樸弋戈, 唐業(yè)忠, 陳勤*

(1.中國科學(xué)院成都生物研究所,成都610041；2.中國科學(xué)院大學(xué),北京100049)

毒液作為毒蛇的鑒別特征，是由多種酶、多肽等組成的混合液體(Elliott，1978；Iwanaga & Suzuki,1979)，主要用于制服獵物、完成捕食以及進(jìn)行防御等(Hayes.，2002；Kerkkamp.，2017)。自然狀態(tài)下，盡管毒腺內(nèi)的毒液處于排出與分泌的動態(tài)平衡中，其在一定時間內(nèi)仍是一種有限且重要的資源(Willemse.，1979；McCue，2006)。因此，曾有研究者推測毒蛇可能具有根據(jù)獵物的差異衡量并主動控制其注毒量的能力(Allon & Kochva,1974；Hayes，1995；Hayes.，1995)。

蝮亞科Crotalinae物種約占毒蛇物種數(shù)的1/3(Zaher.，2019)，具有高度敏感的熱感應(yīng)器官——頰窩，可感知低至0.003 ℃的溫度變化(Bullock & Diecke,1956；Buning.，1981)。這一感官使蝮蛇可以獲取環(huán)境中的熱信息，在黑暗環(huán)境中捕食恒溫動物時具有重要作用(Kardong & Mackessy,1991；Krochmal & Bakker,2003)。在捕食行為中，除了視覺、嗅覺和振動覺等感官系統(tǒng)外，蝮蛇可先憑借紅外感知系統(tǒng)對獵物進(jìn)行識別和定位，再利用毒液使其喪失活動能力(乃至死亡)以完成取食。頰窩與毒液系統(tǒng)在蝮蛇捕食行為中存在明確的承接關(guān)系。在捕食不同體溫的獵物過程中，獵物體溫的差異可能表征種類和狀態(tài)，而這些差異是否影響攻擊時的注毒量則有待證明。

本研究對短尾蝮投喂經(jīng)人為控制溫度的死亡乳鼠，模擬其在自然環(huán)境中多樣化獵物的溫度差異。通過記錄捕食行為并測定注毒量，探討獵物體溫對短尾蝮捕食注毒量的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

短尾蝮是廣泛分布于我國的一種蝮亞科蛇類(趙爾宓，2006)，個體相對較小，在蝮蛇行為學(xué)、生理學(xué)研究中可操作性強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)選取7條實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)的短尾蝮亞成體(3條雄性，4條雌性)，吻肛長(36.37±2.51)cm，尾長(5.24±0.60)cm，體質(zhì)量(36.0±8.6)g。

實(shí)驗(yàn)動物均單獨(dú)飼養(yǎng)于飼養(yǎng)箱(長32 cm×寬22 cm×高19 cm)中，箱內(nèi)墊料為報紙，放置一水盆并保持凈水供應(yīng)，同時放置一爬蟲躲避穴(長 23 cm×寬16.5 cm×高7.5 cm)供蛇隱藏。飼養(yǎng)房內(nèi)設(shè)定室溫為25 ℃，實(shí)際記錄室溫為(25.41±0.32)℃，光周期為 12 h∶12 h，光照時間為 08∶00—20∶00。實(shí)驗(yàn)期間短尾蝮均僅在實(shí)驗(yàn)中進(jìn)食。

使用冷凍乳鼠作為食物，所有乳鼠均為初生小鼠(約2日齡昆明小鼠，不區(qū)分性別)，體質(zhì)量(2.064±0.384)g。實(shí)驗(yàn)前，每10只用一潔凈自封袋包裝，以混合不同乳鼠之間的氣味。為保證溫度均衡，封閉后的自封袋浸沒于水浴鍋中化凍90 min，使乳鼠達(dá)到設(shè)置溫度。按照預(yù)設(shè)獵物體溫，設(shè)置為高溫組(34.00 ℃±0.18 ℃)、中溫組(26.01 ℃±0.25 ℃)和低溫組(19.57 ℃±1.40 ℃)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方案

