趙 輝，李雙星，朱明哲，趙 洋，杜吉革，劉業(yè)兵，張傳美，印春生*

(1. 中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081；2. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，山東青島 266109)

貓傳染性腹膜炎是由貓傳染性腹膜炎病毒(Feline infectious peritonitis virus, FIPV)引起的貓的一種全身性、致死性疾病[1],臨床上以纖維性和肉芽腫性漿膜炎，富含蛋白質(zhì)的漿液性積液或膿性肉芽腫性病變?yōu)橹饕卣?，根?jù)臨床表現(xiàn)形式不同可分為濕性、干性以及混合性三種類型[2]。FIPV的感染和發(fā)病率很低，很少超過5%，幼貓(6月齡～2歲)易感染FIPV[3-4]；阿比西尼亞、比爾曼、喜馬拉雅、拉格多爾和雷克斯等品種的貓更容易感染FIPV[5]。唐小娟等[6]對(duì)武漢市2017-2018年的貓傳染性腹膜炎陽性病例進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，共收集了臨床病例1036例，其中貓傳染性腹膜炎陽性病例數(shù)61例，發(fā)現(xiàn)陽性檢出率為5.9%。Guan等[7]對(duì)黑龍江省哈爾濱市家庭寵物貓和流浪貓進(jìn)行了兩年的FIPV感染流行病學(xué)評(píng)估，利用2017年7月至2019年7月采集的1523份貓血樣本進(jìn)行實(shí)時(shí)RT-PCR檢測，共檢出189份FIPV陽性血樣，F(xiàn)IPV感染率約為12%。

FIPV屬于尼多病毒目(Nidovirales)，冠狀病毒科(Coronaviridae)，α冠狀病毒屬(Alphacoronavirus)。FIPV與貓腸道冠狀病毒(Feline enteric coronavirus,FECV)是貓冠狀病毒(Feline coronavirus,FCoV)的兩種生物型。FIPV 基因組全長約30 kb，包括11個(gè)開放閱讀框，編碼4種主要結(jié)構(gòu)蛋白，即刺突蛋白S、膜蛋白E、包膜蛋白M和核衣殼蛋白N；編碼7種非結(jié)構(gòu)蛋白，即復(fù)制酶蛋白(1a和1b)以及輔助蛋白(3a、3b、3c、7a和7b)[8]。在FCoV的發(fā)病機(jī)理中，S蛋白被認(rèn)為是最重要的影響因素，該蛋白還影響FCoV的嗜性和毒力，以及從腸道疾病到貓傳染性腹膜炎的轉(zhuǎn)變[9]。S蛋白是FIPV識(shí)別、進(jìn)入宿主細(xì)胞過程中的重要因素，它的S1區(qū)域識(shí)別并結(jié)合宿主細(xì)胞上的受體，S2區(qū)域參與病毒和宿主細(xì)胞膜融合[10-11]。根據(jù)S蛋白氨基酸序列和抗體中和的差異，將FCoV分兩種血清型，F(xiàn)CoV-I型和FCoV-Ⅱ型[12-13]，因此分析S基因是至關(guān)重要的。N基因編碼病毒核衣殼蛋白，N蛋白由NTD和CTD兩個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域是N蛋白結(jié)合病毒RNA所必需的[14]。N基因相對(duì)保守，常被用于研究病毒的遺傳進(jìn)化分析[15]。本研究從北京地區(qū)臨床疑似患貓傳染性腹膜炎的樣品中成功分離獲得一株FIPV，克隆測序分析該毒株的S基因和N基因，以期掌握該地區(qū)目前FIPV的變異、流行特點(diǎn)，為FIPV的疫苗研制和診斷方法的建立等進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及主要試劑 MDCK細(xì)胞由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所保存；胎牛血清購自浙江天杭生物科技股份有限公司；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液購自Gibco公司；FIPV單克隆抗體(FIPV3-70)購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；免疫染色通透液(TritonX-100)、細(xì)胞核染料DAPI溶液均購自 Solarbio公司；FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗購自GenStar公司； 病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。反轉(zhuǎn)錄酶、高保真酶購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司。

