李海利，方劍玉，游 一，郎利敏，張立憲，張青嫻，朱文豪，焦文強，王治方，徐引弟，許 峰，王克領(lǐng)，馮麗麗

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，畜牧獸醫(yī)研究所，鄭州 450002；2河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)經(jīng)濟與信息研究所，鄭州 450002)

豬接觸傳染性胸膜肺炎(porcine contagious pleuropneumonia, PCP)又稱壞死性胸膜肺炎，是由胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacilluspleuropneumoniae, APP)引起的一種急性呼吸道傳染病，以急性出血性纖維素性肺炎和慢性纖維素性壞死性胸膜肺炎為主要特征。急性者病死率高。慢性者常能耐過。其典型病理變化為兩側(cè)性肺炎，胸膜粘連，肺炎區(qū)色暗質(zhì)脆[1-3]。豬接觸傳染性胸膜肺炎是危害養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)生產(chǎn)的重大細(xì)菌性疾病之一[4-5]。為控制該病的發(fā)生和流行，以及發(fā)病后的治療，養(yǎng)殖戶首選應(yīng)用抗生素，由于抗生素的普遍應(yīng)用，甚至超量使用和濫用，導(dǎo)致多重耐藥菌株和超級耐藥菌株的出現(xiàn)，給臨床治療和防控帶來了挑戰(zhàn)[6-9]。前期研究表明，臨床分離的胸膜肺炎放線桿菌對多種抗生素表現(xiàn)耐藥性，而且耐藥率在不斷增強，出現(xiàn)交叉耐藥胸膜肺炎放線桿菌，使該病的治療變得愈加困難[10-11]。

由于抗生素、化學(xué)藥物的超量使用，會在動物產(chǎn)品和代謝物中的殘留，產(chǎn)生較為嚴(yán)重的食品安全和公共衛(wèi)生安全問題，這與我國畜牧業(yè)發(fā)展導(dǎo)向和供給側(cè)結(jié)構(gòu)改革及向安全、綠色、健康、無抗發(fā)展方向相違背。在無抗養(yǎng)殖、動物疫病防控和食品安全的多重壓力下，研發(fā)和篩選高效、低毒、安全、無抗的獸用抗菌藥物越來越迫切。所以從天然藥物或中草藥中篩選毒副作用小的高效抑菌中草藥及其有效成分的復(fù)配物刻不容緩。中藥是我國的“天然醫(yī)藥寶庫”，具有多成分、多途徑、多靶點、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點[12-15]。中草藥中含有復(fù)雜抑菌成分，如多糖、生物堿、氨基酸、酚類、肽類等天然活性成分，中藥不但具有廣譜抗病毒、抗菌、抗氧化、清除自由基、抗寄生蟲、抗腫瘤、促進(jìn)動物生長、提高機體免疫力、增強抗病力的功效，而且對提高機體的免疫功能有奇效，還具有抗菌譜廣、不易產(chǎn)生耐藥性、可以聯(lián)合應(yīng)用等優(yōu)點[16-19]。本研究在前期大量研究的基礎(chǔ)上，以穿心蓮、黃芩、苦參、白頭翁、芒果葉和百里香6種中草藥對豬接觸傳染性胸膜肺炎放線桿菌多重耐藥菌株的體外抑菌試驗，旨在篩選對多重耐藥菌株具有較好抑菌效果的中草藥，為動物專用新型抗菌藥物研發(fā)、無抗養(yǎng)殖和臨床用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 藥材和菌種 穿心蓮、黃芩、苦參、白頭翁和百里香購自張仲景大藥房，芒果葉采自海南島芒果樹，經(jīng)過晾曬的干品。多重耐藥胸膜肺炎放線桿菌菌株由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所畜禽傳染病研究室提供，6株多重耐藥胸膜肺炎放線桿菌菌株對磺胺類藥物、四環(huán)素類藥物和氨基糖苷類藥物耐藥[10-11,20-21]。

