胡曉坤 趙 越 孔凡洲 張清春 嚴(yán) 冰 于仁成

流式影像儀在東海海域甲藻藻華研究中的應(yīng)用*

胡曉坤1, 3趙 越5孔凡洲1, 2, 4張清春1, 2, 4嚴(yán) 冰6于仁成1, 2, 3, 4①

(1. 中國(guó)科學(xué)院海洋研究所 海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 山東青島 266071; 2. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室 海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)功能實(shí)驗(yàn)室 山東青島 266237; 3. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué) 北京 100049; 4. 中國(guó)科學(xué)院海洋大科學(xué)研究中心山東青島 266071; 5. 山東科技大學(xué) 海洋科學(xué)與工程學(xué)院 山東青島 266590; 6. 暨南大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院 廣東廣州 510632)

有害藻華對(duì)海水養(yǎng)殖、人類健康和生態(tài)安全構(gòu)成威脅, 已成為全球性的生態(tài)災(zāi)害。近20年來(lái), 米氏凱倫藻()、東海原甲藻()等甲藻形成的有害藻華在東海海域連年暴發(fā), 其頻率高、危害大, 形成及演變機(jī)理復(fù)雜, 對(duì)藻華原因種進(jìn)行監(jiān)測(cè)是開(kāi)展有害藻華預(yù)警和防控的有效手段之一。流式影像技術(shù)是顯微鏡與流式細(xì)胞術(shù)相結(jié)合的手段, 能快速分析并記錄流動(dòng)液體中的微粒, 基于此方法的流式影像儀(FlowCam)能實(shí)現(xiàn)對(duì)浮游植物樣本的高通量處理, 可對(duì)海洋環(huán)境中的有害藻華原因種進(jìn)行原位監(jiān)測(cè)。研究以米氏凱倫藻和東海原甲藻為目標(biāo)藻種, 建立了東海原甲藻、米氏凱倫藻細(xì)胞影像庫(kù), 通過(guò)室內(nèi)實(shí)驗(yàn)測(cè)試了FlowCam計(jì)數(shù)和識(shí)別的準(zhǔn)確性, 并結(jié)合航次調(diào)查將FlowCam應(yīng)用于福建近海甲藻藻華的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。結(jié)果表明, FlowCam對(duì)米氏凱倫藻的計(jì)數(shù)結(jié)果與顯微鏡觀察結(jié)果無(wú)顯著差異, 且兩者存在極顯著的線性相關(guān)性(<0.01)。應(yīng)用FlowCam自帶圖像分析軟件VisualSpreadsheet, 可以實(shí)現(xiàn)對(duì)混合藻液中目標(biāo)藻種的自動(dòng)識(shí)別和計(jì)數(shù), 但對(duì)目標(biāo)藻種的準(zhǔn)確識(shí)別還需結(jié)合人工判讀輔助。在2018年4月至6月期間福建近海有害藻華的調(diào)查研究中, 基于FlowCam計(jì)數(shù)的東海原甲藻密度與顯微鏡觀察計(jì)數(shù)結(jié)果基本一致, 并檢測(cè)到低密度(<120 cells/L)的凱倫藻, 表明FlowCam可有效應(yīng)用于有害藻華的現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè), 有望在今后有害藻華監(jiān)測(cè)和預(yù)警中發(fā)揮更大作用。