1.2 病毒的分離培養(yǎng)與鑒定 采集疑似患貓傳染性腹膜炎的貓新鮮糞便或腹水，用預(yù)冷的MEM培養(yǎng)基稀釋后充分震蕩，12000 r/min離心3 min取上清，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后接種于單層的MDCK細(xì)胞，另設(shè)正常細(xì)胞做陰性對(duì)照，每隔12 h觀察細(xì)胞狀態(tài)并記錄。當(dāng)80%的細(xì)胞發(fā)生病變時(shí)置于-80 ℃冰箱凍融三次后，6000 r/min 4 ℃離心10 min，收獲病毒液上清。取上清液提取病毒核酸，進(jìn)行RT-PCR鑒定。

1.3 間接免疫熒光試驗(yàn) 取病毒液接種于48孔板中單層的MDCK細(xì)胞，感作2 h，并設(shè)置正常細(xì)胞對(duì)照，待細(xì)胞出現(xiàn)病變還未脫落時(shí)，吸棄培養(yǎng)液，PBS洗滌3次；每孔加入100 μL預(yù)冷的80%丙酮溶液，室溫固定15 min，PBS洗滌3次；用100 μL 0.5%的TritonX-100通透10 min，PBS洗滌3次；每孔加入100 μL 5%脫脂乳于37 ℃溫箱內(nèi)封閉2 h，吸棄封閉液，PBST洗滌3次；加入100 μL 1∶200稀釋的FIPV單克隆抗體(FIPV3-70)，37 ℃孵育2 h，PBST洗滌3次；加入100 μL 1∶500稀釋的FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗，避光孵育1 h，PBST洗3遍；加入100 μL DAPI染核3 min，PBST洗3遍，于倒置熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.4 病毒滴度測定 MDCK細(xì)胞消化重懸后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/mL的懸液后加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，100 μL/孔，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞鋪滿單層后，將病毒按照10倍倍比稀釋至10-10，每個(gè)稀釋度設(shè)置8孔重復(fù)，以未感染的MDCK細(xì)胞作為對(duì)照組，連續(xù)觀察5 d，記錄每個(gè)稀釋度的病變孔數(shù)，利用Reed-Muench氏法計(jì)算病毒滴度。

1.5 RT-PCR鑒定 根據(jù)RNA提取試劑盒說明書提取病毒RNA，并進(jìn)行S、N基因序列的擴(kuò)增。根據(jù)GenBank上發(fā)表的FIPV的基因序列設(shè)計(jì)N基因的特異性引物，根據(jù)參考文獻(xiàn)[6]合成部分S基因引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；PCR產(chǎn)物由生工生物工程(上海)股份有限公司測序。S、N基因引物序列信息見表1。

表1 引物序列信息

1.6 S、N基因遺傳進(jìn)化分析 參考國內(nèi)外FCoV毒株的基因組序列，采用鄰接法 (Neighbor-Joining method) 使用MEGA7.0軟件構(gòu)建基于部分S基因序列和完整的N基因序列的遺傳進(jìn)化樹，并通過S基因的遺傳進(jìn)化樹進(jìn)行生物型和血清型分型鑒定。利用Megalign軟件S 、N基因序列進(jìn)行核苷酸同源性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒分離 將病料離心后接種于MDCK細(xì)胞，并設(shè)置正常細(xì)胞做對(duì)照。3 d后接毒細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、脫落，對(duì)照細(xì)胞無明顯變化(圖1)。收取病毒上清液后提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用1.5中的引物進(jìn)行PCR檢測，顯示該細(xì)胞上清液FIPV陽性。

A： FIPV感染的MDCK細(xì)胞; B： MDCK細(xì)胞對(duì)照

2.2 病毒間接免疫熒光鑒定 利用FIPV單克隆抗體(FIPV3-70)對(duì)分離的毒株進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn)鑒定，在倒置熒光顯微鏡下可見接種病毒的MDCK細(xì)胞有特異性綠色熒光，對(duì)照細(xì)胞無熒光(圖2)。間接免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證明該病毒為FIPV。傳至第5代時(shí)，測定病毒滴度為105.5TCID50/0.1mL。