對每條短尾蝮樣本，分別進(jìn)行高、中、低3個溫度梯度的模擬“獵物”捕食實(shí)驗(yàn)。每個溫度梯度進(jìn)行2次重復(fù)，因此每條蛇完成6次捕食實(shí)驗(yàn)。依據(jù)多數(shù)蝮亞科蛇類夜行性規(guī)律(Oliveira & Martins,2001；Sawant & Shyama,2007)，所有實(shí)驗(yàn)均在19∶30—22∶00進(jìn)行。為消除進(jìn)食后食欲下降的影響，實(shí)驗(yàn)間隔時間均超過7 d。為規(guī)避環(huán)境變化對動物產(chǎn)生的應(yīng)激影響，所有實(shí)驗(yàn)均在個體所在飼養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行(Glaudas，2004)；實(shí)驗(yàn)場所即日常飼養(yǎng)房，維持動物的正常飼養(yǎng)溫度。同時，使用雙層黑色塑料袋和金屬框架制作了一個矩形圍帳(長 72 cm×寬70 cm×高70 cm)，實(shí)驗(yàn)時將飼養(yǎng)箱置于其中以減少外界環(huán)境的干擾。為避免不同實(shí)驗(yàn)日期伴隨的環(huán)境系統(tǒng)誤差以及順序效應(yīng)，個體和條件以隨機(jī)順序進(jìn)行測試。

1.3 操作流程

單次實(shí)驗(yàn)流程如下：實(shí)驗(yàn)時將飼養(yǎng)箱置于圍帳中，手動打開箱蓋后，取出躲避穴，給予無打擾的 3 min 適應(yīng)時間(Mori.，2016)。適應(yīng)時間末期，取出加溫至實(shí)驗(yàn)條件的解凍乳鼠，搽拭去多余水分后用分析天平(JA1003A，精度1 mg，準(zhǔn)確度Ⅱ級；精天電子儀器有限公司，上海)稱重。使用紅外測溫儀(HT-866，廣州市宏誠集業(yè)電子科技有限公司，廣州)聚焦于乳鼠腹部距離5 cm處，待示數(shù)穩(wěn)定后讀取溫度示數(shù)。隨后，使用白色縫紉棉線(長度75 cm)一側(cè)線頭以活扣固定乳鼠，另一線頭連接于金屬蛇鉤，操作蛇鉤使乳鼠晃動于蛇頭部前方(Hayes & Hayes,1993；Araujo & Martins,2007)約 5 cm處，以模擬獵物的運(yùn)動。至蛇發(fā)動攻擊行為停止實(shí)驗(yàn)，或計時2 min結(jié)束后停止實(shí)驗(yàn)，記錄實(shí)驗(yàn)時間與動物吐舌次數(shù)。取下乳鼠置于分析天平上稱量以計算注毒量，舍棄無法判明注毒量的數(shù)據(jù)(Kochva，1960)。所有稱量均連續(xù)操作3次，取平均值。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將蛇放回躲避穴，同時放入乳鼠，記錄實(shí)驗(yàn)個體是否正常進(jìn)食。捕食過程使用佳能EOS 80D以50幀/s俯視拍攝記錄。

1.4 統(tǒng)計分析

采用Mann-Whitney檢驗(yàn)比較各組內(nèi)2輪實(shí)驗(yàn)間參數(shù)的差異，采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)分析比較多組樣本間的獵物體溫、實(shí)驗(yàn)時間、吐舌次數(shù)和注毒量的差異。

采用Spearman相關(guān)性分析處理各主要變量與注毒量的相關(guān)性。在進(jìn)行形態(tài)學(xué)變量相關(guān)性分析時，雌性和雄性分別以數(shù)字1和2表示。

2 結(jié)果與分析

共獲得42次有效測試數(shù)據(jù)，其中表現(xiàn)明顯捕食攻擊30次，無攻擊5次(均來自9號)，試圖直接進(jìn)食7次。實(shí)際記錄最大排毒量17 mg，最小 1 mg，均值6.76 mg。

2.1 差異性分析

3組組內(nèi)2輪實(shí)驗(yàn)之間短尾蝮捕食注毒量均無顯著性差異(高溫組：=19.000，=0.537；中溫組：=18.000，=0.662；低溫組：=12.000，=0.662)。

