◎ 張春生，趙文靜，董良飛，施 蕊

（1.云南財經(jīng)大學 旅游與酒店管理學院，云南 昆明 650221；2.云南財經(jīng)大學 統(tǒng)計與數(shù)學學院，云南 昆明 650221；3.西南林業(yè)大學 園林園藝學院，云南 昆明 650224）

白酒系世界七大蒸餾酒之一，其歷史悠久、風味獨特，深受我國廣大消費者的喜愛與青睞。白酒是一種復雜的多組分體系，主要成分為乙醇和水，約占總質(zhì)量的98%～99%，剩余的微量成分為一些酯類、醛類、酸類、芳香族及高級醇類化合物[1]。雖然這些微量成分總占比不足2%，但卻是影響白酒品質(zhì)的關(guān)鍵，其種類、含量及相互間比例的差異賦予了白酒不同的香型與風味[2-3]。目前，用于白酒微量成分分析的技術(shù)手段主要有色譜[4]、質(zhì)譜[5]、光譜[6]和電子傳感技術(shù)[7]等，其中氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS）對于低沸點的揮發(fā)性組分靈敏度高、分離性好，已廣泛用于白酒的摻假識別[8]、香型判定[9]及年份鑒定[10]等。此外，近年的應(yīng)用實踐表明，頂空固相微萃取箭型（Headspace Solid-Phase Microextraction Arrow，HS-SPME Arrow）技術(shù)可顯著降低前處理時白酒揮發(fā)性成分的流失，且新型的SPME Arrow比常規(guī)型號擁有更大的吸附表面積與體積，富集效果更佳，檢測結(jié)果也更接近真實酒樣[11-12]。

代謝組學是繼蛋白質(zhì)組學和基因組學后新近興起的一種組學技術(shù)，旨在利用現(xiàn)代分析儀器對生物體內(nèi)的小分子代謝物（相對分子量＜1 kDa）進行檢測與鑒定，以尋找內(nèi)源分子與生理病理變化間的相對關(guān)系[13]。根據(jù)研究對象的不同，代謝組學可分為靶向和非靶向兩類，前者主要聚焦一類、一組或一群特定代謝物的分析，后者則是無偏向性地對所有檢出的代謝物進行全面分析[14]，其間最關(guān)鍵、最核心的問題是多變量數(shù)據(jù)矩陣的處理[15]。代謝組學自20世紀90年代末誕生以來發(fā)展迅速，目前已成為臨床醫(yī)學、生命科學、環(huán)境科學等領(lǐng)域的重要研究工具，同時也為食品科學研究提供了新思路、新方法，如食品成分分析[16]、質(zhì)量鑒別[17]、風險監(jiān)測[18]。

基于此，本文將新型HS-SPME Arrow與GC-MS聯(lián)用，結(jié)合代謝組學技術(shù)建立白酒揮發(fā)性成分差異分析方法，以同一品牌不同醬香型白酒為例，在全面解析揮發(fā)性成分的基礎(chǔ)上對差異成分進行篩選和標示，以期為白酒品質(zhì)的客觀評定提供理論依據(jù)和現(xiàn)實參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 實驗材料

實驗選取貴州茅臺鎮(zhèn)某酒業(yè)公司兩種酒精度為53%（體積分數(shù)）的醬香型白酒（編號為GB和1915）作為研究對象，GB和1915各成一組，每組設(shè)3個平行酒樣，6個酒樣依次編號為GB-a、GB-b、GB-c、1915-a、1915-b和1915-c。質(zhì)控樣本由GB和1915酒樣等量混合制備而成，對應(yīng)編號依次為mix01、mix02、mix03。

1.1.2 儀器與試劑

Agilent 8890-5977B氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀；Agilent DVB/CAR/PDMS三相Arrow萃取頭；Millipore-Q超純水系統(tǒng)。正己烷（Merck）為色譜純；氯化鈉（國藥）為分析純；標準品（Sigma-Aldrich）為色譜純；實驗用水為超純水。

1.2 試驗方法

1.2.1 酒樣前處理

取1 mL酒樣于進樣瓶中，向瓶內(nèi)加入5 mL飽和氯化鈉溶液和10 μL正己烷內(nèi)標液，采用全自動HSSPME進行揮發(fā)性成分萃取富集以供GC-MS分析。

1.2.2 固相微萃取條件

老化溫度：250 ℃，老化時間：5 min；孵化溫度：60 ℃，孵化時間：10 min；萃取溫度：60 ℃，萃取時間：20 min；轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速：400 r·min-1；解吸時間：5 min。