流式影像儀; 米氏凱倫藻; 東海原甲藻; 有害藻華; 東海

浮游植物是海洋生態(tài)系統(tǒng)的基礎(chǔ)。部分有毒或有害的浮游植物在短時(shí)間內(nèi)大量增殖, 會(huì)形成有害藻華(harmful algal blooms, HABs) (GlobalHAB, 2017), 對(duì)海水養(yǎng)殖、人類健康和生態(tài)安全產(chǎn)生負(fù)面影響(Anderson, 2012)。進(jìn)入21世紀(jì)以來(lái), 我國(guó)長(zhǎng)江口及其鄰近海域連年暴發(fā)甲藻形成的大規(guī)模有害藻華(亦稱赤潮), 米氏凱倫藻()、東海原甲藻()和亞歷山大藻(spp.)等是主要的原因種(于仁成等, 2017)1179。其中, 米氏凱倫藻藻華對(duì)養(yǎng)殖動(dòng)物具有強(qiáng)烈的急性毒性效應(yīng)(Li, 2019), 2005年?yáng)|海海域暴發(fā)的米氏凱倫藻藻華造成養(yǎng)殖魚(yú)類大量死亡, 經(jīng)濟(jì)損失超過(guò)3 000萬(wàn)元; 2012年福建近岸海域暴發(fā)的大規(guī)模米氏凱倫藻藻華導(dǎo)致養(yǎng)殖鮑大量死亡, 經(jīng)濟(jì)損失超過(guò)20億元(Lu, 2014; Li, 2017; Chen, 2021)。東海原甲藻藻華會(huì)抑制中華哲水蚤繁殖, 影響浮游動(dòng)物群落結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài), 對(duì)漁業(yè)資源有潛在威脅(Lin, 2014, 2015), 是一種生態(tài)系統(tǒng)破壞型有害藻華(ecosystem disruptive algal bloom, EDAB)。亞歷山大藻則會(huì)通過(guò)產(chǎn)生麻痹性貝類毒素, 危害海產(chǎn)品等食品安全, 甚至造成人類中毒(周名江等, 2003; 李冬融等, 2014; 高巖等, 2016)。此外, 劇毒卡爾藻()、錐狀斯氏藻()等也是東海海域常見(jiàn)的有害藻華原因種(王紅霞等, 2011; 田媛等, 2020)。

東海的有害藻華受到水溫、環(huán)流及營(yíng)養(yǎng)鹽等多類環(huán)境因子的調(diào)控(周名江等, 2006; Zhou, 2008)675, 形成機(jī)理復(fù)雜, 預(yù)測(cè)預(yù)警困難。目前, 對(duì)原因種的檢測(cè)仍是有害藻華監(jiān)測(cè)和防控的主要途徑。藻種檢測(cè)可以通過(guò)顯微觀察、流式分析、色素檢測(cè)、DNA序列測(cè)定等途徑進(jìn)行(Scanlan, 2009; Al-Kandari, 2011; Zamor, 2012; Faria, 2014)。其中, 通過(guò)顯微鏡進(jìn)行藻種鑒定和計(jì)數(shù)的方法直觀、方便, 是藻華原因種檢測(cè)的傳統(tǒng)方法(孫軍等, 2002)。但是, 顯微觀察對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的專業(yè)能力要求高, 且樣品處理和觀察耗時(shí)費(fèi)力; 樣品固定過(guò)程容易造成藻細(xì)胞形態(tài)的改變, 影響藻種的鑒定和計(jì)數(shù)結(jié)果準(zhǔn)確性。流式分析也是藻類檢測(cè)的重要手段(Biegala, 2003), 流式細(xì)胞儀能夠通過(guò)細(xì)胞粒徑和光學(xué)特性, 對(duì)原綠球藻(spp.)和聚球藻(spp.)等進(jìn)行檢測(cè)(Chisholm, 1988; Jiao, 2002; 趙越等, 2019)。近年來(lái), 隨著流式成像技術(shù)快速發(fā)展, 流式影像儀(如FlowCam)開(kāi)始逐漸應(yīng)用于微藻的識(shí)別和計(jì)數(shù)。FlowCam設(shè)備可以通過(guò)高速攝影拍照捕捉樣品中的微粒, 獲取每個(gè)顆粒物的粒徑、體積、熒光參數(shù)等40多種信息(Otálora, 2021)4, 其研發(fā)的圖像分析軟件VisualSpreadsheet能夠?qū)π畔⑦M(jìn)行分類識(shí)別和特征篩選, 并與藻種庫(kù)中的目標(biāo)藻種信息進(jìn)行相似度分析(Buskey2006)690, 實(shí)現(xiàn)藻類的自動(dòng)識(shí)別(王雨等, 2010)。FlowCam可在一定程度上彌補(bǔ)傳統(tǒng)顯微觀察方法的不足, 實(shí)現(xiàn)樣品的高通量分析, 且樣品無(wú)需固定, 能夠最大程度保留細(xì)胞的原始形態(tài)特征(Trask, 1982; Olson, 1983; Yentsch, 1983), 可用于浮游生物種類鑒定和定量分析(Simon, 1994; Becker, 2002; Karnan, 2020), 在浮游生物功能群和有害藻華監(jiān)測(cè)研究中得到廣泛應(yīng)用(Crosbie, 2003; Dubelaar, 2004; Wong, 2017)。但對(duì)于形態(tài)特征不明顯的藻種, 應(yīng)用FlowCam進(jìn)行藻種檢測(cè)時(shí)還需要進(jìn)行圖像人工判讀并結(jié)合分子生物學(xué)手段進(jìn)行分析(Hansen, 2003; Bergholtz, 2006)。

