凍楊美，林德貴，晏 磊，周德剛，潘貴珍，田朋飛，楊絨娟

(1.國(guó)家獸用藥品工程技術(shù)研究中心/洛陽惠中獸藥有限公司，河南洛陽 471003；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 100083；3.洛陽樂寵健康科技有限公司，河南洛陽 471003)

近年來，隨著全球氣候變暖和環(huán)境變化，蜱及蜱媒病的發(fā)生率逐年升高[1]。蜱是專性吸血的外寄生蟲，蜱媒病是由蜱蟲攜帶病原后叮咬吸血而傳播的疾病，蜱媒病不僅是自然疫源性疾病，也是人畜共患病，如全球范圍內(nèi)廣泛流行的萊姆病、巴貝斯蟲病、人單核細(xì)胞埃里克體病以及歐洲和中東地區(qū)的地中海斑點(diǎn)熱[2-4]。近年蜱及蜱媒病已引起大家廣泛關(guān)注[5-7]。2017年發(fā)現(xiàn)蜱傳播的疾病又新增一種阿龍山病毒[8]，并從86名具有臨床癥狀的患者體內(nèi)檢測(cè)到該病毒。中國(guó)疾病預(yù)防控制中心發(fā)表的2018年全國(guó)蜱類監(jiān)測(cè)報(bào)告顯示[9]，犬類感染蜱指數(shù)僅次于牛和羊，因此寵物感染蜱情況不容小覷，蜱媒病的防控具有重要的公共衛(wèi)生意義。

據(jù)此，洛陽惠中獸藥有限公司研制了一款用于預(yù)防和控制犬蜱蟲和跳蚤感染的外用滴劑，為非潑羅尼和甲氧普烯的復(fù)方制劑，2020年獲得二類新獸藥證書。復(fù)方非潑羅尼滴劑最早由梅里亞有限公司開發(fā)，目前國(guó)外已有報(bào)道復(fù)方非潑羅尼滴劑對(duì)犬蜱蟲的殺滅效果，本研究采用洛陽惠中獸藥有限公司提供的復(fù)方非潑羅尼滴劑，通過廣泛收集南北地區(qū)自然感染蜱患犬進(jìn)行臨床效果評(píng)價(jià)，以期驗(yàn)證國(guó)產(chǎn)復(fù)方非潑羅尼滴劑的臨床使用效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)用動(dòng)物 動(dòng)物的入選標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)臨床檢查和實(shí)驗(yàn)室診斷確定感染蜱蟲的犬，且近6個(gè)月未接受過針對(duì)蜱蟲等外寄生蟲的藥物治療；試驗(yàn)犬在試驗(yàn)前感染蜱蟲數(shù)量≥1只，品種和性別不限，年齡8周齡或以上。試驗(yàn)用動(dòng)物來源于北京市中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)院、中農(nóng)大我愛動(dòng)物醫(yī)院和海南省小動(dòng)物保護(hù)協(xié)會(huì)?？谑袆?dòng)物醫(yī)院接診的臨床病例。

1.1.2 試驗(yàn)藥物 ①復(fù)方非潑羅尼滴劑。規(guī)格：1 mL(100 mg非潑羅尼+90 mg甲氧普烯)；包裝：0.67 mL/支，1.34 mL/支，2.68 mL/支；洛陽惠中獸藥有限公司。②福萊恩增效滴劑。規(guī)格：1 mL(100 mg非潑羅尼+90 mg甲氧普烯)；包裝：0.67 mL/支，1.34 mL/支，2.68 mL/支；法國(guó)梅里亞集團(tuán)。

1.1.3 主要儀器 生物顯微鏡(XSZ-N107CCD)，德國(guó)Novel公司；3M聽診器(5620)，美國(guó)3M公司；四通道正倒數(shù)計(jì)時(shí)器(PS-396)，深圳追日電子科技有限公司；電子臺(tái)稱(TCS-01R)，廈門佰倫斯電子科技有限公司；電子體溫計(jì)(MC-347)，歐姆龍(大連)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)分組 試驗(yàn)分為A、B兩組，A組為試驗(yàn)組(復(fù)方非潑羅尼滴劑)，B組為對(duì)照藥物組(福萊恩增效滴劑)。共收集試驗(yàn)犬120只，其中北京市60只，A組30只，B組30只；?？谑?0只，A組30只，B組30只，北京市和?？谑腥脒x的試驗(yàn)犬隨機(jī)分到A組和B組。

