李夢磊，劉廣闊，蒲 鵬，張 琪，高 睿，許信剛*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院動物工程分院，陜西楊凌 712100)

山羊海藻百伯史坦菌(Bibersteiniatrehalosi)屬于巴氏桿菌科、比伯斯坦桿菌屬成員[1]，本菌為革蘭氏陰性球桿菌或短桿菌，主要引起羊呼吸系統(tǒng)疾病，還與羔羊的全身感染有關(guān)，嚴(yán)重時(shí)可致羊死亡。發(fā)病羊臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、呼吸急促、反復(fù)咳嗽、眼鼻常有分泌物、腹瀉、脫水和食欲不振等[2]。國外已經(jīng)有山羊海藻百伯史坦菌感染動物的相關(guān)報(bào)道，但國內(nèi)研究較少。2007年從1例腦膿腫患者頭部分離出山羊海藻百伯史坦菌[3]。2018年從病死羔羊肺臟中分離到山羊海藻百伯史坦菌[4]，這是國內(nèi)首例從動物體內(nèi)分離到該菌，同年在犢牛肺臟出也分離到該菌[5]。該菌對羊呼吸道具有極強(qiáng)的致病力，因此，對于該菌引起疾病的防控與診斷很重要。2021年3月，陜西省某奶山羊場發(fā)生了奶山羊肺炎，其主要癥狀為食欲減少、精神不振、咳嗽、流鼻涕、食欲廢絕，起臥不安甚至出現(xiàn)部分羊只死亡。為找出發(fā)病原因并為治療提供依據(jù)，本文對病死羊的肺臟進(jìn)行病原微生物的分離鑒定，并對分離菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，用篩選出的敏感藥物對病羊肌肉注射治療后，羊群肺炎疫情很快得到控制并治愈。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源 無菌從陜西省某奶山羊場發(fā)生肺炎的病死羊中取出肺臟和肝臟的病料，置于放有冰袋的保溫箱中送實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 培養(yǎng)基 血液瓊脂平板、普通瓊脂平板、半固體糖發(fā)酵培養(yǎng)基等，按照文獻(xiàn)[6]的方法制備。

1.1.3 試劑 MR試劑、VP試劑、革蘭氏染液等按照文獻(xiàn)[6]的方法制備；藥敏紙片購自杭州濱和微生物試劑有限公司。

1.1.4 主要儀器設(shè)備 隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；高速離心機(jī)，長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；PCR基因擴(kuò)增儀，力康生物醫(yī)療科技控股有限公司；凝膠成像分析系統(tǒng)，北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司。

1.1.5 實(shí)驗(yàn)動物 健康昆明小鼠10只，體重30 g左右，購自空軍大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離 將無菌采集的肺臟和肝臟病料分成兩部分，一部分病料劃線分離接種到鮮血瓊脂平板上，將平板置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，挑取優(yōu)勢單菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，若為純培養(yǎng)物，進(jìn)一步劃線分離于鮮血瓊脂平板上進(jìn)行純培養(yǎng)。另一部分病料置于加無菌石蠟油的肝塊肉湯中進(jìn)行厭氧培養(yǎng)。

1.2.2 分離菌形態(tài)觀察、鑒定及藥敏試驗(yàn) 挑取分離純化后的單菌落按照文獻(xiàn)[6]方法進(jìn)行形態(tài)結(jié)構(gòu)與染色特性觀察。根據(jù)文獻(xiàn)[7]相關(guān)研究進(jìn)行糖分解試驗(yàn)、VP、MR試驗(yàn)等。按照文獻(xiàn)[8]介紹的紙片擴(kuò)散法操作判定分離菌的耐藥性。

1.2.3 16S rRNA基因序列測定 細(xì)菌采用水煮法提取DNA，選用16S rRNA通用引物，上游引物為：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG下游引物為：GGTTACCTTGTTACGACTT。PCR反應(yīng)體系20 μL：模板DNA 2 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL、Mix 10 μL，其余用ddH2O補(bǔ)足，按照以下程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增：95℃ 10 min；95℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。目的片段約為1 500 bp。PCR陽性產(chǎn)物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司進(jìn)行16S rRNA基因測序。將測序結(jié)果上傳NCBI官網(wǎng)進(jìn)行序列比對確定分離株種類。

1.2.4 小鼠致病性試驗(yàn) 將分離株單個(gè)菌落接種到肉湯培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)24 h后，用平板計(jì)數(shù)法測定細(xì)菌濃度，用滅菌的生理鹽水將菌液稀釋至濃度1×108CFU/mL，備用。將10只健康昆明系小鼠隨機(jī)分成兩組，一組為試驗(yàn)組，腹腔注射菌液0.2 mL/只；另外一組為對照組，腹腔注射肉湯0.2 mL/只。在合適的飼養(yǎng)條件下每日觀察小鼠狀態(tài)。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離與染色結(jié)果