近年來(lái), 應(yīng)用FlowCam開(kāi)展生態(tài)學(xué)研究逐漸受到關(guān)注(Camoying, 2016)305, 但是, 在中國(guó)近岸海域應(yīng)用FlowCam開(kāi)展的實(shí)際研究工作仍相對(duì)較少。本研究針對(duì)東海海域常見(jiàn)的甲藻藻華原因種米氏凱倫藻和東海原甲藻, 通過(guò)室內(nèi)實(shí)驗(yàn)測(cè)試了FlowCam對(duì)微藻計(jì)數(shù)結(jié)果的準(zhǔn)確性, 并嘗試應(yīng)用FlowCam對(duì)福建三沙海域的甲藻藻華過(guò)程進(jìn)行了現(xiàn)場(chǎng)觀測(cè)。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備

顯微鏡(Leica, 德國(guó)); FlowCam-8400 (Fluid Imaging Technologies, 美國(guó))。

1.2 實(shí)驗(yàn)藻種

實(shí)驗(yàn)所用的米氏凱倫藻、東海原甲藻、亞歷山大藻、劇毒卡爾藻和錐狀斯氏藻等藻種(表1), 以f/2-Si培養(yǎng)基培養(yǎng), 培養(yǎng)條件溫度為20 °C, 光照強(qiáng)度約100 μmol/(m2·s): 光暗為14 h:10 h。

表1 實(shí)驗(yàn)藻種信息

Tab.1 List of microalgae species used in the study

1.3 FlowCam計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性實(shí)驗(yàn)

以實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的米氏凱倫藻為對(duì)象, 通過(guò)與顯微鏡計(jì)數(shù)結(jié)果對(duì)比, 分析FlowCam對(duì)顆粒計(jì)數(shù)結(jié)果的準(zhǔn)確性。選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好的米氏凱倫藻(對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期), 通過(guò)稀釋獲得一系列不同密度的藻細(xì)胞樣品(10～30 000 000 cells/L), 每一樣品設(shè)置3個(gè)平行, 分別通過(guò)顯微鏡鏡檢(Uterm?hl, 1958)和FlowCam (Sieracki, 1998)分析獲得各樣品中的米氏凱倫藻細(xì)胞密度。其中顯微鏡定量檢測(cè)體積為0.1 mL, FlowCam檢測(cè)體積1 mL。根據(jù)目標(biāo)藻種細(xì)胞粒徑(15～20 μm), 在FlowCam檢測(cè)中采用了10倍物鏡, 流速設(shè)置為0.15 mL/min。應(yīng)用SPSS 19軟件, 對(duì)兩種方法的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行線性相關(guān)性分析, 并以配對(duì)樣品檢驗(yàn)方法分析兩種方法的測(cè)試結(jié)果是否存在顯著差異(任琳琳, 2013; Camoying, 2016)309。

