劉衍素, 楊靜, 范艷珠, 沈迪, 孫若磊, 鈕文俊, 方光戰(zhàn)*

(1.四川護(hù)理職業(yè)學(xué)院,成都610100；2.中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所,成都610041)

焦慮作為一種情緒反應(yīng)或?qū)ξ磥硗{的預(yù)期，是由于個(gè)體經(jīng)歷一定的有害刺激后，從而導(dǎo)致其行為和意識(shí)狀態(tài)的改變(Iftikhar.，2020)。不良的早期生活經(jīng)歷可能會(huì)破壞與應(yīng)激反應(yīng)、情緒行為和情緒狀態(tài)有關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育，造成后期更易罹患如焦慮癥、情感障礙等精神疾病，從而對(duì)心理健康產(chǎn)生長(zhǎng)期不良影響(Lukkes.，2009)。通過斷乳后即進(jìn)行社會(huì)隔離的動(dòng)物模型，可模擬人類早期(如童年時(shí)期)遭受的不良經(jīng)歷，特別是社會(huì)忽視，而焦慮和攻擊行為增多則是該時(shí)期表現(xiàn)出的顯著行為特征之一(Chapple.，2005；Pesonen.，2010；劉朝寶等，2016；程廣超等，2017)。例如，斷乳后即開始經(jīng)歷隔離飼養(yǎng)的雄性大鼠在高架十字迷宮(elevated plus maze，EPM)測(cè)試中，表現(xiàn)出進(jìn)入開放臂的時(shí)間和次數(shù)均減少，表明焦慮行為增加(Parker & Morinan，1986；Wright.，1991；Weiss.，2004)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司的PD21雄性CD-1小鼠(=40)，隨機(jī)平分為2組：社會(huì)群居組(SG組，每籠5只)和社會(huì)隔離組(SI組，單籠單只)。動(dòng)物均采用小鼠獨(dú)立通氣籠具(ZJ-4，馮氏，中國(guó)蘇州)飼養(yǎng)，飼養(yǎng)2周后進(jìn)行EPM行為測(cè)試。動(dòng)物處于固定光照周期(08∶00 開燈，20∶00 關(guān)燈)、溫度和相對(duì)濕度分別保持在(22±1)℃和(60±10)%的飼養(yǎng)房中，可自由獲取食物和水。所有實(shí)驗(yàn)在夜相且暗紅光(<2 lux)照明條件下進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)流程按中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)相關(guān)要求進(jìn)行。

1.2 動(dòng)物手術(shù)

將小鼠放入誘導(dǎo)盒內(nèi)使用異氟烷進(jìn)行深度麻醉后，通過立體定位儀(51603，Stoelting，美國(guó))進(jìn)行頭部固定，連接氣體麻醉系統(tǒng)(VMR，Matrx，美國(guó))維持麻醉，然后從前后、左右2個(gè)維度調(diào)平顱骨表面。根據(jù)小鼠腦圖譜，分別在雙側(cè)的內(nèi)側(cè)前額葉、內(nèi)側(cè)杏仁核及腹內(nèi)側(cè)下丘腦植入6個(gè)由單根不銹鋼絲(直徑0.8 mm)組成的LFP電極(圖1)。相應(yīng)電極位置坐標(biāo)如圖1所示，其中，前后方向(anteroposterior，AP)以前囟為參考，前囟前為正，前囟后為負(fù)；左右方向(mediolateral，ML)以中縫為參考，左側(cè)為正，右側(cè)為負(fù)；深度方向(dorsoventral，DV)以硬腦膜為參考，下方為負(fù)：(1)內(nèi)側(cè)前額葉(mPFC)：AP，+1.94 mm；ML，±0.4 mm；DV，-2.1 mm。(2)內(nèi)側(cè)杏仁核(MeA)：AP，-1.34 mm；ML，±1.75 mm；DV，-5.4 mm。(3)腹內(nèi)側(cè)下丘腦(VMH)：AP，-1.94 mm；ML，±0.6 mm；DV，-5.8 mm。將參考電極(C)植入小腦(AP，-6.5 mm；ML，0 mm)上方；電極埋植區(qū)前后共植入4個(gè)微型不銹鋼螺釘用于固定，使用牙托水泥封固，以確保電極的穩(wěn)固性。動(dòng)物恢復(fù)7 d后再行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。共獲得31只小鼠的有效實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)(SI組16只，SG組 15只)。

