液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定雞蛋、牛奶和羊奶中泰樂菌素A殘留的研究

趙晨浩，楊 潔，孟 蕾，李慧素，彭 麗，張盼盼，劉婷婷，吳志明*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，鄭州 450002；2.河南省獸藥飼料監(jiān)察所，鄭州 450008)

泰樂菌素(Tylosin)亦稱泰農(nóng)霉素、泰樂霉素，是美國于1959年從弗氏鏈霉菌的培養(yǎng)液中提取獲得的一種大環(huán)內(nèi)酯類畜禽專用抗生素，主要由泰樂菌素A、B、C、D四個組分組成，除泰樂菌素D組分基本無抗菌活性外，A、B、C三個組分均有抗菌活性，且A組分抗菌活性最高，約占80～95%[1]。泰樂菌素在獸醫(yī)臨床上主要用于治療由革蘭氏陽性菌、支原體等引起的感染性動物疾病，使用不當(dāng)易造成動物組織中該藥物殘留；若食用了泰樂菌素殘留超標(biāo)的動物組織，可引起人體胃腸道的不良反應(yīng)，損害耳蝸神經(jīng)，甚至造成肝腎損傷[2-3]。我國GB31650-2019《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中獸藥最大殘留限量》[4]、國際食品法典委員會(CAC)、歐洲藥品管理局(EMA)、美國食品藥物管理局(FDA)和日本等均對泰樂菌素制訂有最大殘留限量(Maximum residue Limit，MRL)，且均規(guī)定泰樂菌素的殘留標(biāo)志物為泰樂菌素A，其中我國規(guī)定泰樂菌素在牛奶中的MRL為100 μg/kg，在雞蛋中的MRL為300 μg/kg。

目前，國內(nèi)外報道泰樂菌素殘留檢測的方法主要有FTIR光譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量法[5]、微生物效價法[6]、膠體金檢測法[7]、酶聯(lián)免疫法[8-9]、高效液相色譜法[10-12]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[13-14]等，但研究對象主要是畜禽的肌肉[15]、肝臟組織[11]，而禽蛋、牛羊奶中泰樂菌素A殘留檢測方法的報道甚少[16-18]。本文通過對儀器分析條件、提取及凈化條件、固相萃取小柱、流動相等條件的優(yōu)化，建立了雞蛋及牛羊奶中泰樂菌素A殘留測定液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，可為全面監(jiān)控泰樂菌素殘留提供技術(shù)支撐，為動物源性食品質(zhì)量安全提供保障。

1 材料與方法

1.1 儀器 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國Waters公司，Xevo TQ-S)；高速冷凍離心機(jī)(美國Sigma公司)；電子分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；IKA MS3 basic漩渦儀(艾卡廣州儀器設(shè)備有限公司IKA中國)；Milli-QA10 超純水儀(美國Milipore 公司)；TTL-DCⅡ型氮吹儀(美國Organomation Associates公司)；固相萃取裝置(美國Waters公司)。

1.2 試劑與材料 泰樂菌素A對照品(含量：98.0%)和泰樂菌素A-d3(含量：99.58%)均購自加拿大TRC公司；甲醇(色譜純)和乙腈(色譜純)均購自德國Merck公司；Oasis Prime HLB固相萃取柱(6cc，200 mg)購自美國Waters公司；試驗(yàn)用水為經(jīng) Milli-Q凈化系統(tǒng)(美國 Millipore 公司)制備的去離子水。

1.3 溶液的配制

1.3.1 1 mg/mL泰樂菌素A標(biāo)準(zhǔn)儲備液 精密稱取泰樂菌素A對照品約10 mg置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，制成濃度為1 mg/mL的泰樂菌素A標(biāo)準(zhǔn)貯備液，于-20 ℃以下保存，有效期3個月。

1.3.2 10 μg/mL泰樂菌素A標(biāo)準(zhǔn)中間工作液 精密量取1.3.1項(xiàng)下溶液1 mL置于100 mL容量瓶中，用甲醇稀釋并定容，制成濃度為10 μg/mL的泰樂菌素A標(biāo)準(zhǔn)中間工作液，有效期1個月。