1.2.3 氣相色譜及質(zhì)譜條件

色 譜 柱：DB-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）毛細管柱；進樣口溫度：250 ℃；升溫程序：40 ℃保持5 min，以6 ℃·min-1升至280 ℃，維持5 min。載氣：氦氣；流速：1 mL·min-1；質(zhì)譜條件：EI離子源，離子源溫度230 ℃，傳輸線溫度280 ℃，電離電壓70 eV，四極桿溫度150 ℃。

1.3 數(shù)據(jù)處理

基于邁維（嘉興）生物技術(shù)有限公司MVGC 1.0數(shù)據(jù)庫，運用MassHunter軟件（Agilent）進行質(zhì)譜峰信息提取，經(jīng)數(shù)據(jù)過濾、保留指數(shù)計算、歸一化處理完成酒樣揮發(fā)性成分的定性定量分析。采用多元統(tǒng)計方法對酒樣質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）、正交偏最小二乘法判別分 析（Orthogonal Partial Least Squares Discriminant Analysis，OPLS-DA），并對差異判定模型進行評價。結(jié)合OPLS-DA模型的變量重要性投影VIP值（Variable Importance in Project）、P值（P-value）和差異倍數(shù)FC值（Fold Change）篩選差異成分，運用3.5.0版R軟件Pheatmap程序（版本1.0.12）繪制差異成分聚類熱圖，對差異倍數(shù)值進行對數(shù)處理（log2FC）進一步明晰差異顯著的前20個成分。

2 結(jié)果與分析

2.1 酒樣揮發(fā)性成分總體分析

GB、1915酒樣和質(zhì)控樣本mix經(jīng)前處理后，在優(yōu)化設(shè)定的GC-MS條件下首先獲得總離子流圖，繼而基于MVGC 1.0數(shù)據(jù)庫，運用MassHunter軟件完成酒樣揮發(fā)性成分定性定量分析。表1的統(tǒng)計結(jié)果顯示，GB和1915兩種酒樣無論是揮發(fā)性成分的種類還是數(shù)量都保持高度一致，即15類229個揮發(fā)性成分，這是由于兩酒樣系同一品牌的兩款同香型白酒所致。229個揮發(fā)性成分中，被視為白酒香味主體物質(zhì)的酯類數(shù)量占絕對優(yōu)勢，達82個，占比超35%，其次為芳烴類、雜環(huán)化合物、酮、醛、烷烴等，酸、硫化物、醚、烯烴和其他類物質(zhì)檢出量均不超過2個，占比均不足1%。

表1 GB和1915兩種酒樣揮發(fā)性成分分類與數(shù)量統(tǒng)計表

2.2 酒樣差異判定與差異揮發(fā)性成分篩選

2.2.1 主成分分析（PCA）

主成分分析是一種常用的“線性降維”方法，即在盡可能保證數(shù)據(jù)矩陣“信息量不丟失、不減少”的情況下使用少數(shù)幾個綜合指標（主成分）概覽和揭示原始變量的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，并將多維度數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為可視化的散點圖[19]。通過主成分分析可初步了解樣品組間和組內(nèi)樣品間的相似性或差異度大小，GB和1915兩種酒樣質(zhì)譜數(shù)據(jù)主成分分析結(jié)果見圖1。從二維主成分分析結(jié)果，即圖1（a）中可以直觀看出，GB和1915酒樣組間分離明顯，這說明雖然兩種酒樣揮發(fā)性成分種類、數(shù)量高度一致，但含量方面存在可視化差異，從組內(nèi)差異來看，1915酒樣總體小于GB酒樣，這意味著1915酒樣間的相似度更高，揮發(fā)性成分的質(zhì)量控制更為穩(wěn)定。三維主成分分析結(jié)果如圖1（b）所示，由圖可知，PC1、PC2和PC3的可解釋差異分別為74.8%、12.17%和5.76%，累計可解釋差異達92.73%[15]。

圖1 兩種酒樣二維和三維主成分分析散點圖

2.2.2 正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）

PCA雖能有效提取樣品間的差異度信息，但對相關(guān)性較小的變量并不敏感，PLS-DA（Partial Least Squares Discriminant Analysis）作為一種有監(jiān)督模式識別的分析方法可有效消除此缺陷[15]。OPLS-DA則是一種結(jié)合了正交信號矯正和PLS-DA的回歸建模方法，其最大特點是可以去除自變量與分類變量無關(guān)的數(shù)據(jù)變異，從而使模型變得簡單和易于解釋，判別效果及主成分得分圖的可視化效果更加明顯[20-21]。根據(jù)OPLS-DA模型對GB和1915兩種酒樣質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行分析后繪制的OPLS-DA得分圖如圖2（a）所示，沿橫坐標方向可以看出，1915酒樣分布在置信區(qū)間左側(cè)，GB酒樣分布在置信區(qū)間右側(cè)，兩酒樣組間分離明顯，沿縱坐標方向可以看出，GB酒樣組間差異度較大，這與PCA分析結(jié)果相一致，PC1、PC2兩者累計可解釋差異86.5%。OPLS-DA模型驗證圖2（b）顯示，R2X=0.865，R2Y=0.999，Q2=0.991，即模型符合要求，具備出色的預(yù)測能力[15]。

