EC)玻璃柱測試的固相萃取方法。

3 白藜蘆醇的分離檢測方法

對不同來源的白藜蘆醇進行定量研究，有助于幫助我們?nèi)媪私獍邹继J醇的生產(chǎn)、穩(wěn)定性和代謝，以及其有益作用的分子機制。根據(jù)分離方式的不同，目前白藜蘆醇常用的檢測方法可分為3大類，即HPLC、GC、CE等方法。本文將總結(jié)這些測定方法的研究進展。

3.1 高效液相色譜法(HPLC)

由于白藜蘆醇的高穩(wěn)定性和高重現(xiàn)性，HPLC是白藜蘆醇及其衍生物分析中應(yīng)用最廣泛的方法。在白藜蘆醇的高效液相分析中，流動相、固定相和色譜柱的選擇是影響白藜蘆醇分析效果的因素。白藜蘆醇在大多數(shù)情況下都是在反相柱上進行分離的，最常用的流動相是乙腈-水體系，它的壓力低于另一種常用的體系甲醇-水。在多數(shù)的情況下，通常使用各種有機添加劑，如三乙胺、三氟乙酸、甲酸和磷酸等來改善色柱的分離度和峰形[13-17]。據(jù)報道，乙酸還可以阻止白藜蘆醇中羥基的電離，從而提高其在反相色譜中的保留率。對于固定相，通常使用多種C18鍵合相用于柱填料，如C18Lichrocart、Capcell Pak C18UG120、ODS Hypersil、Spher ODS等[18-19]以提高對白藜蘆醇的選擇性和分離度。然而，ODS吸附劑在較高的pH值下易溶解，并且需要較長的分析時間。因此，還可以使用芐基二甲基硅基、C8和氰基等鍵合固定相，值得注意的是，C8柱的保留時間似乎比C18柱短，尤其是順式白藜蘆醇，其在C18柱上的保留明顯較長[20]。分離的過程中通常采用梯度的洗脫方式進行，流速通常在0.5 mL /min和1.5 mL/min之間。洗脫順序按照極性逐步遞減，即反式白藜蘆醇、順式白藜蘆醇依次遞減的順序。

柱屬性是影響白藜蘆醇分析的另一重要因素。Abert Vian等[21]采用兩個耦合的整體柱分離石榴葡萄酒中的白藜蘆醇和白藜蘆醇異構(gòu)體發(fā)現(xiàn)，整體柱的高孔隙率可以提供很短的平衡時間，流動相流速高達7 mL/min，僅用較短的分析時間(20 min)就分離出白藜蘆醇。此外，用于白藜蘆醇分析的高效液相色譜柱尺寸通常為200 mm×4 mm，但微高性能液體色譜法(μ-HPLC)配備有顯著減小的柱直徑(內(nèi)徑約0.2 mm)，被證實具有更高的靈敏度和更低的檢測下限，其低流速還可以降低溶劑消耗，較高的柱溫度增加了傳質(zhì)速率，從而進一步提高了柱效率，在近年來白藜蘆醇的檢測方法中引起廣泛關(guān)注[22-24]。Lopez等[22]使用配備有10 cm×0.32 mm的微型高效液相系統(tǒng)成功地測定了23種意大利商業(yè)葡萄酒中的白藜蘆醇濃度，效果遠遠好于使用常規(guī)分析柱方法。

3.2 氣相色譜法(GC)