圖1 電極位置分布及對(duì)應(yīng)的10 s局部場(chǎng)電位特征波形

1.3 數(shù)據(jù)采集

EPM實(shí)驗(yàn)是利用動(dòng)物對(duì)高懸敞開環(huán)境的恐懼和對(duì)新異環(huán)境的探究特性，形成一種“規(guī)避-探究”的行為沖突，以模仿人類的焦慮狀態(tài)，是經(jīng)典的焦慮行為測(cè)試，具有簡(jiǎn)單、快速、結(jié)果重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)(羅丹妮，2019)。該范式利用進(jìn)入開放臂次數(shù)和百分比、開放臂停留時(shí)間和百分比等指標(biāo)評(píng)價(jià)動(dòng)物的焦慮水平。EPM高出地面50 cm，由2個(gè)開放臂(長(zhǎng)30 cm×寬5 cm)、2個(gè)閉合臂(長(zhǎng)30 cm×寬5 cm×高15 cm)和1個(gè)連接4個(gè)臂的中央?yún)^(qū)(長(zhǎng)5 cm×寬5 cm)組成。

實(shí)驗(yàn)前CD-1小鼠適應(yīng)測(cè)試環(huán)境3 h。連接腦電信號(hào)采集系統(tǒng)(RM6280，成儀，成都)并在飼養(yǎng)籠內(nèi)適應(yīng)15 min，待信號(hào)穩(wěn)定后將小鼠頭朝開放臂放入中央?yún)^(qū)，讓其自由探索任意區(qū)域。使用位于EPM上方的紅外攝像頭記錄5 min行為視頻；同時(shí)連續(xù)同步記錄腦電(electroencephalogram,EEG)信號(hào)，采集參數(shù)設(shè)置為500 Hz低通濾波、50 Hz陷波、1 000 Hz采樣率。每個(gè)被試測(cè)試后，用75%乙醇對(duì)測(cè)試裝置進(jìn)行清潔除味，方可進(jìn)行下一被試的實(shí)驗(yàn)；動(dòng)物出場(chǎng)順序隨機(jī)。實(shí)驗(yàn)完成后，用程控電刺激儀(YC-2，成儀，成都)并以0.4 mA的電流強(qiáng)度，對(duì)植入電極的每個(gè)腦區(qū)進(jìn)行電流損毀8 s，用組織學(xué)方法驗(yàn)證記錄電極位點(diǎn)，排除非目標(biāo)位點(diǎn)的數(shù)據(jù)。

2 數(shù)據(jù)處理

2.1 焦慮行為數(shù)據(jù)分析

利用開源的事件記錄和分析軟件(BORIS)進(jìn)行行為視頻分析。參數(shù)為進(jìn)入開放臂次數(shù)(open arm entry，OE)、開放臂停留時(shí)間(open arm time，OT)、進(jìn)入閉合臂次數(shù)(closed arm entry，CE)、閉合臂停留時(shí)間(closed arm time，CT)、進(jìn)入中央?yún)^(qū)次數(shù)(central area entry，CEE)、中央?yún)^(qū)停留時(shí)間(central area time，CET)、在開放臂或中央?yún)^(qū)頭向下探究次數(shù)、閉合臂內(nèi)后腿直立次數(shù)、進(jìn)入開放臂次數(shù)百分比[OE%=OE/(OE+CE)×100%]、開放臂停留時(shí)間百分比[OT%=OT/(OT+CT)×100%]。進(jìn)入開放臂次數(shù)及停留時(shí)間越少反映小鼠焦慮水平越高。

2.2 LFP數(shù)據(jù)分析

LFP數(shù)據(jù)經(jīng)0.5～80 Hz帶通濾波后，提取小鼠位于開放臂遠(yuǎn)端(即將開放臂從中間位置劃分，遠(yuǎn)離中心區(qū)的一端)和閉合臂遠(yuǎn)端(即將閉合臂從中間位置劃分，遠(yuǎn)離中心區(qū)的一端)無偽跡的2 s數(shù)據(jù)段。利用Welch方法(漢明窗，頻譜分辨率為0.5 Hz)分別計(jì)算每段數(shù)據(jù)的δ、θ、α、β和γ節(jié)律的絕對(duì)功率譜。得到每種節(jié)律、每個(gè)組別、每個(gè)腦區(qū)(左右側(cè)內(nèi)側(cè)前額葉、左右側(cè)內(nèi)側(cè)杏仁核、左右側(cè)腹內(nèi)側(cè)下丘腦)、每種臂型(開放臂和閉合臂)對(duì)應(yīng)的絕對(duì)功率譜，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2.3 統(tǒng)計(jì)分析

