HPLC法同時測定楊林肥酒中4種成分

◎ 王月德，崔慶德，安艷蘇，畢秋左，張順平，錢 洲

（曲靖市食品藥品檢驗檢測中心，云南 曲靖 655000）

楊林肥酒，中國唯一現(xiàn)存的綠酒，也是云南首屈一指的有著悠久歷史文化和豐富歷史內(nèi)涵的名酒，由楊林“裕寶號”釀酒商人陳鼎于清光緒六年（公元1880年）始創(chuàng)，至今已有140余年歷史。楊林肥酒是一款綠色養(yǎng)生的保健酒，源自明代藥物學(xué)家蘭茂《滇南本草》中的“水酒十八方”，以楊林當(dāng)?shù)刈葬劦男∏拙茷榫苹?，甄選大棗、拐棗、陳皮、菊花、小茴香、丁香、肉桂和梔子等十余味名貴中藥材，加之從豌豆尖、青竹葉等綠色植物中所提取出的綠色精華，再配之蜂蜜及白砂糖，經(jīng)過黃金比例調(diào)配，得以呈現(xiàn)其“翠綠如玉，酒香醇厚，入口綿甜，酒體圓潤，生津雋永”的特有風(fēng)味。故楊林肥酒一經(jīng)問世，便廣受歡迎，而其具有的健胃、滋脾、潤肺、生津、補(bǔ)中益氣、增強(qiáng)心肌功能、促進(jìn)新陳代謝、提高免疫力及降低血脂等功效[1-2]更是導(dǎo)致了人們對其推崇備至，清代詩人王迥為其寫下了“白玉瓶裝綠液漿，好酒應(yīng)留與人嘗。幾藏楊林終自飲，尤對空瓶嗅酒香”的贊美詩篇；世人也賦予其“楊林肥酒，天下獨(dú)有”的美譽(yù)。

楊林肥酒的“肥”，“肥”在其所添加的十余種中藥材，“肥”在酒中所含有的葡萄糖、蛋白質(zhì)酵素、維生素、果糖和棗酸等營養(yǎng)成分，“肥”在其藥酒共融、養(yǎng)生健體?，F(xiàn)代研究表明，釀酒所用原料中，大棗可安中、養(yǎng)脾、平胃氣、通九竅，主要含生物堿類、皂苷類、黃酮類、有機(jī)酸類及糖苷類等成分，具有調(diào)節(jié)免疫功能、抗腫瘤、抗氧化、修復(fù)肝損傷、抗疲勞等作用[2-3]；拐棗能解酒毒，止渴除煩，主要含黃酮類、生物堿類、皂苷類以及有機(jī)酸、脂肪酸等成分，具有解酒、保肝、抗腫瘤、抗氧化、降血糖及免疫調(diào)節(jié)等功效[4]；陳皮理氣健脾、燥濕化痰，主要含揮發(fā)油、黃酮類、香豆素類、生物堿類、檸檬苦素及微量元素等成分，具有理氣、保肝、鎮(zhèn)咳、抗氧化、抗腫瘤、抗炎及抗菌等生物活性[5]；菊花散風(fēng)清熱、平肝明目、清熱解毒，主要含有黃酮類、揮發(fā)油、苯丙素類、萜類及氨基酸等成分，具有保肝、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力、抑菌、抗病毒、抗炎、抗腫瘤及降血糖等功效[6]；小茴香理氣和胃、散寒止痛，主要含有揮發(fā)油、黃酮類、酚類、脂肪酸、氨基酸、生物堿類、糖苷類以及無機(jī)元素等成分，具有調(diào)節(jié)腸胃功能、降血糖和血脂、抗氧化、抗肝腎毒性、抗炎、抗菌、抗病毒及抗腫瘤等積極作用[7]；丁香溫中降逆、補(bǔ)腎助陽，主要成分為揮發(fā)油和三萜酸，具有抗菌、消炎、解熱鎮(zhèn)痛、抗氧化、健脾胃及麻醉等作用[8]；肉桂補(bǔ)火助陽、引火歸元、散寒止痛、溫通經(jīng)脈，主要包括揮發(fā)油、黃酮類、黃烷醇及其苷類和多聚體類、萜類、木脂素類、酚酸類、香豆素類、脂肪酸類、多糖類以及皂苷類等成分，具有抗?jié)儭⒖垢篂a、抗炎、抗菌、抗氧化、抗腫瘤及改善糖脂代謝等藥理作用[9]；梔子瀉火除煩、清熱利濕、涼血解毒，主要含萜類、有機(jī)酸酯類、黃酮類、揮發(fā)油、多糖類及微量元素等化學(xué)成分，具有保肝利膽、降壓、降糖、調(diào)脂、保護(hù)胃功能、保護(hù)神經(jīng)、抗炎、抗氧化、抗疲勞及抗血栓等作用[10]。