1.2.2 給藥方案 給藥前稱量動(dòng)物體重，按照體重范圍選擇藥物規(guī)格，撥開犬肩胛骨間的毛發(fā)，將滴劑沿脊柱向后滴于皮膚上，自然風(fēng)干，至完全吸收，給藥1次。體重10 kg以下的犬使用0.67 mL；體重10 kg～20 kg的犬使用1.34 mL；體重20 kg～40 kg的犬使用2.68 mL；體重大于40 kg的犬,每增加10 kg，則使用2.68 mL加0.67 mL,依次類推。用藥后嚴(yán)格遵醫(yī)囑，試驗(yàn)犬不能洗澡，直至試驗(yàn)結(jié)束。

1.2.3 試驗(yàn)周期 受試藥物和對(duì)照藥物的試驗(yàn)周期均為35 d，分別在用藥當(dāng)天(0 d)，用藥后1 d～7 d(連續(xù)觀察)、10 d、14 d、21 d、28 d和35 d隨訪1次，觀察相應(yīng)指標(biāo)。

1.2.4 臨床觀察 用藥后密切觀察試驗(yàn)犬的精神狀態(tài)、體溫、呼吸、心搏等常規(guī)指標(biāo)，記錄藥物對(duì)試驗(yàn)犬造成的不良反應(yīng)及副作用。

1.2.5 體外寄生蟲檢查 在用藥當(dāng)天(0 d)，用藥后1 d～7 d(連續(xù)觀察)、10 d、14 d、21 d、28 d和35 d，觀察體表蜱蟲感染的情況，并記錄每只試驗(yàn)犬感染蜱蟲數(shù)量。具體操作方法：評(píng)估過程兩人同時(shí)操作，把犬從籠子里提出置于檢查臺(tái)上，一人一側(cè)，逆著毛發(fā)生長(zhǎng)方向梳理，使皮膚裸露，系統(tǒng)全面地檢查頭部、背部、腹部及四肢，具體包括犬面部、頸部、體側(cè)、腹股溝、四肢等24處部位。對(duì)收集的蜱蟲進(jìn)行顯微鏡形態(tài)學(xué)鑒定。

1.2.6 臨床癥狀評(píng)分標(biāo)準(zhǔn) 在用藥當(dāng)天(0 d)，用藥后1 d～7 d(連續(xù)觀察)、10 d、14 d、21 d、28 d和35 d對(duì)病犬皮膚進(jìn)行檢查。記錄動(dòng)物皮膚病灶部位與分布情況，并按照臨床局部皮膚檢查指標(biāo)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)皮膚紅疹和皮膚瘙癢程度進(jìn)行分級(jí)，評(píng)價(jià)用藥后臨床癥狀的消失和轉(zhuǎn)歸情況。分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)如下。

皮膚紅疹程度分為5個(gè)等級(jí)：無紅疹或已退化(0),紅疹數(shù)1個(gè)/4 cm2～5個(gè)/4 cm2或面積4 cm2～7 cm2(1),紅疹數(shù)6個(gè)/4 cm2～10個(gè)/4 cm2或面積8 cm2～15 cm2(2),紅疹數(shù)11個(gè)/4 cm2～15個(gè)/4 cm2或面積16cm2～20 cm2(3),紅疹數(shù)超過16個(gè)/4 cm2或面積超過20 cm2(4)；皮膚瘙癢程度分為5個(gè)等級(jí)：無(0),偶發(fā)1次/10 min～5次/10 min(1),頻發(fā)6次/10 min～10次/10 min(2),常發(fā)11次/10 min～15次/10 min(3),高發(fā)>15次/10 min(4)。