分別用Shapiro-Wilk檢驗(yàn)和Levene檢驗(yàn)檢測(cè)數(shù)據(jù)分布的正態(tài)性和方差齊性。由于閉合臂內(nèi)后腿直立次數(shù)的數(shù)據(jù)不服從正態(tài)分布和方差同質(zhì)性假設(shè)，采用Mann-Whitney檢驗(yàn)檢測(cè)2組間的行為響應(yīng)差異，其余的行為數(shù)據(jù)均使用單因素方差分析統(tǒng)計(jì)。

對(duì)于絕對(duì)功率譜，采用因子“組別”“腦區(qū)”和“臂型”進(jìn)行三因素重復(fù)測(cè)量方差分析探討主效應(yīng)和交互效應(yīng)。若交互效應(yīng)顯著，采用簡(jiǎn)單或簡(jiǎn)單-簡(jiǎn)單效應(yīng)分析。采用最小顯著差異法(LSD)進(jìn)行事后檢驗(yàn)，對(duì)違反球形檢驗(yàn)假設(shè)的數(shù)據(jù)進(jìn)行Greenhouse-Geisser校正。所有統(tǒng)計(jì)分析均在SPSS 23.0中進(jìn)行。顯著性水平設(shè)置為α=0.05。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 行為結(jié)果

SG組小鼠進(jìn)入開放臂的次數(shù)高于SI組(=10.326，=0.003)，差異顯著；進(jìn)入閉合臂(=2.373，=0.134)和中央?yún)^(qū)的次數(shù)(=0.156，=0.696)在2組間的差異不顯著(圖2：A)。SG組小鼠在開放臂的停留時(shí)間顯著高于SI組(=4.268，=0.048)，而在閉合臂的停留時(shí)間(=0.461，=0.503)在2組間的差異不顯著，SI組在中央?yún)^(qū)的停留時(shí)間顯著高于SG組(=4.697，=0.039)(圖2：B)；SG組在開放臂或中央?yún)^(qū)頭向下探究的次數(shù)高于SI組(=4.37，=0.045)，差異顯著；在閉合臂內(nèi)后腿直立的次數(shù)(=80，=31，=0.112)在2組間的差異不顯著(圖2：C)。SG組小鼠進(jìn)入開放臂次數(shù)百分比高于SI組(=23.472，<0.001)，差異極顯著；而開放臂停留時(shí)間百分比在2組間的差異不顯著(=3.145，=0.087；圖2：D)。

圖2 焦慮行為不同參數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果

3.2 LFP結(jié)果

開放臂和閉合臂的近端與遠(yuǎn)端對(duì)應(yīng)的LFP數(shù)據(jù)相似，僅匯報(bào)遠(yuǎn)端結(jié)果：δ、θ、α、β和γ節(jié)律中，“臂型”和“腦區(qū)”的主效應(yīng)均極顯著，且閉合臂對(duì)應(yīng)的絕對(duì)功率譜大于開放臂，差異均顯著，但“組別”的主效應(yīng)不顯著(表1)。

