◎ 王 華，蒙麗瓊，黃芯語，金其揚，董志梅

（廣西中檢食品檢測有限公司，廣西 北海 536000）

廣西北部灣區(qū)域（主要是指欽州市、北海市、防城港市），具有得天獨厚的天然紅樹林灘涂，海水退潮后，灘涂上會留下小魚、小蝦、小蟹和藻類等海洋生物，這些高蛋白天然餌料成了海鴨的美食，海鴨產(chǎn)的海鴨蛋富含鐵、鎂、碘、鈣、磷和硒等多種對人體有益的微量元素和維生素，富含蛋白質(zhì)、氨基酸和益于增強智力的卵磷脂，且腦磷脂總量也比普通鴨蛋高[1]。海鴨將小蝦中的蝦青素、海藻中的β-胡蘿卜素，富集于所產(chǎn)的蛋黃中，使蛋黃顏色更深，甚至呈現(xiàn)紅黃色。由于目前對于海鴨蛋的研究主要集中于磷脂組成、脂肪酸組成、氨基酸和微量元素等方面，對于蛋黃中天然色素的含量組成研究較少或不全面[2-6]?；诖耍疚难芯客ㄟ^合理的前處理提取方法，采用高效液相色譜法同時測定海鴨蛋蛋黃中天然存在的類胡蘿卜素，并根據(jù)其測定總量和采用羅氏比色扇法測定的蛋黃色澤對比，分析兩者之間的相關(guān)規(guī)律。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

氫氧化鉀（分析純，西隴化工）；無水乙醇（分析純，西隴化工）；抗壞血酸（分析純，廣東光華科技）；木瓜蛋白酶（活力1.5～10 units/mg，SIGMA公司）；石油醚（分析純，西隴化工），乙醚（分析純，西隴化工）；無水硫酸鈉（分析純，國藥集團）；乙腈（色譜純，美國TEDIA公司）；試驗用水由Milli-Q Integral 10超純水機制備；玉米黃素（88.8%，德國Dr.Ehrenstorfer）；葉黃素（90.08%，美國Sigma-aldrich公司）；蝦青素（96.9%，德國Dr.Ehrenstorfer）；角黃素（96.8%，上海安譜公司）；β-胡蘿卜素（96.7%，上海安譜公司）。

在北海市、欽州市各采購10批次海鴨蛋樣品，每批次樣品采購數(shù)量不少于20個。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1260高效液相色譜儀（配DAD檢測器，美國安捷倫公司）；BUCHIR-3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士步琦公司）；SHZ-88恒溫水浴振蕩器（江蘇金怡儀器科技有限公司）；TGL-16G高速離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠司）；Milli-Q Integral 10超純水機（美國Millipore公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 標液的配制

各稱取不同標準物質(zhì)約10 mg，各加入1 mL二氯甲烷和無水乙醇溶解后，用色譜純乙腈定容至10 mL，配制成1 000 mg·L-1的不同物質(zhì)的母標液，各取1 mL用色譜純乙腈定容至10 mL，配制成100 mg·L-1的β-胡蘿卜素、角黃素、玉米黃、葉黃素和蝦青素混合標準溶液，各取0.05 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.50 mL、1.00 mL、2.00 mL和5.00 mL的100 mg·L-1混標于10 mL容量瓶中，用色譜純乙腈定容至刻度并 搖 勻 配 制 成0.5 mg·L-1、1.0 mg·L-1、2.0 mg·L-1、5.0 mg·L-1、10.0 mg·L-1、20.0 mg·L-1和50.0 mg·L-1的系列標準工作溶液，用于測定。

1.3.2 樣品制備

每批次各取10個，清洗干凈外殼，打碎去除蛋清后，先用羅氏比色扇法比色記錄其色度（取其平均值作為色度的最終結(jié)果），然后勻漿后作為天然色素的測定樣品處理用。

1.3.3 樣品提取

稱取均質(zhì)樣品5.0 g（精確至0.01 g）置于250 mL錐形瓶中，加入1 g抗壞血酸，加50 mL 45～50 ℃溫水混勻，加入0.5 g木瓜蛋白酶，蓋上瓶塞，置（55±1）℃恒溫水浴箱內(nèi)振蕩處理30 min后，加入50 mL無水乙醇，搖勻，再加入25 mL氫氧化鉀溶液，蓋上瓶塞。置于已預(yù)熱至（55±2）℃的恒溫振蕩水浴箱中，皂化30 min，取出靜置，冷卻到室溫，轉(zhuǎn)入250 mL分液漏斗，各用石油醚+乙醚（1+1，V/V）50 mL 洗滌錐形瓶后轉(zhuǎn)入分液漏斗萃取3次，合并3次的有機相萃取層，用50 mL一級水洗滌至中性后，過無水硫酸柱后于40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干，用5 mL乙腈溶解后，取2 mL于5 mL離心管中，加入2 mL正己烷，渦旋1 min，以8 000 r·min-1離心5 min，棄去正己烷相，下層乙腈相過0.22 μm濾膜后，進行分析。

1.3.4 色譜條件

色譜柱：Athena C30HPLC Column（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱分離，以甲醇+1%磷酸水+叔丁基甲醚作為流動相進行梯度洗脫，流速為1.0 mL·min-1，DAD檢測器，檢測波長474 nm，柱溫35 ℃；進樣量10 μL；流動相A：甲醇；流動相B：1%磷酸水；流動相C：叔丁基甲醚，梯度洗脫程序如表1所示。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取條件的優(yōu)化