Anti-FIPV：FIPV單克隆抗體(FIPV3-70)；DAPI：細(xì)胞核染色

2.3 病毒RT-PCR檢測 利用1.5中的引物對(duì)分離的FIPV進(jìn)行S、N基因的PCR 擴(kuò)增，通過1%瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果顯示，分離病毒RT-PCR產(chǎn)物大小分別為705 bp、1073 bp，與預(yù)期相符(圖3、圖4)。將PCR產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序，測序結(jié)果經(jīng)BLAST比對(duì)確定，該毒株為FIPV，將該分離株命名為FIPV/BJ01。

M： DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1： FIPV/BJ01 S基因; -： 陰性對(duì)照

M：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1：FIPV/BJ01 N基因; -：陰性對(duì)照

2.4 S、N基因遺傳進(jìn)化分析

2.4.1 S基因遺傳進(jìn)化分析 根據(jù)FCoV S基因生物型遺傳進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示，分離株FIPV/BJ01屬于FIPV生物型(圖5)。核苷酸同源性分析結(jié)果表明，F(xiàn)IPV/BJ01分離株與各參考毒株核苷酸同源性為63.3%～99.4%。

FCoV S基因血清型遺傳進(jìn)化樹結(jié)果表明，分離株FIPV/BJ01屬于FCoV-Ⅱ簇(圖6)，與其他參考毒株的核苷酸同源性為63.3%～99.4%。

■代表本試驗(yàn)分離毒株

2.4.2 N基因遺傳進(jìn)化分析 基于N基因的遺傳進(jìn)化樹結(jié)果顯示，F(xiàn)IPV/BJ01分離株與美國分離株(KC461237.1、KC461236.1、KC461235.1、AY994055.1)親緣關(guān)系較近，而與中國分離株(MK840958、KYS66208.1、KY566207.1、KY566210.1、KY587337.1、DQ160294.1、KY566206.1)親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖7)。FIPV/BJ01株與其他分離株核苷酸同源性為45.5%～99.2%。

▲代表本試驗(yàn)分離毒株

3 討 論

貓傳染性腹膜炎發(fā)病率較低，但是導(dǎo)致貓高死亡率，且世界范圍流行，嚴(yán)重危害貓的健康，對(duì)寵物行業(yè)也造成較大的影響。貓傳染性腹膜炎目前尚無有效的預(yù)防、治療措施。FIPV是導(dǎo)致貓傳染性腹膜炎發(fā)生的病原，與貓泛白細(xì)胞減少癥病毒、貓皰疹病毒和貓杯狀病毒是導(dǎo)致貓死亡的四大主要病因[16]。FCoV在貓群中感染較為普遍，但基本不會(huì)引起貓患病或僅引起腸道感染，極少數(shù)才會(huì)發(fā)展成為貓傳染性腹膜炎。有研究發(fā)現(xiàn)貓傳染性腹膜炎感染的貓?bào)w內(nèi)病毒突變產(chǎn)生了毒力增強(qiáng)的FCoV，但是致病機(jī)制尚不清楚。有學(xué)者認(rèn)為FIPV是由FECV內(nèi)部突變而來，但這一理論也遭到其他學(xué)者的質(zhì)疑[17-18]。

目前國內(nèi)對(duì)FIPV的報(bào)道較少，本研究成功分離得到一株FIPV/BJ01分離株，屬于FCoV-Ⅱ血清型，測定病毒滴度為105.5TCID50/0.1mL。本研究針對(duì)分離的FIPV的部分S基因和完整的N基因序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析和核苷酸同源性分析，結(jié)果表明FIPV/BJ01分離株與美國分離株親緣關(guān)系較近，而與中國分離株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，說明該病例可能是由于國外毒株輸入引起的。研究證明，貓感染FCoV-I是最為普遍，在歐美國家流行率可達(dá)80%～95%，而FCoV-Ⅱ的感染卻很少見，但在亞洲各國FCoV-Ⅱ感染率達(dá)到25%[19-20]。有研究報(bào)道FCoV-Ⅱ是由FCoV-I和犬冠狀病毒重組產(chǎn)生，相對(duì)容易在細(xì)胞中增殖并導(dǎo)致細(xì)胞病變[21]。本研究中分離到的毒株為后續(xù)開展相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。