1.1.2 儀器與試劑 純水系統(tǒng)(Milli-Q)、生物安全柜(美國Forma全排B2型)、PCR擴增儀(Eppendorf)、凝膠成像儀、真空DNA濃縮儀(Eppendorf, Concentrator 5301)、超凈工作臺、小型低溫高速離心機(Heraeus)、CO2培養(yǎng)箱(美國Forma)、立式高速離心機(美國Beckman)、臺式大容量冷凍離心機(德國Eppendorf)、微量離心機(德國Eppendorf)、紫外分光光度計(島津UV265，RF540)、大型恒溫?fù)u床(上海智誠ZHWY-211B)、超聲波破碎儀(Vibra Cell, VCX750)、-80 ℃超低溫冰箱(美國Thermo Forma)、熒光顯微鏡(日本Nikon)、自動酶標(biāo)光度儀(美國Bio-Rad)、熒光定量PCR儀(美國ABI)、梯度PCR儀(美國Bio-Rad)、核酸電泳系統(tǒng)(美國Bio-Rad)、核酸蛋白定量儀(美國Bio-Rad)、圖像掃描分析系統(tǒng)(美國Bio-Rad)、移液搶、打孔器。試驗所需試劑蛋白胨、大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基、大豆酪蛋白培養(yǎng)基、牛肉膏、瓊脂粉均為國產(chǎn)分析純(寶生物工程(大連)有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 藥液的煎制 采用水提取和65%乙醇提取相結(jié)合的提取方法制備單劑中草藥的提取液。稱取所需藥材的量，將藥材放入粉碎機中粉碎，使其成200目。加入8倍量的水浸泡3 h，然后放入提取鍋中加熱煎煮提取1 h，用紗布過濾，濾渣再用8倍量的65%乙醇提取1 h，用紗布過濾。合并兩次提取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收乙醇和濃縮提取液，濃縮至使藥液濃度含原生藥材為1 g/mL，放入4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌種活化劑濃度測定 試驗前將低溫凍干保存的菌種接種于大豆酪蛋白培養(yǎng)基(含5%的胎牛血清和0.1%的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸)使其活化，在5%的二氧化碳培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h，用微量移液器吸取100 μL菌液加入500 μL大豆酪蛋白培養(yǎng)基(含5%的胎牛血清和0.1%的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸)中進(jìn)行擴培，在5%的二氧化碳培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h，然后用比濁管比濁法進(jìn)行活菌計數(shù)，測定后配制成1×109cfu/mL的菌液。

1.2.3 中藥提取液體外抑菌試驗 對6種中草藥的提取液進(jìn)行瓊脂擴散抑菌試驗。在超凈工作臺內(nèi)無菌操作，用移液搶吸取50 μL 1×109cfu/mL的菌液均勻涂布于大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基表面上，再用直徑為6 mm的打孔器在瓊脂培養(yǎng)基上等距離打孔，每個平板打四個孔，加入對應(yīng)的無菌中藥提取液100 μL，每個平板用一孔加入0.9%生理鹽水作為對照，置二氧化碳培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察有無抑菌圈，并測量其直徑。每種中藥提取液對多重耐藥菌株均做3個平行試驗，抑菌圈大小取3次結(jié)果的平均值。抑菌效果判定按照如下標(biāo)準(zhǔn)：抑菌圈≥20 mm為敏感，10～20 mm為中敏，≤10為耐藥。

1.2.4 中藥提取液體最小抑菌濃度和最小殺菌濃度的測定 采用試管倍比稀釋法測定中草藥提取液對胸膜肺炎放線桿菌多重耐藥菌株的最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)。在無菌條件下，將6種中藥提取液分別倍比稀釋成含藥量為1、0.5、0.25、0.125、0.063、0.031、0.016、0.008、0.004、0.002、0.001 g/mL的藥液，然后分別加入擴培好的50 μL菌液，并設(shè)置相應(yīng)的對照組，置二氧化碳培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h，通過觀察試管內(nèi)渾濁情況來判斷細(xì)菌的生長情況。為了避免中草藥提取液顏色對結(jié)果判定的影響，再將各試管內(nèi)的培養(yǎng)液接種至大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基平板上，置二氧化碳培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h，通過觀察細(xì)菌在培養(yǎng)基上的生長情況來判定最小抑菌濃度和最小殺菌濃度。培養(yǎng)基上有少量細(xì)菌生長即為該種藥物對該菌株的最小抑菌濃度(MIC)，培養(yǎng)基上沒有細(xì)菌生長即為該種藥物對該菌株的最小殺菌濃度(MBC)。