1.2.7 藥物療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 按下列公式分別計(jì)算每組動(dòng)物每種蟲體的轉(zhuǎn)陰率、減少率，并計(jì)算總的蟲體轉(zhuǎn)陰率、減少率，評(píng)估各組藥效。

蟲體轉(zhuǎn)陰率(%)=蟲體轉(zhuǎn)陰動(dòng)物數(shù)/試驗(yàn)動(dòng)物數(shù)×100

蟲體減少率(%)=驅(qū)蟲前蟲體數(shù)-驅(qū)蟲后蟲體數(shù)/驅(qū)蟲前蟲體數(shù)×100

有效：用藥治療期間和用藥結(jié)束后，皮膚(或耳部)的體外寄生蟲數(shù)量平均減少率≥90%，患部無瘙癢，無紅疹、皮屑或試驗(yàn)動(dòng)物自我啃咬的損傷。

無效：用藥治療期間和用藥結(jié)束后，皮膚(或耳部)的體外寄生蟲數(shù)量平均減少率<90%，患部仍有瘙癢，紅疹、皮屑等，試驗(yàn)動(dòng)物自我啃咬的損傷明顯存在。

2 結(jié)果

2.1 臨床觀察

復(fù)方非潑羅尼滴劑組和福萊恩增效滴劑組的試驗(yàn)犬在用藥前后試驗(yàn)犬的精神狀態(tài)、飲水食欲、活動(dòng)性、體溫、呼吸、心搏均無異常，說明試驗(yàn)犬對(duì)這兩種藥物的耐受性均很好。

2.2 體外寄生蟲檢查

北京市從60只蜱蟲感染病例犬身上共收集到83只蜱蟲樣本，經(jīng)鑒定79只為血紅扇頭蜱，4只為長(zhǎng)角血蜱。?？谑袕?0只蜱蟲感染病例犬身上共收集到72只蜱蟲樣本，經(jīng)鑒定均為血紅扇頭蜱。從表1中可以看出，在南北方不同地區(qū)進(jìn)行治療蜱蟲感染的兩組試驗(yàn)犬，在用藥后蜱蟲數(shù)量均得到有效控制，且不同地區(qū)、不同組別在用藥后各時(shí)間點(diǎn)蜱蟲數(shù)量均無顯著差異(P>0.05)，給藥后1 d蜱蟲數(shù)量迅速下降，給藥后3 d兩個(gè)用藥組蜱蟲數(shù)量都下降至零，復(fù)方非潑羅尼滴劑組至少可持續(xù)維持到第28天。

表1 不同地區(qū)蜱蟲感染病例用藥后蜱蟲數(shù)量變化Table 1 Changes in the number of ticks in cases of tick infection in different regions after medication

2.3 皮膚臨床癥狀評(píng)分?jǐn)?shù)據(jù)分析

蜱蟲感染病例犬在用藥后不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行臨床局部皮膚檢查，兩組患犬的皮膚病灶主要分布在頸部、腹部，少量分布在背部及四肢，各時(shí)間點(diǎn)體表紅疹程度、瘙癢程度平均評(píng)分結(jié)果見表2和表3，用藥后兩組犬皮膚紅疹癥狀和瘙癢癥狀均得到明顯好轉(zhuǎn)，不同組別、不同地區(qū)患犬用藥后7 d紅疹基本消失，用藥后4 d瘙癢癥狀基本消失，A組和B組之間無顯著差異(P>0.05)，可見復(fù)方非潑羅尼滴劑可顯著緩解、治療局部瘙癢與紅疹癥狀。

表2 不同地區(qū)蜱蟲感染病例用藥后皮膚紅疹程度評(píng)分變化Table 2 Changes in skin erythema scores of tick infection cases in different regions after medication

表3 不同地區(qū)蜱蟲感染病例用藥后皮膚瘙癢程度評(píng)分變化Table 3 Changes in skin pruritus scores of tick infection cases in different regions after medication