肝臟和肺臟中各分離到1株菌，該分離株在鮮血平板上于37℃培養(yǎng)過夜后，有淡黃色中等大小菌落生長，菌落表面光滑、邊緣整齊。挑取單菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢后，結(jié)果顯示為革蘭氏陰性桿菌(圖1)，形態(tài)學(xué)觀察顯示，肝臟和肺臟中分離到的2株細(xì)菌形態(tài)一致。厭氧培養(yǎng)基也有細(xì)菌生長，鏡檢顯示為革蘭氏陰性桿菌與鮮血平板上所生長菌相似。

圖1 菌株染色鏡檢結(jié)果Fig.1 Results of microscopic examination of strain staining

2.2 生化特性

該分離菌能分解海藻糖、葡萄糖、乳糖、甘露糖以及蔗糖，不分解半乳糖、山梨糖與鼠李糖；VP、MR試驗(yàn)為陰性(表1)。這2株菌生化特性相同，初步鑒定為同屬于一種細(xì)菌，其生化特性與山羊海藻百伯史坦菌相符。

表1 分離株生化試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Biochemical test results of isolates

2.3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

篩選臨床常用10種藥物進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果顯示該菌對丁胺卡那高度敏感，對多黏菌素B中度敏感(表2)。

表2 分離株藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of drug sensitivity test of isolates

2.4 16S rRNA基因序列測定結(jié)果

將2株分離菌株分別進(jìn)行16S rRNA PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物送北京奧科鼎盛生物科技有限公司測序，測序結(jié)果在NCBI官網(wǎng)進(jìn)行Blast序列比對。結(jié)果顯示，2株分離菌株與山羊海藻百伯史坦菌序列同源性高達(dá)98%，可確定2株分離株為同一種菌，均為山羊海藻百伯史坦菌。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1.菌株1；2.菌株2M.DNA Marker DL 2 000；1.Strain 1；2.Strain 2圖2 菌株16S rRNA PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR amplification results of 16S rRNA of strains

2.5 小鼠致病性試驗(yàn)

將分離株菌液注射到小鼠腹腔使小鼠感染后，24 h試驗(yàn)組小鼠開始出現(xiàn)精神沉郁、行動遲緩等癥狀，2 d后感染組小鼠開始出現(xiàn)死亡，取死亡小鼠進(jìn)行無菌剖檢，發(fā)現(xiàn)小鼠肺臟邊緣點(diǎn)狀出血，肝臟有很多灰色病灶。分別將肝臟、肺臟進(jìn)行涂片鏡檢與分離培養(yǎng)PCR鑒定，鏡檢發(fā)現(xiàn)革蘭氏陰性球桿菌。結(jié)果顯示，致使小鼠死亡的病原菌為注射所用的山羊海藻百伯史坦菌。對照組小鼠未見有異常情況。

3 討論

山羊海藻百伯史坦菌作為一種人畜共患病原菌，是導(dǎo)致大角羊暴發(fā)流行性肺炎的重要病原體，極大的降低了大角羊的存活率和種群數(shù)量[5,9]?，F(xiàn)階段國內(nèi)雖然發(fā)病較少，但隨著經(jīng)濟(jì)全球化的不斷發(fā)展，我國的對外貿(mào)易也日益頻繁，該菌對我國畜牧養(yǎng)殖業(yè)和社會公共衛(wèi)生帶來一定的安全隱患。因此，對于山羊海藻百伯史坦菌的防控工作也變得日益重要。本試驗(yàn)從有明顯呼吸道癥狀的病羊肺臟中分離得到分離株，通過傳統(tǒng)的生化試驗(yàn)以及16S rRNA測序比對結(jié)果，確定該分離株為山羊海藻百伯史坦菌，證實(shí)了山羊海藻百伯史坦菌可以感染羊，并由此推斷山羊海藻百伯史坦菌的感染在我國已經(jīng)逐漸成為引起羊呼吸道疾病的一種新的病原菌。盡管我國對于山羊海藻百伯史坦菌的報(bào)道較少，但是藥敏試驗(yàn)表明，該菌已經(jīng)對多種抗生素產(chǎn)生了耐藥性。目前國內(nèi)外還沒有研發(fā)出有效的單價(jià)疫苗來專門預(yù)防山羊海藻百伯史坦菌引起的感染[10]，所以對于該菌引起的呼吸道疾病還有很多問題亟待解決，對于該菌的致病機(jī)制、傳播機(jī)理以及疫苗研發(fā)等方面的進(jìn)一步研究日趨緊迫。本次由山羊海藻百伯史坦菌引起的山羊肺炎，選用丁胺卡那能夠有效治愈。本研究的意義在于對于山羊海藻百伯史坦菌的感染可以及時(shí)發(fā)現(xiàn)，合理選用敏感藥物以此來挽救養(yǎng)殖場的損失，并對于以后研究其耐藥機(jī)制、選用抗菌藥物提供合理依據(jù)，對防控和治療此類病原菌引起的山羊呼吸道疾病具有重要意義。