GC已被用于同時檢測反式和順式白藜蘆醇，盡管與高效液相色譜法相比報道較少。通常，由于白藜蘆醇的非揮發(fā)性，在GC分析之前，通過固相萃取或其他方法制備樣品后，需要進行化學(xué)衍生化步驟以獲得揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的衍生物。一種常用的衍生化試劑是雙三氟乙酰胺(bistrifluoroacetamide，BSTFA)。也有報道在比較不同的硅烷化方法后指出，少量的甲醇和BSTFA(約1:3)可顯著提高衍生化產(chǎn)率。電子電離(electron ionization，EI)分子離子在m/z 444處以SIM的模式進行定量測定，m/z 445和446處的離子被記錄為范圍極值。當(dāng)然，含有白藜蘆醇的樣品也可以直接進樣(即不經(jīng)過衍生化)進行GC-MS分析，其中分子離子在m/z 228處以SIM模式進行定量分析，m/z 227([M H]+)和m/z 229(含13C同位素物種)的離子為限定值[25]。研究顯示，在樣品直接進樣的情況下，反式白藜蘆醇相對于順式白藜蘆醇的含量更高，這至少部分歸因于葡萄糖苷形式的熱分解。特別需要注意的是，分析前所需樣品的衍生化以及進樣器、色譜柱和離子源(250～300 ℃)使用的高溫可能會導(dǎo)致白藜蘆醇的部分異構(gòu)化或降解，從而導(dǎo)致GC分析的定量不準(zhǔn)確[26]。

3.3 毛細管電泳法(CE)

CE具有分離能力強、分離速度快、樣品和溶劑消耗少等獨特優(yōu)勢，由于其可用性有限，且其來源如葡萄酒的基質(zhì)高度復(fù)雜，因此對白藜蘆醇的分析非常有效。原則上，樣品可以直接引入CE系統(tǒng)或經(jīng)過前處理再進入系統(tǒng)[27]。盡管樣品的前處理延長了總的分析時間，但通常會產(chǎn)生更濃縮、純度更高的樣品。在CE分析的情況下，固相萃取預(yù)處理能夠?qū)崿F(xiàn)更高的分離效率，因為它降低了離子強度、降低了粘度并便于調(diào)節(jié)運行緩沖液，并且由于用于從固相萃取柱洗脫分析物的非極性溶劑產(chǎn)生的堆積效應(yīng)，分辨率也可以提高[27]。盡管SPE程序的有效性取決于隨后的分離模式，但通常使用SPE將植物中的白藜蘆醇檢測下限降低10倍，并獲得良好的回收率[28]。

在分離模式方面，毛細管區(qū)帶電泳法(capillary zone electrophoresis，CZE)和膠束電動毛細管色譜(micellar electrokinetic capillary chromatography，MEKC)都被報道用于白藜蘆醇的分析。CZE中白藜蘆醇的定量分析通常采用磷酸鹽或硼酸鹽基電解液，在分離緩沖液中加入有機改進劑(甲醇)可提高分離度。最近，Peres等[27]以四硼酸鈉(STB)為電解液，利用色譜圖分辨率統(tǒng)計方程研究了包括STB基緩沖液、甲醇作為有機改進劑、十二烷基硫酸鈉或Brij35作為表面活性劑、進樣時間/壓力、電壓和溫度等各種因素的影響發(fā)現(xiàn)，優(yōu)化后的電解液為含20%甲醇的17 mmol/L STB。LOD和LOQ分別為0.1～0.3 μg/mL和0.4～0.8 μg/mL。連續(xù)進樣10次，進樣時間和峰面積的RSD均小于2%，回收率在97%～102%之間，分離效果較好。

4 結(jié) 語

鑒于白藜蘆醇的重要藥理作用，人們開發(fā)了一系列的定量方法。其中，GC具有良好的靈敏度和特異度，而分析前所需樣品的衍生化以及進樣器、色譜柱和離子源處的高溫可能會導(dǎo)致白藜蘆醇的部分異構(gòu)化或降解，從而導(dǎo)致不準(zhǔn)確的定量。最常用的HPLC相關(guān)技術(shù)是可靠和穩(wěn)定的，但遺憾的是，它們通常需要很長的時間。CE為白藜蘆醇的測定提供了一種快速、經(jīng)濟的方法，但由于多種技術(shù)原因，該方法精密度較低，不適合大規(guī)模樣品分析。因此，一種簡單、快速、可靠、性價比高的方法仍然需要進一步研發(fā)。在這一點上，μ-HPLC具有更廣闊的前景，因為它的速度快，重現(xiàn)性好，溶劑和樣品的消耗很低，特別是當(dāng)與MS結(jié)合時[29]。