2.4 療效評(píng)價(jià)結(jié)果

北京市A組患犬綜合體表蟲體檢查結(jié)果和局部皮膚檢查結(jié)果，在用藥結(jié)束28 d和35 d蟲體轉(zhuǎn)陰率分別為100%和83.3%，蟲體平均減少率分別為100%和94.8%，第35天有6只患犬復(fù)發(fā)瘙癢、紅疹等癥狀；B組在用藥結(jié)束28 d和35 d蟲體轉(zhuǎn)陰率分別為96.7%和96.7%，蟲體平均減少率分別為99.2%和99.2%，第28天僅有1只患犬復(fù)發(fā)瘙癢、紅疹。

海南市A組患犬綜合體表蟲體檢查結(jié)果和局部皮膚檢查結(jié)果，在用藥結(jié)束28 d和35 d蟲體轉(zhuǎn)陰率分別為100%和100%，蟲體平均減少率分別為100%和100%，患部無瘙癢、紅疹等癥狀；B組在用藥結(jié)束28 d和35 d蟲體轉(zhuǎn)陰率分別為100%和96.7%，蟲體平均減少率分別為100%和98.9%，第35天僅有1只患犬復(fù)發(fā)瘙癢、紅疹。

根據(jù)療效判定標(biāo)準(zhǔn)，試驗(yàn)藥物和對(duì)照藥物在用藥后第28天和第35天，皮膚的體外寄生蟲數(shù)量平均減少率均>90%，且90%以上患犬無瘙癢，無紅疹、皮屑，亦未見試驗(yàn)動(dòng)物有自我啃咬現(xiàn)象，可見復(fù)方非潑羅尼滴劑對(duì)治療犬蜱蟲病效果顯著。

3 討論

為科學(xué)、公正地評(píng)價(jià)在田間條件下受試藥物對(duì)目標(biāo)適應(yīng)癥的臨床治療效果，本研究根據(jù)中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公告1425號(hào)《寵物用抗體外寄生蟲藥物藥效評(píng)價(jià)田間試驗(yàn)指導(dǎo)原則》，考察了復(fù)方非潑羅尼滴劑對(duì)犬蜱蟲病的臨床治療效果，旨在評(píng)價(jià)臨床應(yīng)用的有效性和安全性。

復(fù)方非潑羅尼滴劑有效成分為非潑羅尼(10%m/v)和甲氧普烯(9%，m/v)，非潑羅尼作為殺成蟲劑作用于蜱和跳蚤成蟲，甲氧普烯作為昆蟲生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑作用于跳蚤卵和幼蟲，二者協(xié)同發(fā)揮增效作用。復(fù)方非潑羅尼滴劑對(duì)兩種蟲體的臨床效力驗(yàn)證試驗(yàn)分階段進(jìn)行，因此本研究重點(diǎn)回顧性分析了對(duì)蜱蟲的殺滅作用。非潑羅尼為新型苯基吡唑類殺蟲劑，與傳統(tǒng)殺蟲劑(有機(jī)磷類、擬除蟲酯類、氨基甲酸酯類)相比，具有廣譜、高效、毒副作用小、半衰期長(zhǎng)以及對(duì)非靶標(biāo)動(dòng)物安全的優(yōu)點(diǎn)[10]，且藥物結(jié)構(gòu)新穎、活性高、作用機(jī)制獨(dú)特，屬新一代高技術(shù)殺蟲劑。非潑羅尼為γ-氨基丁酸(GABA-A)受體拮抗劑，參與GABA-A受體周圍生物膜活性[11]，通過非競(jìng)爭(zhēng)性抑制GABA誘導(dǎo)的靶向氯離子通道，導(dǎo)致蟲體神經(jīng)元和肌肉過度興奮而死亡，可在24 h內(nèi)殺死寵物體表成年蜱蟲、跳蚤。雖然非潑羅尼對(duì)昆蟲和哺乳動(dòng)物的作用機(jī)制相同，但由于其對(duì)昆蟲GABA受體的親和力明顯高于哺乳動(dòng)物，應(yīng)用時(shí)對(duì)哺乳動(dòng)物具有較高的安全性，在本研究期間未見任何不良反應(yīng)。且文獻(xiàn)報(bào)道非潑羅尼對(duì)昆蟲GABA受體的親和力為哺乳動(dòng)物的500倍[12]，可見此藥安全性高。