雖然實(shí)驗(yàn)中各組獵物體溫均由水浴鍋控制于預(yù)定溫度，表現(xiàn)出較小的變化(中溫組和低溫組變異系數(shù)分別為0.96%和7.15%)，但組內(nèi)2輪實(shí)驗(yàn)的獵物體溫呈現(xiàn)出顯著性差異(高溫組：=15.000，=0.259；中溫組：=44.500，=0.007；低溫組：=48.500，=0.001)，將3個溫度梯度組的各2輪重復(fù)實(shí)驗(yàn)劃分為6組：高溫組1、高溫組2、中溫組1、中溫組2、低溫組1和低溫組2。在獵物體溫方面，低溫組1與高溫組1(<0.001)和高溫組2(<0.001)、低溫組2與高溫組1(=0.001)和高溫組2(=0.006)之間的差異極顯著(=38.643，=5)，低溫組1與中溫組2具有顯著性差異(=0.029)。6組動物的吐舌次數(shù)(=1.279，=5，=0.937)、實(shí)驗(yàn)時間(=3.546，=5，=0.616)之間均無顯著差異，且 6組注毒量之間的差異不顯著(=4.723，=5，=0.451)。

2.2 相關(guān)性分析

獵物體溫與室溫表現(xiàn)出顯著相關(guān)性(r=-0.359，=0.019)，但因?yàn)楂C物體溫是人為設(shè)定，因此該相關(guān)性不被采用。吐舌次數(shù)與實(shí)驗(yàn)時間存在極顯著相關(guān)性(r=0.756，<0.001)，注毒量與獵物體溫?zé)o顯著相關(guān)性(r=0.007，=0.968；表1)。

表1 與各環(huán)境變量間的相關(guān)性分析

體質(zhì)量與吻肛長(r=0.901，<0.001)和尾長(r=0.559，<0.001)皆具有極顯著相關(guān)性，吻肛長與尾長極顯著相關(guān)(r=0.464，=0.002)。注毒量與體質(zhì)量顯著相關(guān)(r=0.506，=0.019);與吻肛長極顯著相關(guān)(r=0.595，=0.004；表2；圖1)。

表2 與各形態(tài)變量間的相關(guān)性分析

圖1 注毒量與吻肛長(A)和體質(zhì)量(B)之間的相關(guān)性

3 討論

本實(shí)驗(yàn)通過人為操作使小鼠乳鼠達(dá)到不同的溫度，模擬自然狀態(tài)下不同體溫的獵物，主要關(guān)注短尾蝮的注毒量是否因獵物體溫不同而表現(xiàn)差異。

結(jié)果顯示，6個溫度組短尾蝮捕食注毒量均不具有統(tǒng)計學(xué)差異。

在相關(guān)性分析中，體質(zhì)量與吻肛長和尾長均有極顯著相關(guān)性，吻肛長與尾長極顯著相關(guān)；這一結(jié)果符合蛇類形態(tài)學(xué)特征，即同一種內(nèi)，較大的蛇表現(xiàn)為長度更長、體質(zhì)量更大。實(shí)驗(yàn)中，短尾蝮吐舌次數(shù)與實(shí)驗(yàn)時間極顯著相關(guān)。因?qū)嶒?yàn)時間為從提供乳鼠開始計時至短尾蝮撲咬攻擊停止計時，實(shí)驗(yàn)時間反映出實(shí)驗(yàn)個體面對“獵物”的時間。該結(jié)果符合蝮蛇的捕食行為特征：攻擊前持續(xù)吐舌獲取獵物信息，攻擊時無吐舌行為，攻擊后該行為用于追蹤注毒后逃逸的獵物(Chiszar.，1982)。同時，實(shí)驗(yàn)中捕食注毒量與體質(zhì)量表現(xiàn)出顯著相關(guān)性，注毒量和吻肛長極顯著相關(guān)。盡管早期關(guān)于毒蛇體型與注毒量的研究僅提供了模糊的結(jié)論(Gennaro.，1961；Morrison.，1983)，但Herbert(1998)明確了同一種內(nèi)體型與注毒量的正相關(guān)性。目前已證實(shí)的諸多影響因素中，體型是影響同一種內(nèi)注毒量的主要因素(Hayes.，2002)。國內(nèi)對人工養(yǎng)殖尖吻蝮的研究亦報道了相似的結(jié)果(黃松等，2004)。