1.3.3 1 mg/mL泰樂菌素A-d3內(nèi)標(biāo)儲備液 精密稱取泰樂菌素A-d3對照品約10 mg，于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，制成濃度為1 mg/mL的泰樂菌素A-d3標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于-20 ℃以下保存，有效期3個月。

1.3.4 1 μg/mL泰樂菌素A-d3標(biāo)準(zhǔn)中間工作液精密量取1.3.3項(xiàng)下溶液0.1 mL，于100 mL容量瓶中，用甲醇稀釋并定容，配制成濃度為1 μg/mL的泰樂菌素A-d3標(biāo)準(zhǔn)中間工作液，有效期1個月。

1.3.5 50%甲醇水溶液 取甲醇50 mL，加水稀釋至100 mL，混勻。

1.3.6 0.1%甲酸水 取甲酸1 mL，加水稀釋至1000 mL，混勻。

1.4 儀器條件

1.4.1 液相色譜參考條件 色譜柱：NanoChrom ChromCore C18柱(100 mm×2.1 mm，粒徑1.8 μm)；流動相A為乙腈，流動相B為0.1%甲酸水；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：2 μL；柱溫：40 ℃。梯度洗脫，見表1。

表1 流動相梯度洗脫

1.4.2 質(zhì)譜參考條件 離子源：電噴霧離子源；正離子掃描(ESI+)；多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；電離電壓：1.0 kV；源溫：150 ℃；霧化溫度：500 ℃；錐孔氣流速：150 L/h；霧化氣流速：1000 L/h；離子對、錐孔電壓及對應(yīng)的碰撞能量參考值見表2。

表2 定性定量離子對及對應(yīng)錐孔電壓和碰撞能量

1.5 試驗(yàn)方法

1.5.1 樣品前處理 稱取試料(2±0.01)g于50 mL離心管中，加入泰樂菌素A-d3(1 μg/mL)內(nèi)標(biāo)工作液100 μL，渦旋混勻靜置15 min，加入乙腈10 mL，渦動10 s，渦旋振蕩20 min，25 ℃10000 r/min離心10 min，取上清液，備用。取全部備用液過Prime HLB固相萃取小柱后，精密量取5 mL于40 ℃水浴氮?dú)獯蹈?，?0%甲醇水1 mL復(fù)溶，過微孔濾膜后，供液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

1.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密量取適量標(biāo)準(zhǔn)中間工作液及內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)中間工作液，用50%甲醇水溶液稀釋成濃度為1、2、5、10、20、50、100 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液(內(nèi)標(biāo)均為5 ng/mL)，從低濃度到高濃度依次進(jìn)樣，供液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定。以待測物與內(nèi)標(biāo)物的定量離子色譜峰面積比為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

1.5.3 檢測限與定量限的測定 按1.5.1項(xiàng)方法處理樣品，再按1.4.1項(xiàng)條件進(jìn)行分析測定。信噪比S/N≥3為檢測限(Limit of detection，LOD)，S/N≥10為定量限(Limit of quantification，LOQ)。

1.5.4 精密度與準(zhǔn)確度的測定 取空白雞蛋及牛羊奶樣品，以LOQ和MRL為依據(jù)，添加4個不同濃度(LOQ、1/2MRL、MRL、2MRL)的泰樂菌素A標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.5.1項(xiàng)方法處理樣品，再按1.4.1項(xiàng)條件進(jìn)行分析測定，每個濃度5個平行樣品，進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)。求回收率和批內(nèi)、批間變異系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 在1～100 ng/mL的濃度范圍內(nèi)，泰樂菌素A色譜峰面積與濃度呈線性相關(guān)，回歸方程為y=1329x±2698，r=0.9989，見圖1。

圖1 泰樂菌素A標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.2 檢測限與定量限 按照信噪比S/N≥3為檢測限，S/N≥10為定量限，求得雞蛋及牛羊奶的檢測限為2 ng/mL，定量限為5 ng/mL，色譜圖見圖2。