蜱蟲是危害犬健康的重要外寄生蟲，寄生于犬體表的蜱主要有血紅扇頭蜱、長(zhǎng)角血蜱和鐮形扇頭蜱。本研究從北京市、海口市寵物醫(yī)院共收集155只蜱蟲，經(jīng)鑒定151只為血紅扇頭蜱，4只為長(zhǎng)角血蜱，表明血紅扇頭蜱是危害我國(guó)犬的主要蜱種，與報(bào)道結(jié)果一致[13]。我國(guó)蜱蟲種群分布特點(diǎn)以長(zhǎng)角血蜱為主[14]，故應(yīng)高度重視對(duì)血紅扇頭蜱和長(zhǎng)角血蜱的防控。蜱的分布受多種因素影響，溫度和濕度是決定蜱發(fā)育和存活的關(guān)鍵因素[15-16]，而我國(guó)各地氣候和地域地理?xiàng)l件的不同，可能會(huì)對(duì)蜱蟲的滋生與繁殖有一定影響，因此驗(yàn)證復(fù)方非潑羅尼藥效的同時(shí)兼顧考察不同地區(qū)蜱蟲對(duì)該藥的敏感性，根據(jù)指導(dǎo)原則設(shè)計(jì)在南方(?？谑?和北方(北京市)各選擇一片區(qū)域進(jìn)行藥效評(píng)價(jià)試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果表明復(fù)方非潑羅尼滴劑對(duì)不同地區(qū)蜱蟲的驅(qū)殺效果無明顯差異，給藥后2 d，患犬體表蜱蟲數(shù)量迅速下降，用藥后3 d即可完全殺滅，且藥效可維持28 d，蟲體平均減少率可達(dá)100%，且試驗(yàn)藥物與對(duì)照藥物無顯著差異，與文獻(xiàn)[17-18]結(jié)果一致。通過臨床試驗(yàn)比較沙羅拉納與非潑羅尼的殺蜱效果，用藥30 d內(nèi)兩種藥物均可高效殺滅蜱蟲，蟲體減少率達(dá)到94.1%[19]，與本研究在北京市試驗(yàn)結(jié)果(蟲體減少率94.8%)基本一致。用3種濃度的非潑羅尼(0.025%、0.05%、0.1%，m/v)研究其對(duì)蜱蟲的殺滅效果，結(jié)果證實(shí)3種濃度對(duì)蜱蟲的殺滅率均大于99%[20]。給藥42 h后沐浴，反復(fù)侵染蟲體，殺蟲率依然能達(dá)到98.52%[21]，且光照、沐浴不會(huì)影響其殺蟲效果[22]。本研究為更加科學(xué)、直觀地反映藥效，除通過定期檢查統(tǒng)計(jì)體外寄生蟲減少率外，同時(shí)借助臨床癥狀指標(biāo)皮膚瘙癢和皮膚紅疹程度評(píng)分進(jìn)行評(píng)價(jià)，由統(tǒng)計(jì)結(jié)果可以看出該藥藥效確切且效力持久。

復(fù)方非潑羅尼滴劑對(duì)我國(guó)南北方蜱蟲病均具有較好治療效果，用藥1次可維持28 d，蟲體平均減少率可高達(dá)100%，按推薦劑量使用有效性強(qiáng)、安全性高，可以用于我國(guó)不同地區(qū)犬蜱蟲病的預(yù)防和治療。臨床推薦使用方法：外用，撥開犬肩胛骨間的毛發(fā)，將滴劑沿脊柱向后滴于皮膚上，自然風(fēng)干；體重10 kg以下的犬使用0.67 mL，體重10 kg～20 kg的犬使用1.34 mL，體重20 kg～40 kg的犬使用2.68 mL；體重40 kg以上的犬使用2.68 mL加上體重超出部分對(duì)應(yīng)的劑量，28 d用藥1次。