筆者查閱了有關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，關(guān)于楊林肥酒的研究報道較少，僅有對其保健功能機(jī)理的研究探討以及對其生產(chǎn)工藝的優(yōu)化分析。焦少良等[11]利用中西醫(yī)機(jī)理對楊林肥酒能改善脾胃功能、提高免疫力功能以及降血脂功能進(jìn)行了探討；孫龐等[12]通過小鼠高脂血癥模型發(fā)現(xiàn)楊林肥酒對脂質(zhì)代謝可能存在一定的調(diào)節(jié)作用，尤其是降低低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）的作用；邵正等[13]比較分析了不同膜過濾技術(shù)在楊林肥酒除濁中的影響，發(fā)現(xiàn)精濾膜過濾技術(shù)能明顯改善酒液的澄清度，較好保留酒中總黃酮、總多糖活性成分含量，并能改善酒的色澤、風(fēng)味和保健功能，有利于提高楊林肥酒的質(zhì)量和穩(wěn)定性。然而，關(guān)于楊林肥酒中活性成分的分析卻未見報道。為此，本研究參照相關(guān)文獻(xiàn)，建立HPLC法對楊林肥酒中梔子苷、橙皮苷、桂皮醛和丁香酚含量進(jìn)行同時測定，以期能為楊林肥酒的理論研究和質(zhì)量控制提供理論依據(jù)[14-15]。

1 材料與方法

1.1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀-DAD紫外檢測器（美國安捷倫公司）；METTLER TOLEDO MS205DU電子天平（梅特勒-托利多國際股份有限公司）；BRAND移液器[普蘭德（上海）貿(mào)易有限公司]；微孔濾膜（天津市津騰實驗設(shè)備有限公司，0.45 μm）。

1.2 試劑

供含量測定用梔子苷（批號：110749-201919，含量：97.1%）、橙皮苷（批號：110721-202019，含量：95.3%）、桂皮醛（批號：110710-201821，含量：99.6%）、丁香酚（批號：110725-201615，含量：99.3%）均由中國食品藥品檢定研究院提供；甲醇（色譜純，德國默克公司）；乙醇（分析純，西隴科學(xué)股份有限公司）；水為二次蒸餾水；供試品為市售楊林肥酒-隨心露酒（酒精度：48%vol，規(guī)格：400 mL/瓶，批號：191004、210203、20210601.ZY，生產(chǎn)日期：2019-10-31、2021-02-04、2021-06-22）。

1.3 色譜條件

色譜柱：依利特Hypersil ODS2 C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇（A）-水（B），梯度洗脫（0～7 min，7%A→35%A；7～9 min，35%A→46%A；9～11 min，46%A；11～26 min，46%A→58%A；26～31 min，58%A→7%A）；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；檢測波長：230 nm；進(jìn)樣量：15 μL。

1.4 溶液的制備

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液

精密稱取梔子苷、橙皮苷、桂皮醛、丁香酚對照品適量，分別加甲醇制成含梔子苷971.971 μg·mL-1、橙皮苷 114.360 μg·mL-1、桂皮醛 1 268.904 μg·mL-1、丁香酚1 391.193 μg·mL-1的對照品儲備液，再分別吸取上述儲備液適量，加50%乙醇制成分別含梔子苷97.179 1 μg·mL-1、橙皮苷 57.180 0 μg·mL-1、 桂 皮 醛40.604 9 μg·mL-1、丁香酚 139.119 3 μg·mL-1的混合對照品溶液。

1.4.2 供試品溶液

取供試品溶液搖勻，用0.45 μm微孔濾膜過濾。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的確認(rèn)

2.1.1 流動相的選擇

研究比較了乙腈-水作為流動相和甲醇-水作為流動相對各目標(biāo)成分分離效果的影響。結(jié)果表明，在使用乙腈-水作為流動相時，梔子苷峰與相鄰色譜峰的分離度始終難以達(dá)到分離要求，使用甲醇-水作為流動相時，各目標(biāo)成分峰與其相鄰色譜峰均能達(dá)到基線分離，故選擇甲醇-水作為流動相。相關(guān)色譜圖見圖1。

圖1 各成分HPLC色譜圖

2.1.2 檢測波長的選擇

分別取梔子苷、橙皮苷、桂皮醛和丁香酚對照品溶液在200～500 nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描，發(fā)現(xiàn)梔子苷在238 nm波長處有最大吸收，橙皮苷在225 nm和283 nm波長處有最大吸收，桂皮醛在224 nm和290 nm波長處有最大吸收，丁香酚在230 nm和280 nm波長處有最大吸收。為兼顧對上述4種成分的同時測定，結(jié)合紫外掃描圖譜結(jié)果，經(jīng)過對不同波長的測定結(jié)果進(jìn)行比較，最終選擇230 nm作為檢測波長。