表1 不同EEG節(jié)律的方差分析結(jié)果

事后多重比較顯示：(1)對(duì)δ節(jié)律而言，左側(cè)內(nèi)側(cè)前額葉的絕對(duì)功率譜大于右側(cè)內(nèi)側(cè)前額葉和雙側(cè)內(nèi)側(cè)杏仁核以及左側(cè)腹內(nèi)側(cè)下丘腦，右側(cè)內(nèi)側(cè)前額葉的絕對(duì)功率譜大于左側(cè)內(nèi)側(cè)杏仁核及右側(cè)腹內(nèi)側(cè)下丘腦，雙側(cè)腹內(nèi)側(cè)下丘腦的絕對(duì)功率譜大于雙側(cè)內(nèi)側(cè)杏仁核，差異均顯著(圖3：A)。(2)對(duì)θ節(jié)律而言，左側(cè)內(nèi)側(cè)前額葉的絕對(duì)功率譜大于右側(cè)內(nèi)側(cè)前額葉和雙側(cè)腹內(nèi)側(cè)下丘腦以及雙側(cè)內(nèi)側(cè)杏仁核；右側(cè)內(nèi)側(cè)前額葉及雙側(cè)腹內(nèi)側(cè)下丘腦的絕對(duì)功率譜大于雙側(cè)內(nèi)側(cè)杏仁核，差異均顯著(圖3：B)。(3)對(duì)α節(jié)律而言，左側(cè)內(nèi)側(cè)前額葉的絕對(duì)功率譜大于右側(cè)內(nèi)側(cè)前額葉和雙側(cè)腹內(nèi)側(cè)下丘腦以及雙側(cè)內(nèi)側(cè)杏仁核；右側(cè)內(nèi)側(cè)前額葉和左側(cè)腹內(nèi)側(cè)下丘腦的絕對(duì)功率譜大于雙側(cè)內(nèi)側(cè)杏仁核；右側(cè)腹內(nèi)側(cè)下丘腦的絕對(duì)功率譜大于右側(cè)內(nèi)側(cè)杏仁核，差異均顯著(圖3：C)。(4)對(duì)β節(jié)律而言，左側(cè)內(nèi)側(cè)前額葉的絕對(duì)功率譜大于右側(cè)內(nèi)側(cè)前額葉和雙側(cè)腹內(nèi)側(cè)下丘腦以及雙側(cè)內(nèi)側(cè)杏仁核；右側(cè)內(nèi)側(cè)前額葉大于右側(cè)腹內(nèi)側(cè)下丘腦以及雙側(cè)的內(nèi)側(cè)杏仁核，差異均顯著(圖3：D)。(5)對(duì)γ節(jié)律而言，雙側(cè)內(nèi)側(cè)前額葉的絕對(duì)功率譜大于雙側(cè)腹內(nèi)側(cè)下丘腦以及雙側(cè)內(nèi)側(cè)杏仁核；左側(cè)腹內(nèi)側(cè)下丘腦的絕對(duì)功率譜大于右側(cè)內(nèi)側(cè)杏仁核，差異均顯著(圖3：E)。

圖3 獨(dú)籠(左)和合籠(右)飼養(yǎng)條件下不同腦區(qū)、不同臂型條件下的各節(jié)律絕對(duì)功率譜

3.3 電極位置的組織學(xué)驗(yàn)證結(jié)果

經(jīng)過電損毀后的電極植入?yún)^(qū)域的DAPI染色結(jié)果(電損毀所在區(qū)域均在紅色標(biāo)記區(qū)域內(nèi))與腦圖譜比較結(jié)果(圖4)顯示，與小鼠腦圖譜進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)電極植入位置與腦圖譜所示位置基本一致，說明電極位置正確。

圖4 內(nèi)側(cè)前額葉(A)、內(nèi)側(cè)杏仁核(B)和腹內(nèi)側(cè)下丘腦(C)雙側(cè)腦區(qū)的電極位置驗(yàn)證結(jié)果

4 討論

4.1 隔離飼養(yǎng)導(dǎo)致CD-1小鼠的焦慮水平上升

由于嚙齒類動(dòng)物具有嗜暗性，喜歡在黑暗的環(huán)境中活動(dòng)(比如閉合臂)，但面對(duì)新環(huán)境(比如開放臂)易產(chǎn)生一定的好奇心去探究，EPM范式主要依靠?jī)烧咧g的沖突產(chǎn)生焦慮心理進(jìn)行測(cè)試。本研究發(fā)現(xiàn)CD-1小鼠焦慮行為在不同飼養(yǎng)方式間具有不同的行為表現(xiàn)，即SG組小鼠對(duì)應(yīng)的焦慮行為相關(guān)參數(shù)(如OE%、OT%、OE%)均顯著高于SI組，說明其焦慮水平較低，面對(duì)新環(huán)境的探究行為多，能夠克服對(duì)高懸敞開環(huán)境的恐懼；反之，SI組小鼠進(jìn)入開放臂次數(shù)以及停留時(shí)間少，反映其焦慮水平高、探究性行為少。同時(shí)，SG組小鼠在開放臂或中央?yún)^(qū)頭向下探究次數(shù)顯著多于SI組，表明SG組小鼠在非保護(hù)區(qū)域內(nèi)的探索活動(dòng)更多、更大膽，與其焦慮水平較低相關(guān)。本結(jié)果與既往嚙齒類動(dòng)物的研究一致(Lukkes.，2009；Chang & Gean，2019)，即經(jīng)過社會(huì)隔離飼養(yǎng)的CD-1小鼠表現(xiàn)出更高的焦慮水平。