動物自身不能合成類胡蘿卜素，其體內(nèi)的類胡蘿卜素來源于食物鏈富集，主要包括植物和微生物[7]。自然界主要的類胡蘿卜素有β-胡蘿卜素、角黃素、玉米黃、葉黃素、蝦青素和辣椒紅素等，由于辣椒紅素主要來源于辣椒，因此本試驗不考慮辣椒紅素，只設(shè)計測定海鴨食物鏈中可攝入的β-胡蘿卜素、角黃素、玉米黃、葉黃素和蝦青素。

由于目前國家強制性或推薦性標準中沒有統(tǒng)一的可同時測定上述5種類胡蘿卜素的方法，但每種類胡蘿卜素均有其單一的分析方法，其原理基本一致，差異在于提取原理不同，角黃素、玉米黃和葉黃素存在方式為游離態(tài)，采用有機溶劑直接提取，β-胡蘿卜素和蝦青素為絡(luò)合態(tài)和游離態(tài)并存，為了充分提取，一般采用皂化處理的方式，使其均釋放成游離態(tài)色素，再采用有機溶劑萃取后，濃縮定容進行液相定量分析。盡管有文獻采取乙腈直接提取3次，濃縮后進行測定的方法，但對于蝦青素和β-胡蘿卜素的測定結(jié)果有明顯的影響，測定結(jié)果影響見表2，因此本試驗統(tǒng)一采用先皂化后萃取的方式進行提取。

表2 直接提取和皂化后提取對蝦青素和β-胡蘿卜素的測定結(jié)果表

2.2 色譜條件的優(yōu)化

2.2.1 色譜柱的選擇

有文獻研究報道[8]，采用高效液相色譜法測定類胡蘿卜素，C30色譜柱相比C18色譜柱（在相同的流動相、相同的柱長和填料粒徑條件下）在分離度上具有明顯的優(yōu)勢，能更高效地分離類胡蘿卜素的同分異構(gòu)體。因此，本實驗室采取C30色譜柱進行了確證，發(fā)現(xiàn)C30色譜柱在分離度上具有更明顯的優(yōu)勢，能分離出更多的雜質(zhì)峰。因此，本文選用Athena C30HPLC Column（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，C30色譜柱的標樣和樣品典型色譜圖分別見圖1和圖2。

圖1 C30色譜柱的標液分離效果圖

圖2 C30色譜柱的樣品分離色譜圖

2.2.2 流動相的梯度沖洗優(yōu)化

類胡蘿卜素屬于弱極性化合物，C30色譜柱原理上也屬于反相非極性色譜柱，隨著非極性溶劑比例增強，洗脫速度加快，本試驗選用的非極性溶劑主要是叔丁基甲醚，本試驗的5種物質(zhì)中，玉米黃素和葉黃素屬于同分異構(gòu)體，分離的關(guān)鍵在于玉米黃素和葉黃素的分離度是否良好，如果叔丁基甲醚的梯度沖洗起始比例太高，會造成這兩種物質(zhì)的難以分離，但如果起始比例太低，又會造成其他物質(zhì)洗脫時間過長增加了整個樣品的分析時間，影響分析效率，同時液相色譜分析常向流動相中加入1%磷酸（或1%乙酸、1%的甲酸等），可抑制溶質(zhì)的離子化，獲得對稱的色譜峰。因此，通過不同比例的沖洗程序試驗，最終選定本試驗中的梯度沖洗程序，具體見表1。

2.2.3 線性關(guān)系

液相色譜法屬于經(jīng)典色譜法，以0.5 μg·mL-1、

1.0 μg·mL-1、2.0 μg·mL-1、5.0 μg·mL-1、10.0 μg·mL-1、20.0 μg·mL-1和50.0 μg·mL-1為橫坐標，以峰面積響應(yīng)值為縱坐標，擬合線性方程，以信噪比（S/N=3）的檢出質(zhì)量濃度作為儀器檢出限，信噪比（S/N=10）的質(zhì)量濃度作為儀器定量限，當稱樣量為5 g，定容體積為5 mL時，5種天然色素的方法檢出限和定量限結(jié)果見表3。

表3 各化合物的線性方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限結(jié)果表

2.2.4 回收率試驗和精密度試驗

在本試驗條件下，各物質(zhì)的回收率和精密度結(jié)果見表4。

表4 方法的回收率和精密度結(jié)果表（n=8）

2.2.5 色素總量測定結(jié)果與羅氏比色法測定結(jié)果對比

高效液相色譜法測定結(jié)果與羅氏比色扇法測定色度結(jié)果見表5。

表5 高效液相色譜法測定結(jié)果與羅氏比色扇法測定色度結(jié)果表

續(xù)表4

3 結(jié)論

本試驗中液相色譜法采用皂化后提取的方式，同時測定海鴨蛋中天然存在的5種天然類胡蘿卜素，該處理和分析簡單快捷，具有較低的檢出限和定量限，較好的準確度和精密度，克服了直接提取法的缺陷，測定的色素總量結(jié)果與采用羅氏比色扇法測定的色度結(jié)果具有明顯的關(guān)聯(lián)，即色素總量越高，其色度值也越高，因此可以作為海鴨蛋中天然色素的有效檢測方法。