共同性外斜視患兒眼外肌中IGF-1、AnxA1表達(dá)及與病理特征的關(guān)系

李 威，侯文文，李 影，章志揚(yáng)

共同性外斜視是眼科常見斜視類型，危害大，發(fā)病率高，影響雙眼視覺形成及發(fā)育，是引起兒童雙眼視功能障礙的重要原因，同時(shí)有礙外觀，影響患者身心健康[1]。共同性外斜視發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，多認(rèn)為與先天及解剖因素等有關(guān)[2]。既往研究多集中于眼外肌病理改變方面，包括眼外肌本體感受器、組織間質(zhì)成分改變等[3]。最新研究發(fā)現(xiàn)，胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)可調(diào)控蛋白肌酶信號(hào)傳導(dǎo)，影響肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖、分化，促進(jìn)肌纖維蛋白合成，修復(fù)肌細(xì)胞損傷[4]。動(dòng)物研究認(rèn)為，外源性補(bǔ)充眼外肌IGF-1可擴(kuò)大肌纖維橫截面積，提升肌肉收縮力[5]。LEIKINA等[6]報(bào)道，肌衛(wèi)星細(xì)胞靜止、活化期均可出現(xiàn)膜聯(lián)蛋白A1(AnxA1)表達(dá)，促進(jìn)肌衛(wèi)星細(xì)胞遷移，并參與骨骼肌修復(fù)過(guò)程。推測(cè)IGF-1、AnxA1均可能通過(guò)調(diào)節(jié)眼外肌活化肌衛(wèi)星細(xì)胞等途徑影響眼外肌組織特性及生物學(xué)功能。為探究共同性外斜視眼外肌IGF-1、AnxA1表達(dá)情況及其與病理特征的關(guān)系，本研究檢測(cè)共同性外斜視與非共同性外斜視患者眼外肌IGF-1、AnxA1表達(dá)情況，并探討其與病理特征的關(guān)系，以期為共同性外斜視病理機(jī)制的研究提供參考。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象 選取2016年1月—2019年12月我院收治的共同性外斜視患兒53例(82眼)作為斜視組。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡3～14歲；符合共同性外斜視診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]；有手術(shù)指征，至少接受一條內(nèi)直肌縮短術(shù)治療；留存內(nèi)直肌標(biāo)本；無(wú)眼球運(yùn)動(dòng)障礙；第一、二斜視角相同；斜視度50～140△；臨床資料完善。排除標(biāo)準(zhǔn)：有眼部外傷史、手術(shù)史者；有家族遺傳史者；內(nèi)直肌麻痹者；合并神經(jīng)系統(tǒng)疾病者；顱面異常者；伴其他視覺缺陷疾病或眼病者；嚴(yán)重屈光不正、重度弱視或屈光參差者；伴其他器質(zhì)性病變者；已接受斜視矯正者。斜視組男23例(32眼)、女30例(50眼)；年齡3～14(7.12±2.21)歲；病程1～6(3.76±1.21)年；斜視度(83.51±15.57)△。另選取同期行眼球摘除或角膜移植獲得內(nèi)直肌的正常眼位患兒30例(30眼)作為對(duì)照組，其中男12例(12眼)、女18例(18眼)；年齡3～13(7.06±2.19)歲。2組一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)執(zhí)行。

1.2觀察指標(biāo) ①比較2組眼外肌IGF-1、AnxA1表達(dá)；②觀察2組眼外肌組織病理改變，記錄肌纖維排列異常率、Z線異常率、單位面積內(nèi)線粒體數(shù)目、肌纖維截?cái)嗝娣e；③分析共同性外斜視患兒眼外肌IGF-1、AnxA1表達(dá)與病理特征及斜視度的關(guān)系。