圖2 OPLS-DA得分圖和模型驗證圖

2.2.3 差異揮發(fā)性成分篩選

基于OPLS-DA結(jié)果，采用將差異倍數(shù)值FC、P值與OPLS-DA模型的變量重要性投影VIP值相結(jié)合的方法進行差異成分篩選，凡滿足FC≥2，F(xiàn)C≤0.5，P＜1和VIP≥1任一條件，即認為該成分在兩酒樣組間存在顯著差異。據(jù)此標準，GB與1915酒樣數(shù)據(jù)結(jié)果經(jīng)篩查共得到12類79個差異顯著的揮發(fā)性成分（表1），占共有物質(zhì)（229個）的34.50%。其中差異較多的成分分別為酯（19個）、雜環(huán)化合物（16個）和芳烴（14個）3類物質(zhì)，分別占比24.05%、20.25%和17.72%，累計占差異成分總數(shù)的62.03%。

2.3 酒樣揮發(fā)性差異成分分析

2.3.1 差異成分聚類熱圖分析為更直觀地觀察差異成分的變化規(guī)律，采用等方差縮放（Unit Variance Scaling，UV）方法對各變量進行歸一化處理，進而運用R軟件的Pheatmap程序繪制GB與1915酒樣組間差異成分聚類熱圖，結(jié)果如圖3所示。經(jīng)統(tǒng)計，79個差異成分中，1915酒樣有26個揮發(fā)性成分相對含量顯著高于GB酒樣，占79個差異成分的32.91%，53個揮發(fā)性成分相對含量顯著低于GB酒樣，占79個差異成分的67.09%。

圖3 差異成分聚類熱圖

2.3.2 差異成分分析

對GB和1915兩種酒樣差異成分的差異倍數(shù)進行對數(shù)處理（log2FC），含量差異較大的前20個成分見表2。與GB相比，1915酒樣中的2-二甲基-4-乙烯基-1-苯、(2,2-二乙氧基乙基)-苯、1,2,3,4-四氫-2,6-二甲基萘、2-萘酚、4-十一烷酮、(Z)-6-十五碳烯-2-酮、4-十三烷酮、2,4,6-三(1-甲基乙基)苯酚、3-甲基-2(3H)-苯并呋喃酮以及苯乙醛的相對含量明顯較高；4-甲基-2-(2-甲基丙基)-1,3-二氧戊環(huán)、異戊基二甲基吡嗪、吡咯、2,3-二甲基-5-[(甲硫基)丙基]吡嗪、甲基丁酸乙酯、2-O-庚-4-基1-O-(2-甲基丙基)苯-1,2-二羧酸酯、N-(1-甲基乙基)-苯甲胺、萘、3-甲醛以及1-(2,4-二羥基苯基)-乙酮的相對含量明顯較低。

表2 GB和1915酒樣含量差異最大的20個成分表

續(xù)表2

3 結(jié)論

白酒風味物質(zhì)種類繁多，含量甚微，傳統(tǒng)的單一手段難以準確快速地完成樣品（組）間的差異判定與成分篩選。本研究將HS-SPME-Arrow-GC-MS檢測手段與代謝組學技術(shù)結(jié)合應(yīng)用于不同白酒揮發(fā)性組分差異分析中。經(jīng)比對，兩種醬香型白酒檢出成分的種類、數(shù)量高度一致，酯類物質(zhì)占比超35%。主成分分析結(jié)果顯示，兩酒樣組間可視化差異明顯，1915酒樣組內(nèi)相似度更高，提取到的PC1、PC2和PC3累計可解釋差異達92.73%?；贠PLS-DA建立的差異成分識別模型，229個檢出成分中共篩選出12類79個差異成分，酯類、雜環(huán)化合物和芳烴為差異個數(shù)最多的3類成分，1915酒樣中26個差異成分相對含量高于GB。通過對酒樣組間差異成分的倍數(shù)進行對數(shù)處理明確得出了差異最大的前20個成分。本研究建立的不同白酒揮發(fā)性成分差異分析方法高效可行，結(jié)果可視化效果佳，可為白酒的真?zhèn)舞b別和品質(zhì)評定提供理論依據(jù)與實踐參考。