1.4 FlowCam識(shí)別準(zhǔn)確性實(shí)驗(yàn)

為測(cè)試FlowCam對(duì)目標(biāo)藻種識(shí)別的準(zhǔn)確性, 以實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的米氏凱倫藻和東海原甲藻為對(duì)象, 評(píng)價(jià)了FlowCam對(duì)目標(biāo)藻種的準(zhǔn)確率和召回率。其中, 準(zhǔn)確率衡量檢索的精度(正確識(shí)別的目標(biāo)藻細(xì)胞數(shù)/識(shí)別的總細(xì)胞數(shù)×100%), 召回率衡量檢索的查全比例(正確識(shí)別的目標(biāo)藻細(xì)胞數(shù)/樣品中目標(biāo)藻細(xì)胞數(shù)×100%) (牟琪, 2014)。

選擇不同數(shù)量的米氏凱倫藻和東海原甲藻細(xì)胞(10、50、100、1 000和5 000個(gè)), 分別建立兩種微藻的影像庫(kù)。采用室內(nèi)培養(yǎng)的米氏凱倫藻、東海原甲藻、亞歷山大藻、劇毒卡爾藻和錐狀斯氏藻, 分別針對(duì)米氏凱倫藻和東海原甲藻制備了兩個(gè)不同優(yōu)勢(shì)度的混合藻種樣品(表2)。基于構(gòu)建的米氏凱倫藻和東海原甲藻影像庫(kù), 對(duì)混合藻種樣品中兩種目標(biāo)藻種進(jìn)行識(shí)別, 評(píng)估其識(shí)別的準(zhǔn)確性, 并探討影像庫(kù)建庫(kù)細(xì)胞數(shù)對(duì)藻種識(shí)別結(jié)果的影響。

表2 以米氏凱倫藻和東海原甲藻為對(duì)象的混合藻種樣品制備

Tab.2 Preparation of mixed-microalgae samples for identification of dinoflagellates Karenia mikimotoi and Prorocentrum donghaiense using FlowCam

為進(jìn)一步驗(yàn)證FlowCam對(duì)目標(biāo)藻種識(shí)別的準(zhǔn)確性, 選擇2018年福建近海一次東海原甲藻藻華期間采集的兩個(gè)樣品, 對(duì)比分析了不同來(lái)源、不同數(shù)目的東海原甲藻細(xì)胞影像庫(kù)(表3)對(duì)FlowCam識(shí)別準(zhǔn)確性的影響。

表3 用于甲藻藻華海水樣品中目標(biāo)藻種識(shí)別準(zhǔn)確性測(cè)試的東海原甲藻藻種來(lái)源和數(shù)量

Tab.3 Source and number of Prorocentrum donghaiense cells used for accuracy testing in identification of the targeted species in samples collected during a dinoflagellate red tide

1.5 FlowCam在福建三沙海域甲藻藻華監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用

2018年4月25日至5月28日期間, 應(yīng)用FlowCam對(duì)福建三沙近岸海域的甲藻藻華進(jìn)行了跟蹤研究?，F(xiàn)場(chǎng)共設(shè)置15個(gè)站位(圖1), 每間隔2～6天進(jìn)行一次采樣調(diào)查。在每個(gè)站位取10 L表層海水, 以孔徑10 μm的篩絹濃縮至50 mL, 用FlowCam分別檢測(cè)凱倫藻和東海原甲藻細(xì)胞密度, 每個(gè)樣品的檢測(cè)體積為1 mL。在每個(gè)站位取1 L表層海水, 用魯格試劑固定, 魯格試劑最終濃度為1.0%～1.5%, 用顯微鏡定量檢測(cè)凱倫藻和東海原甲藻密度。分析研究期間2種藻的豐度變化狀況, 用SPSS軟件分析兩種方法檢測(cè)結(jié)果的差異顯著性和線性相關(guān)性, 分析方法同1.3。