1.3標(biāo)本取材與保存 共同性外斜視患兒入院均行常規(guī)眼科檢查，常規(guī)行內(nèi)直肌縮短術(shù)治療，術(shù)中截取非注視眼內(nèi)直肌附著點(diǎn)后5 mm×5 mm眼外肌，液氮凍存?zhèn)溆?。同樣方法取?duì)照組內(nèi)直肌凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4免疫組織化學(xué)染色法測(cè)定IGF-1、AnxA1水平 IGF-1、AnxA1檢測(cè)采用免疫組織化學(xué)染色法，試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。眼外肌蠟塊連續(xù)切片(3 μm)，脫蠟至水，60 ℃溫箱烘烤24 h，二甲苯脫蠟3次，每次5 min，100%、95%、75%乙醇脫水各2 min，自來(lái)水沖洗，蒸餾水浸泡2次，每次5 min，枸櫞酸緩沖液浸泡熱修復(fù)15 min，室溫自然冷卻，磷酸鹽緩沖液沖洗3次，每次3 min。3%過(guò)氧化氫去離子水孵育10 min，清除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，磷酸鹽緩沖液洗滌3次，每次3 min。正常山羊血清封閉15 min，甩去多余液體，加兔抗IGF-1多克隆抗體(1︰50)/兔抗人AnxA1多克隆抗體(1︰300)，4 ℃濕盒內(nèi)過(guò)夜。磷酸鹽緩沖液洗滌3次，每次3 min，滴入生物素標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白G，37 ℃孵育15 min，磷酸鹽緩沖液洗滌3次，每次3 min。加入辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素，37 ℃孵育15 min，磷酸鹽緩沖液洗滌3次，每次3 min，加入顯色劑顯色5～10 min，蒸餾水浸泡洗滌10 min終止染色，蘇木素復(fù)染，蒸餾水沖洗5 min，85%、95%、100%乙醇脫水各5 min，二甲苯透明，中性樹膠封片。采用日本Olympus公司BH-2型光鏡下拍照并觀察，隨機(jī)取5個(gè)高倍視野，觀察肌細(xì)胞IGF-1、AnxA1陽(yáng)性著色情況，以光鏡下胞漿見棕黃色、棕褐色顆粒視為陽(yáng)性，Image Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)自動(dòng)計(jì)算肌細(xì)胞IGF-1、AnxA1光密度值。

1.5肌組織病理改變觀察 用顯微手術(shù)剪將2組眼內(nèi)直肌組織剪成2 mm×1 mm×1 mm大小，3%戊二醛固定，磷酸鹽緩沖液洗滌3次，每次15 min，四氧化鋨固定2 h后重復(fù)洗滌3次，50%、70%、90%乙醇各脫水15 min，90%乙醇及90%丙酮1︰1混合脫水15 min，90%丙酮脫水15 min，100%丙酮脫水3次，每次15 min，環(huán)氧樹脂混合液浸泡24 h，定向包埋，37 ℃過(guò)夜。45 ℃烘箱內(nèi)烘烤12 h，60 ℃繼續(xù)烘烤24 h，半薄切片定位，超薄切片機(jī)切片，3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛染色。采用日本Olympus公司BX-40型透射電鏡下觀察并拍照，隨機(jī)取3個(gè)高倍視野觀察肌纖維、肌原纖維超微結(jié)構(gòu)，采用德國(guó)OPTON Cooperation公司Image Analyzer圖像分析軟件測(cè)定肌纖維直徑、肌纖維截?cái)嗝娣e，計(jì)算肌纖維排列不規(guī)則比率、Z線異常率、單位面積內(nèi)線粒體數(shù)目[8]。Z線模糊、扭曲或消失任一異常視為Z線異常，異常率=每視野異常Z線/每視野所測(cè)總Z線×100%。

2 結(jié)果

2.1IGF-1、AnxA1光密度值比較 斜視組IGF-1、AnxA1光密度值均低于對(duì)照組(P<0.01)，見表1與圖1～2。

圖1 是否患共同性外斜視2組患兒眼外肌IGF-1表達(dá)(SP×200)