毒液具有儲存限制、代謝成本及其耗竭后的生態(tài)代價，是一種珍貴的資源(McCue，2006；Smith.，2014)。因此，衡量毒液、合理分配毒液使用的能力(毒液認(rèn)知)被認(rèn)為在有毒動物的進(jìn)化過程中具有適應(yīng)意義。目前研究已經(jīng)證明，多種有毒動物具有根據(jù)不同情況調(diào)整注毒量的能力(Boevé.，1995；Hayes.，1995)。隨著研究種類的不斷增加，更多有毒動物極可能被證實(shí)具有這樣的能力(Hayes.，2002)。

Hayes等(2002)研究指出，體溫較高的變溫動物活動性更強(qiáng)(逃逸能力更強(qiáng))，在測試中表現(xiàn)為死亡更快。因此毒蛇在捕食不同體溫的變溫動物時，可能需要采取不同的注毒策略，分配不同的注毒量。這一推測對于蝮亞科蛇類尤其具有意義：蝮蛇的頰窩在捕食恒溫動物時提供了顯著的優(yōu)勢(Embar.，2018)，而這一器官在捕食變溫動物時起到怎樣的作用卻并不明確。本研究關(guān)注短尾蝮能否根據(jù)獵物體溫差異調(diào)整注毒量。由于具有高度的敏感性(Bullock & Diecke，1956；Buning.，1981)，在面對不同溫度的獵物時，蝮蛇無疑能夠通過頰窩感知其體溫差異。本實(shí)驗(yàn)中 3組組間溫差約8 ℃，而注毒量卻未表現(xiàn)出顯著的組間差異。因此推測，溫度差異可能并不會引起短尾蝮對獵物表現(xiàn)出差異化的注毒量。

盡管已有研究使用線牽引刺激物的方式進(jìn)行行為學(xué)探究(Hayes & Hayes，1993；Araujo & Martins，2007)，但該模式并不能完全模擬小型嚙齒類的正?；顒訝顟B(tài)。本實(shí)驗(yàn)中使用的獵物為化凍乳鼠，而實(shí)驗(yàn)所用的短尾蝮日常均使用活體小鼠喂食，活體小鼠與線牽引下乳鼠的行動狀態(tài)的差別可能會影響蛇對獵物的判斷。此外，雖然使用了矩形圍帳遮蔽周圍環(huán)境，但短尾蝮仍能從圍帳上方觀察到實(shí)驗(yàn)人員，實(shí)驗(yàn)過程中亦存在個體抬頭注意實(shí)驗(yàn)人員所處方向的行為。因此，盡管未見明顯的防御行為，人為干擾可能影響了短尾蝮，使其表現(xiàn)出對乳鼠的捕食行為和對人員的防御行為的權(quán)衡。在這種非自然狀態(tài)下，短尾蝮可能表現(xiàn)出撲咬攻擊時單一化或最大化的注毒量，混淆了實(shí)驗(yàn)結(jié)果。6組實(shí)驗(yàn)之間，短尾蝮吐舌次數(shù)與實(shí)驗(yàn)時間均無顯著差異。實(shí)驗(yàn)完成后，以乳鼠投喂實(shí)驗(yàn)個體，除9號個體前 4次實(shí)驗(yàn)連續(xù)未進(jìn)食和14號僅1次未進(jìn)食外(共 5次)，其余個體均連續(xù)進(jìn)食，拒食現(xiàn)象并不常見。在進(jìn)食37次中，30次均存在明顯撲咬攻擊，表現(xiàn)出正常的捕食行為。因此，獵物運(yùn)動狀態(tài)的差異和人為操作的因素雖不能排除，但對實(shí)驗(yàn)組的捕食過程影響應(yīng)較小，未造成組間差異。

由于日常捕食的獵物種類顯著影響了蛇類對獵物氣味的偏好(Gove & Burghardt，1975)，而幾乎所有實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)的蝮亞科蛇類均使用實(shí)驗(yàn)小鼠或大鼠作為食物(Murphy.，1994)，因此本實(shí)驗(yàn)使用人為控制溫度的乳鼠。尚無研究指出蛇類能否通過氣味區(qū)分恒溫獵物與變溫獵物。在捕食蛙類、蜥蜴等活體變溫動物的行為中，短尾蝮乃至其他蝮亞科蛇類是否具有根據(jù)獵物體溫調(diào)整注毒量的能力仍有待進(jìn)一步探究。

基于目前的結(jié)果，我們謹(jǐn)慎地提出以下結(jié)論：在捕食小型哺乳類獵物的行為中，短尾蝮并不會根據(jù)獵物體溫調(diào)整排毒量。