2 結(jié)果與分析

2.1 中藥提取液體外抑菌試驗 六種中草藥提取液體外抑菌試驗結(jié)果如表1所示，百里香和芒果葉提取液抑菌效果較好，其抑菌圈直徑分別為40 mm和35 mm，其次為白頭翁、黃芩、穿心蓮和苦參，其抑菌圈直徑在8～16 mm。從表1可以看出，穿心蓮對6株多重耐藥胸膜肺炎放線桿菌耐藥，有三株對黃芩耐藥，苦參對6株多重耐藥胸膜肺炎放線桿菌中敏，白頭翁蓮對6株多重耐藥胸膜肺炎放線桿菌中敏，芒果葉和百里香對6株多重耐藥胸膜肺炎放線桿菌高敏。

表1 抑菌圈測定結(jié)果(mm)

2.2 中藥提取液最小抑菌濃度和最小殺菌濃度的測定 六種中草藥最小抑菌濃度測定結(jié)果(表2)可知， 六種中草藥提取液對6株多重耐藥胸膜肺炎放線桿菌均有一定的抑菌活性，其中最小的抑菌活性為芒果葉和百里香0.198 mg/mL，最大的抑菌活性為穿心蓮和苦參25 mg/mL，黃芩和白頭翁為0.396 mg/mL。六種中草藥最小殺菌濃度測定結(jié)果(表3)可知，百里香、芒果葉、白頭翁、黃芩、穿心蓮和苦參的最小殺菌濃度分別為0.396、0.396、0.792、0.792、50、50 mg/mL。說明除穿心蓮和苦參外，其余4種中草藥對胸膜肺炎放線桿菌多重耐藥菌株有很多好的抑菌和殺菌效果，其中百里香和芒果葉效果最佳。

表2 最小抑菌濃度測定結(jié)果(mg/mL)

表3 最小殺菌濃度測定結(jié)果(mg/mL)

3 討論與結(jié)論

APP為條件性致病菌，是一種革蘭氏陰性小球桿菌、線狀或絲狀桿菌，有莢膜和菌毛，不形成芽孢，能產(chǎn)生毒素。APP至今報道的有20多個血清型，各血清型之間的交叉免疫力能力差，所以該病的疫苗預(yù)防效果不理想。在選用疫苗前，最好做血清型鑒定，選用與本場血清型一致的疫苗，效果才好[22-25]。近年來，由于抗菌藥物的不合理使用或者濫用，導(dǎo)致大量耐藥菌的出現(xiàn)，出現(xiàn)多重耐藥菌株或者超級耐藥菌株，嚴(yán)重影響臨床療效和動物健康。