表1 是否患共同性外斜視2組患兒眼外肌IGF-1、AnxA1光密度值比較

2.2眼外肌組織病理改變 光鏡下可見斜視組患眼眼外肌肌纖維數(shù)量減少，肌絲破壞明顯，伴局灶性肌絲溶解，肌纖維玻璃樣改變，肌纖維結(jié)締組織增生，伴不均勻纖維條索樣變，間質(zhì)成分增多，神經(jīng)纖維數(shù)量減少，漿細(xì)胞變性、壞死，肌細(xì)胞核內(nèi)移，伴大量線粒體聚集，肌絲排列紊亂，形態(tài)不規(guī)則，線粒體異常，呈空泡狀，肌小節(jié)Z帶不清晰或消失；光鏡下可見對(duì)照組眼外肌均勻分布的肌纖維，排列規(guī)則、緊密、整齊，Z帶清晰，群組化明顯，無(wú)膠原組織增生。見圖3。斜視組肌纖維排列異常率、Z線異常率及單位面積內(nèi)線粒體數(shù)目均高于對(duì)照組，肌纖維截?cái)嗝娣e小于對(duì)照組(P<0.01)。見表2。

表2 是否患共同性外斜視2組患兒眼外肌組織病理改變比較

圖2 是否患共同性外斜視2組患兒眼外肌AnxA1表達(dá)(SP×200)

圖3 是否患共同性外斜視2組患兒眼外肌光鏡下病理圖像(HE×400)

2.3共同性外斜視患者眼外肌IGF-1、AnxA1表達(dá)與病理特征及斜視度的關(guān)系 斜視組眼外肌IGF-1表達(dá)與AnxA1、肌纖維截?cái)嗝娣e呈正相關(guān)(P<0.01)，與肌纖維排列異常率、Z線異常率、單位面積內(nèi)線粒體數(shù)目、斜視度均呈負(fù)相關(guān)(P<0.01)；AnxA1表達(dá)與肌纖維截?cái)嗝娣e呈正相關(guān)(P<0.01)，與肌纖維排列異常率、Z線異常率、單位面積內(nèi)線粒體數(shù)目、斜視度均呈負(fù)相關(guān)(P<0.01)。見表3。

表3 共同性外斜視患兒眼外肌IGF-1、AnxA1表達(dá)與病理特征及斜視度的關(guān)系

3 討論

既往認(rèn)為，共同性外斜視患者在注視各方向時(shí)偏斜角度相同，眼外肌無(wú)明顯器質(zhì)性病變[9]。但隨著研究不斷深入，越來(lái)越多的報(bào)道指出，斜視、弱視側(cè)眼外肌有明顯病理變化，可出現(xiàn)間質(zhì)成分增多、肌細(xì)胞減少、線粒體病變及肌絲破壞等肌源性損害和細(xì)胞結(jié)構(gòu)變性等[10-11]。馬曉梅等[12]研究發(fā)現(xiàn)，共同性外斜視患者外直肌光鏡下有明顯纖維萎縮性病變，眼外肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)直接影響斜視度及手術(shù)治療效果。本研究發(fā)現(xiàn)，斜視組眼外肌普遍存在纖維變性，Z帶分界欠清晰，肌纖維排列紊亂，線粒體數(shù)目增多，肌纖維排列異常率、Z線異常率、單位面積內(nèi)線粒體數(shù)目上升，支持上述結(jié)論及國(guó)外報(bào)道[13]結(jié)果，與對(duì)照組肌纖維鏡下特征有明顯區(qū)別。提示共同性外斜視患者患側(cè)眼外肌存在不同程度變性、退化，推測(cè)眼外肌肌纖維病理改變可能是產(chǎn)生外斜視的重要原因。共同性外斜視患者肌纖維發(fā)育不良、萎縮變性，肌纖維排列紊亂，線粒體供能不足，無(wú)法支撐眼內(nèi)肌完成有效收縮，導(dǎo)致患側(cè)眼外肌收縮能力減弱，對(duì)側(cè)眼外肌肌力相對(duì)較強(qiáng)，雙側(cè)眼外肌肌力不平衡，故出現(xiàn)眼位偏斜。