圖1 2018年福建三沙海域藻華跟蹤研究中采樣站位示意圖

2 結(jié)果

2.1 FlowCam的計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性

以米氏凱倫藻為對(duì)象, 參照顯微鏡定量檢測(cè)結(jié)果, 對(duì)FlowCam計(jì)數(shù)結(jié)果的準(zhǔn)確性進(jìn)行了分析和評(píng)估。結(jié)果表明, FlowCam計(jì)數(shù)結(jié)果與顯微鏡計(jì)數(shù)結(jié)果無(wú)顯著差異(>0.05), 且兩者之間具有極顯著的線性相關(guān)性(<0.01),2達(dá)到0.98(圖2)。當(dāng)采用的檢測(cè)體積為1 mL時(shí), FlowCam的檢出限理論上可以達(dá)到1 000 cells/L。當(dāng)野外樣品中藻細(xì)胞密度低時(shí), 可以通過(guò)加大檢測(cè)體積或濃縮樣品進(jìn)一步降低檢出限水平。

圖2 顯微鏡和FlowCam對(duì)室內(nèi)培養(yǎng)的米氏凱倫藻計(jì)數(shù)結(jié)果對(duì)比

2.2 FlowCam對(duì)米氏凱倫藻和東海原甲藻的識(shí)別準(zhǔn)確性

應(yīng)用室內(nèi)模擬的混合藻類樣品和野外采集的藻華區(qū)現(xiàn)場(chǎng)樣品, 分別以米氏凱倫藻和東海原甲藻建庫(kù), 評(píng)估了建庫(kù)細(xì)胞數(shù)目和來(lái)源對(duì)FlowCam目標(biāo)藻識(shí)別準(zhǔn)確性的影響。結(jié)果表明, 隨著建庫(kù)藻細(xì)胞數(shù)量的增加, FlowCam對(duì)樣品中兩種微藻的召回率升高, 而準(zhǔn)確率則有所下降(圖3, 4)。當(dāng)目標(biāo)藻種在浮游植物樣品中的優(yōu)勢(shì)度較低時(shí), 對(duì)目標(biāo)藻種的識(shí)別準(zhǔn)確率也會(huì)相應(yīng)下降。FlowCam對(duì)東海原甲藻的識(shí)別準(zhǔn)確率和召回率結(jié)果明顯好于米氏凱倫藻, 當(dāng)東海原甲藻的建庫(kù)細(xì)胞數(shù)目為100藻細(xì)胞時(shí), 對(duì)樣品中東海原甲藻的識(shí)別召回率即可達(dá)到最大值, 識(shí)別準(zhǔn)確率也基本保持穩(wěn)定; 而米氏凱倫藻建庫(kù)細(xì)胞數(shù)目達(dá)到5 000藻細(xì)胞時(shí), 對(duì)樣品中米氏凱倫藻的召回率才達(dá)到最大值, 而識(shí)別準(zhǔn)確率也相對(duì)較低。

圖3 FlowCam對(duì)兩個(gè)混合樣品中米氏凱倫藻識(shí)別的準(zhǔn)確率與召回率

注: a. 高優(yōu)勢(shì)度米氏凱倫藻樣品; b. 低優(yōu)勢(shì)度米氏凱倫藻樣品

圖4 FlowCam對(duì)兩個(gè)混合樣品中東海原甲藻識(shí)別的召回率與準(zhǔn)確率

注: a. 高優(yōu)勢(shì)度東海原甲藻樣品; b. 低優(yōu)勢(shì)度東海原甲藻樣品

應(yīng)用2018年福建三沙海域甲藻藻華過(guò)程中采集的兩個(gè)樣品, 對(duì)FlowCam自動(dòng)識(shí)別東海原甲藻的準(zhǔn)確性進(jìn)行了分析。結(jié)果表明, 當(dāng)建庫(kù)細(xì)胞數(shù)達(dá)到50個(gè)時(shí), 對(duì)東海原甲藻的識(shí)別召回率即可達(dá)到90%以上。相比于以室內(nèi)培養(yǎng)的東海原甲藻建立的影像庫(kù), 應(yīng)用野外樣品中東海原甲藻細(xì)胞建立藻種庫(kù)時(shí), 以10個(gè)藻細(xì)胞建立的影像庫(kù)即可達(dá)到較高的召回率(圖5)。