中草藥是我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的瑰寶和寶貴遺產(chǎn)，是天然藥物，天然污染小，資源豐富，價格低廉，易降解，具有高安全性、低毒性，含有多種活性成分，無殘留、毒副作用小，過敏反應(yīng)少，具有廣譜抗菌作用且不易產(chǎn)生耐藥性，不會造成環(huán)境重大污染等特點。中草藥具有潛在的可開發(fā)成安全、環(huán)保、無抗、動物專用抗菌藥物的價值，其抗菌效果的研究已經(jīng)成為國內(nèi)外關(guān)注的焦點和愈加受到科研工作者的重視[26-29]。中草藥的抑菌、殺菌效果與其含有的抗菌有效成分和種類密切相關(guān)，中草藥的有效活性成分主要包括生物堿類、香豆素類、醌類、木質(zhì)素類、有機酸類、強心苷類、黃酮類、皂苷類、鞣質(zhì)類、揮發(fā)油類、活性多糖類、環(huán)烯醚萜類、氨基酸、蛋白質(zhì)和酶類、鞣質(zhì)類等[30-33]。有的中草藥雖然本身不具有抗菌特性，但其有效成分能夠調(diào)節(jié)機體平衡和具有誘食作用，誘生多種細(xì)胞因子、免疫因子及通過激活補體和T、B 淋巴細(xì)胞的活性等途徑來調(diào)節(jié)和增強動物的免疫功能，提高非特異性和特異性免疫應(yīng)答，從整體上強化機體的免疫應(yīng)答，提高抗病能力，從而對疾病有所控制，達(dá)到清熱解毒和抗感染治療的效果[34-35]。從中藥具有提高動物的生產(chǎn)能力，提高免疫力，增強抗病力及治未病等方面，是抗生素、化學(xué)藥物無法比擬的。但是抗生素的大量應(yīng)用，給公共衛(wèi)生安全和食品安全帶來了極大隱患。因此，需找天然藥物，為養(yǎng)殖業(yè)提供安全、無毒、高效、促進(jìn)動物生產(chǎn)性能、不易產(chǎn)生耐藥性的天然動物專用的抗菌藥物迫在眉睫。

百里香(Thyme sp.)又名地椒、麝香草，為唇形科百里香屬的多年生矮小灌木狀草本，全株具有濃郁香味、可入藥，是一種廣泛應(yīng)用的香料植物。百里香全草均含揮發(fā)油，以花盛時含量最高，其主要成分有，百里香酚(Thymo1)、對-聚傘花素(p-Cymo1)、芳樟醇(Linaloo1)、香芹酚(carvacro1)和龍腦等多種化合物[36]。百里香酚是一種單萜類化合物，抗炎作用是其多種藥理活性之一，是百里香的主要成分。在多種藥典和本草典中還記載百里香具有消炎止痛、溫中散寒，健脾消食等藥用作用。其抗菌功能與其含有的酚類物質(zhì)密切相關(guān)，本研究發(fā)現(xiàn)百里香提取物具有較好的抑菌和殺菌功能，其有望作為替代抗生素的綠色飼料添加劑。其抗多重耐藥菌的機制有待進(jìn)一步研究。

芒果(Mangifera indica L.)系漆樹科(Anacardiaceae)芒果屬植物，廣泛分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)。芒果葉是常用中藥，可用于治療小兒疳積、氣脹、熱滯腹痛、消渴等癥。研究表明，芒果葉中，含有大量的酚類化合物，如酚酸類、黃酮類、二苯甲酮類等，并具有多種生物活性，如抗氧化、抗糖尿病、抗炎、抗微生物、免疫調(diào)節(jié)、解熱鎮(zhèn)痛等?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，芒果葉提取物具有平喘、止咳、祛痰、免疫調(diào)節(jié)、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗菌、抗病毒、抗腫瘤及治療糖尿病等作用[37-38]。本研究通過對芒果葉提取物對多重耐藥胸膜肺炎放線桿菌的抑菌和殺菌試驗表明，芒果葉提取物具有較好的殺菌和抑菌作用，其抑菌作用與其含有的酚類化合物密切相關(guān)，但其抑菌和殺菌機制有待進(jìn)一步研究。由于其較好的抗菌作用，可以作為替代抗生素的綠色飼料添加劑應(yīng)用于畜牧業(yè)生產(chǎn)和保障動物健康養(yǎng)殖。

綜上所述，百里香和芒果葉對6株胸膜肺炎放線桿菌多重耐藥菌株具有較好的抑制作用，高度敏感，其抑菌圈直徑分別為40 mm和35 mm，最小抑菌濃度分別為0.198、0.198 mg/mL，最小殺菌濃度分別為0.396、0.396 mg/mL；白頭翁和苦參對6株多重耐藥胸膜肺炎放線桿菌中敏，6株多重耐藥胸膜肺炎放線桿菌對穿心蓮耐藥，有3株多重耐藥胸膜肺炎放線桿菌對黃芩耐藥。