共同性外斜視眼外肌肌纖維改變的確切機(jī)制尚未完全闡明。新近文獻(xiàn)報(bào)道，肌衛(wèi)星細(xì)胞功能與肌纖維改變存在緊密關(guān)聯(lián)，而成肌調(diào)節(jié)因子及各類生長(zhǎng)因子均影響肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖及分化，導(dǎo)致肌纖維結(jié)構(gòu)及功能改變[14]。IGF-1為多功能細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)因子，作為刺激因子可與其他細(xì)胞周期刺激因子協(xié)同促進(jìn)細(xì)胞有絲分離；IGF-1亦屬于合成類激素，可參與蛋白質(zhì)、糖類、核酸等合成及代謝過(guò)程。多項(xiàng)研究證實(shí)，IGF-1參與了多種炎癥性疾病、惡性腫瘤的發(fā)病過(guò)程[15-16]。王麗娜[17]開展的一項(xiàng)動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)，IGF-1可刺激骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖，加速肌纖維收縮。湯志錚等[18]發(fā)現(xiàn)，IGF-1與受體結(jié)合可誘導(dǎo)晶狀體上皮細(xì)胞增殖，參與白內(nèi)障發(fā)病過(guò)程。王益丹[19]發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)貓內(nèi)直肌注射IGF-1后肌衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)目較空白組增多，認(rèn)為外源性補(bǔ)充IGF-1可改善肌纖維功能。本研究發(fā)現(xiàn)，斜視組IGF-1光密度值較對(duì)照組低，且與肌纖維排列異常率、Z線異常率、單位面積內(nèi)線粒體數(shù)目、斜視度呈負(fù)相關(guān)，與肌纖維截?cái)嗝娣e呈正相關(guān)。推測(cè)共同性外斜視患者眼外肌IGF-1表達(dá)下降會(huì)影響肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖、分化，降低患眼肌纖維修復(fù)能力，造成眼外肌肌纖維紊亂，肌纖維直徑縮短，體積縮小，肌纖維萎縮，進(jìn)一步影響眼外肌肌力，增加斜視發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。且隨IGF-1降低，眼外肌損傷后修復(fù)能力弱化，肌力失衡，控制能力降低，斜視度增加，導(dǎo)致斜視進(jìn)展。故認(rèn)為IGF-1可能參與共同性外斜視發(fā)生與進(jìn)展過(guò)程。

AnxA1屬磷脂結(jié)合蛋白家族成員，介導(dǎo)抗炎及細(xì)胞黏附、遷移、增殖、分化等生物學(xué)過(guò)程。既往研究已證實(shí)AnxA1可抑制癌細(xì)胞增殖、分化[20]。近期有報(bào)道指出，AnxA1參與肌細(xì)胞膜修復(fù)過(guò)程，其局部水平升高可促進(jìn)細(xì)胞膜融合[21]。付令利[22]體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，肌衛(wèi)星細(xì)胞靜止期與活化后均可表達(dá)AnxA1，尤其增殖、分化的肌細(xì)胞AnxA1表達(dá)水平較高。本研究發(fā)現(xiàn)，斜視組眼外肌AnxA1光密度值較對(duì)照組低，推測(cè)AnxA1參與眼外肌的修復(fù)過(guò)程。眼外肌AnxA1表達(dá)降低，導(dǎo)致肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖、分化能力降低，影響肌管形成及修復(fù)，造成眼外肌肌力失衡，導(dǎo)致共同性外斜視發(fā)生[23]。本研究還發(fā)現(xiàn)，共同性外斜視患者眼外肌AnxA1表達(dá)與肌纖維排列異常率、Z線異常率、單位面積內(nèi)線粒體數(shù)目、斜視度呈負(fù)相關(guān)，與肌纖維截?cái)嗝娣e呈正相關(guān)，推測(cè)AnxA1低表達(dá)可能導(dǎo)致肌衛(wèi)星細(xì)胞活化數(shù)量減少，造成肌纖維萎縮變性，引起內(nèi)環(huán)境改變，影響眼外肌自身修復(fù)，加重肌細(xì)胞萎縮變性及肌纖維排列紊亂，造成肌小節(jié)破壞及膠原組織增生，而上述病理變化均可能影響眼外肌收縮功能，造成眼外肌過(guò)度松弛、收縮力降低，誘發(fā)外斜視。

綜上，共同性外斜視患兒眼外肌IGF-1、AnxA1表達(dá)較正常眼位兒童降低，二者表達(dá)下降可能通過(guò)影響肌衛(wèi)星細(xì)胞活化等途徑，引起肌纖維變性、壞死，影響眼外肌自身修復(fù)及收縮、控制功能，造成共同性外斜視。