4.2 不同腦區(qū)的EEG節(jié)律特征受小鼠所處位置調(diào)制

將CD-1小鼠停留在EPM的臂型和外周生理信號(hào)結(jié)合起來探究行為表現(xiàn)和生理標(biāo)記之間的聯(lián)系，發(fā)現(xiàn)低外周狀態(tài)(生理表現(xiàn)為穩(wěn)定的呼吸周期以及正常的心率，可理解為非焦慮狀態(tài))只出現(xiàn)在閉合臂的遠(yuǎn)端區(qū)域，而在靠近中心區(qū)的閉合臂區(qū)域沒有觀察到這種狀態(tài)(Okonogi.，2018)。因本實(shí)驗(yàn)沒有進(jìn)行外周生理信號(hào)的采集、且近端區(qū)域的LFP結(jié)果與遠(yuǎn)端相似，故選取2個(gè)臂型的遠(yuǎn)端區(qū)域進(jìn)行結(jié)果匯報(bào)與討論。與以往研究一致，本研究發(fā)現(xiàn)閉合臂對(duì)應(yīng)的絕對(duì)功率譜均顯著大于開放臂，尤其是與表達(dá)焦慮狀態(tài)等情緒相關(guān)的θ節(jié)律(Pape.，2005)。分析大鼠從EPM的閉合臂走向開放臂時(shí)的LFPs，發(fā)現(xiàn)θ節(jié)律的絕對(duì)功率譜在閉合臂內(nèi)會(huì)突然增大，在離開閉合臂進(jìn)入開放臂時(shí)顯著下降，表明θ節(jié)律參與大鼠對(duì)開放臂的探索行為，θ節(jié)律功率的增大會(huì)抑制探索行為，而減少會(huì)增加(Lu.，2018)。

調(diào)控焦慮行為的環(huán)路較為復(fù)雜，集中于情緒邊緣系統(tǒng)，包括內(nèi)側(cè)前額葉、海馬、杏仁核和下丘腦等。本研究發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于SG組而言，SI組小鼠大部分腦區(qū)對(duì)應(yīng)的EEG各節(jié)律的絕對(duì)功率譜在開放臂或閉合臂均具有上調(diào)趨勢(shì)(因未達(dá)到統(tǒng)計(jì)顯著性，結(jié)果未匯報(bào))。這一結(jié)果與慢性應(yīng)激造成小鼠杏仁核基底外側(cè)核LFP的EEG各節(jié)律的絕對(duì)功率譜均具有上調(diào)趨勢(shì)的結(jié)果一致(姜方潔等，2016)，亦與運(yùn)動(dòng)疲勞后大鼠探索行為減少、焦慮樣行為增多、并伴有海馬CA1區(qū)θ節(jié)律活動(dòng)增強(qiáng)(孫麗娜等，2021)以及人類兒童低頻EEG節(jié)律的功率譜隨不利生活環(huán)境上調(diào)的結(jié)果一致(Knyazev，2012)。但是本研究發(fā)現(xiàn)的EEG各節(jié)律的絕對(duì)功率譜在SG組和SI組之間的差異并不顯著，這可能與當(dāng)前研究采用的隔離時(shí)長(zhǎng)(2周)較短有關(guān)。此外，我們發(fā)現(xiàn)LFP各節(jié)律的絕對(duì)功率譜均表現(xiàn)為內(nèi)側(cè)前額葉最大，這可能與該腦區(qū)高度參與小鼠的情緒反應(yīng)及認(rèn)知過程(Zheng & Zhang，2015)、前額葉的皮層調(diào)控作用(Adhikari.，2010；Lesting.，2011)、各腦區(qū)之間協(xié)同響應(yīng)(Jinks & McGregor，1997；Felix-Ortiz.，2013，2016)等認(rèn)知活動(dòng)相關(guān)。未來研究可考慮延長(zhǎng)隔離時(shí)長(zhǎng)或者采用雙光子顯微鏡等空間分辨率更高的技術(shù)手段進(jìn)一步研究隔離飼養(yǎng)對(duì)大腦神經(jīng)活動(dòng)模式或相關(guān)腦區(qū)樹突棘的形態(tài)和結(jié)構(gòu)的影響，進(jìn)而探討動(dòng)物焦慮行為與大腦功能之間的因果聯(lián)系。