2.2 方法線性關(guān)系考察

精密吸取“1.4.1”項下的混合對照品溶液0.05 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.5 mL、1.0 mL和1.5 mL，分別置于10 mL容量瓶中，用50%乙醇稀釋至刻度，搖勻，過濾，即得。濾液按“1.3”項下色譜條件分別進(jìn)樣15 μL測定，記錄色譜圖，以對照品質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表1。由表1可知，上述4種成分在各自濃度范圍內(nèi)均與自身峰面積呈良好的線性關(guān)系。

表1 4種成分線性關(guān)系表

2.3 方法精密度考察

精密吸取“1.4.1”項下用0.45 μm微孔濾膜濾過的混合對照品溶液15 μL，按“1.3”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果顯示，梔子苷、橙皮苷、桂皮醛和丁香酚峰面積的RSD分別為0.10%、0.26%、0.63%、0.25%（n=6），表明本方法精密度良好。

2.4 方法穩(wěn)定性考察

取“1.4.2”項下供試品溶液，分別在0 h、2 h、4 h、8 h、16 h、24 h、36 h和48 h時進(jìn)樣15 μL，記錄峰面積并計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果顯示，梔子苷、橙皮苷、桂皮醛和丁香酚峰面積的RSD分別為0.28%、0.10%、0.64%、0.33%（n=6），表明樣品在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 方法重復(fù)性考察

取樣品（批號210203）6份，分別按“1.4.2”項下方法制備供試品溶液，照“1.3”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，計算出樣品中梔子苷、橙皮苷、桂皮醛、丁香酚的平均含量，RSD分別為0.45%、0.36%、0.43%、0.42%。結(jié)果表明，該方法重復(fù)性良好。

2.6 方法準(zhǔn)確度考察

精密量取已知含量的樣品（批號210203）6份，每份5.00 mL，置于10 mL容量瓶中，分別精密加入“1.4.1”下的混合對照品溶液各0.25 mL，用50%乙醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜過濾制成供試品溶液，在“1.3”項下色譜條件測定，計算回收率，結(jié)果見表2。

表2 各成分回收率試驗結(jié)果表（n=6）

2.7 樣品含量測定

取3批樣品，按“1.4.2”項下方法制備供試品溶液，并按“1.3”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，以峰面積計算樣品中各待測物質(zhì)的含量，結(jié)果見表3。

表3 各成分含量測定結(jié)果表（n=3）

3 結(jié)論與討論

梔子苷作為梔子的有效成分之一，藥理作用廣泛，具有保肝利膽、保護(hù)胰腺組織、抗炎鎮(zhèn)痛、抗肺損傷、抗哮喘、降尿酸、降血糖、降血脂、抗老年癡呆、抗肝纖維化、腦缺血保護(hù)及抑制甲型H1N1流感病毒作用[16]；陳皮中的橙皮苷則具有抗炎、抗氧化、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、減少腫瘤細(xì)胞的物質(zhì)代謝以及預(yù)防心血管疾病等多種生物活性[17]；桂皮醛作為肉桂揮發(fā)油中的主要成分，也具有廣泛的藥理作用，對神經(jīng)系統(tǒng)疾病、生殖系統(tǒng)疾病、心血管疾病、腫瘤疾病、糖尿病及肥胖等多種疾病均有一定的防治作用[18]；丁香酚是丁香中的主要成分，有抗菌、麻醉、抗氧化、保護(hù)心臟、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞和抗病毒等多種生物活性[19]。本研究從楊林肥酒中檢測出上述4種活性成分的存在也間接為楊林肥酒的“肥”提供了一定的數(shù)據(jù)支撐。

對含量測定結(jié)果進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，不同生產(chǎn)日期的楊林肥酒中桂皮醛的含量差異不大，而與生產(chǎn)日期較晚一些的楊林肥酒相比，早期生產(chǎn)的楊林肥酒中梔子苷與丁香酚含量略低，橙皮苷的含量卻高出許多。筆者認(rèn)為，不同批次的楊林肥酒在生產(chǎn)時所使用原料質(zhì)量的參差不齊也許是造成該情況的原因之一。

經(jīng)方法學(xué)考察驗證，本研究建立了同時測定楊林肥酒中梔子苷、橙皮苷、桂皮醛和丁香酚含量的高效液相色譜分析方法。該方法快速、高效、準(zhǔn)確，且流動相簡單，測試結(jié)果重復(fù)性好，可為楊林肥酒的質(zhì)量控制和研究提供理論依據(jù)。