A： 泰樂菌素A標(biāo)準(zhǔn)溶液特征離子色譜圖(2 ng/mL)；B： 泰樂菌素A標(biāo)準(zhǔn)溶液特征離子色譜圖(5 ng/mL)；C： 空白雞蛋基質(zhì)空白特征離子色譜圖；D： 雞蛋空白添加試樣特征離子色譜圖(5 ng/mL)；E： 牛奶基質(zhì)空白特征離子色譜圖；F： 牛奶空白添加試樣特征離子色譜圖(5 ng/mL)；G： 羊奶基質(zhì)空白特征離子色譜圖；H： 羊奶空白添加試樣特征離子色譜圖(5 ng/mL)

2.3 精密度與準(zhǔn)確度 從表3可以看出，雞蛋樣品中泰樂菌素A在5 ng/g～600 ng/g添加濃度范圍內(nèi)，平均回收率在90.1%～98.4%之間，批內(nèi)、批間變異系數(shù)在2.7%～10.4%之間；牛奶樣品中泰樂菌素A在5 ng/g～200 ng/g添加濃度范圍內(nèi)，平均回收率在86.3%～98.5%之間，批內(nèi)、批間變異系數(shù)在4.3%～10.4%之間；羊奶樣品中泰樂菌素A在5 ng/g～200 ng/g添加濃度范圍內(nèi)，平均回收率在86.9%～95.9%之間，批內(nèi)、批間變異系數(shù)在4.1%～8.5%之間。

表3 空白雞蛋、牛奶和羊奶中泰樂菌素A的添加回收率

3 討論與小結(jié)

3.1 色譜條件的優(yōu)化 通過比較大環(huán)內(nèi)酯素類藥物常用的甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-0.1%甲酸水等流動相體系，發(fā)現(xiàn)甲醇-0.1%甲酸水作為流動相，出峰時間晚，響應(yīng)值低，而采用乙腈-0.1%甲酸水作為流動相，可避免泰樂菌素A色譜峰展寬等問題，同時可獲得對稱、尖銳的峰形，因此選擇乙腈-0.1%甲酸水作為流動相。

3.2 提取液的優(yōu)化 提取溶液不僅影響藥物的提取效率，同時也會對藥物在固相萃取柱上的保留產(chǎn)生影響。本文根據(jù)文獻(xiàn)分別對甲醇、80%乙腈和乙腈三種不同提取液進(jìn)行考察[19-20]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甲醇提取時，提取液渾濁，過柱容易堵塞；80%乙腈提取時，容易發(fā)生結(jié)塊，且不容易過微孔濾膜；乙腈提取時，對藥物有較好的溶解性和較強(qiáng)的去除蛋白質(zhì)能力，能降低樣品基質(zhì)對分析測定的干擾，且平均回收率在80.1%～103.5%之間，因此選擇乙腈作為提取液。

3.3 固相萃取柱的選擇 根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)分別考察了Waters Prime HLB、C18和Waters HLB等固相萃取柱的凈化效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)C18柱和HLB柱二者也能較好的凈化樣品，但需要經(jīng)過活化、淋洗、洗脫等繁瑣的過程，不便于批量檢測[21]；而Prime HLB柱凈化時，省略了活化、淋洗、洗脫3步流程，操作簡便，能更好地凈化乳及乳制品中的蛋白質(zhì)和磷脂等雜質(zhì)[22]，且平均回收率在86.3%～98.5%之間，因此選擇Prime HLB固相萃取柱凈化。

本文建立了液相色譜串聯(lián)質(zhì)法測定雞蛋及牛羊奶三種基質(zhì)中泰樂菌素A的檢測方法，其檢測限為2 ng/mL，定量限為5 ng/mL，具有良好的重現(xiàn)性，準(zhǔn)確度高，精密度好，前處理方法便捷，適用于雞蛋及牛羊奶中泰樂菌素A殘留的測定。