圖5 FlowCam對(duì)2018年福建三沙海域甲藻藻華期間兩個(gè)樣品中東海原甲藻的識(shí)別召回率與準(zhǔn)確率

注: a. 高優(yōu)勢(shì)度東海原甲藻樣品; b. 低優(yōu)勢(shì)度東海原甲藻樣品

2.3 應(yīng)用FlowCam對(duì)福建三沙海域甲藻藻華的跟蹤研究

在航次調(diào)查期間, 采取自動(dòng)識(shí)別輔以人工判讀方式, 用FlowCam對(duì)2018年4～5月期間福建三沙近岸海域一次甲藻藻華過(guò)程進(jìn)行了跟蹤研究, 獲得了海水中東海原甲藻和凱倫藻的影像數(shù)據(jù)(圖6)。由于無(wú)法通過(guò)藻種形態(tài)對(duì)米氏凱倫藻進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定, 野外樣品中獲得與米氏凱倫藻形態(tài)相似的藻種均籠統(tǒng)稱為凱倫藻。兩種藻華藻種的檢測(cè)結(jié)果如圖7、圖8所示。可以看出, 東海原甲藻豐度遠(yuǎn)高于凱倫藻, 藻細(xì)胞最高豐度超過(guò)106cells/L。FlowCam與顯微鏡對(duì)東海原甲藻的檢測(cè)結(jié)果無(wú)顯著差異(>0.5), 兩種檢測(cè)結(jié)果具有極顯著的線性相關(guān)性(<0.01),2為0.92(圖8)。凱倫藻密度一直處于較低水平, 僅在部分站位檢出, 最高豐度為120 cells/L(圖7)。

3 討論

流式影像技術(shù)是在顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的新型浮游植物檢測(cè)方法, 目前已發(fā)展成較為成熟的技術(shù)。傳統(tǒng)上, 浮游植物細(xì)胞主要由分類學(xué)家在顯微鏡下進(jìn)行鑒定和計(jì)數(shù)(Andersen, 2003), 一個(gè)樣品通常需要2～10 h, 甚至更長(zhǎng)時(shí)間(Karlson, 2010)14。FlowCam儀器采用流式影像技術(shù), 能夠快速檢測(cè)、處理更大體積的樣品。Steele等(2020)用配備4倍物鏡的FlowCam分析樣品時(shí), 檢測(cè)速度為1.7 mL/min, 本研究中使用10倍物鏡、流速0.15 mL/min, 檢測(cè)1 mL樣品需6 min左右。FlowCam不僅提高了浮游植物的檢測(cè)效率, 也具有較好的準(zhǔn)確性(侯建軍等, 2004; Hrycik, 2019)。此外, 用顯微鏡檢測(cè)方法分析浮游植物樣品時(shí), 常用甲醛、魯格試劑等對(duì)樣品進(jìn)行固定(方曉琪等, 2019), 存在破壞細(xì)胞形態(tài)的風(fēng)險(xiǎn)(Karlson, 2010)15。應(yīng)用FlowCam對(duì)浮游植物樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí), 無(wú)需對(duì)樣品進(jìn)行固定處理, 能夠更好地滿足浮游植物檢測(cè)時(shí)效性和準(zhǔn)確性的需求。獲取的圖像信息可以通過(guò)計(jì)算機(jī)長(zhǎng)期保存, 具有再現(xiàn)性優(yōu)勢(shì)(Hrycik, 2019)。

本研究嘗試應(yīng)用FlowCam, 對(duì)東海海域兩種甲藻藻華原因種米氏凱倫藻和東海原甲藻進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明, 通過(guò)顯微鏡和FlowCam對(duì)室內(nèi)培養(yǎng)的目標(biāo)藻種(米氏凱倫藻)進(jìn)行計(jì)數(shù), 兩者結(jié)果呈線性相關(guān), 且沒(méi)有顯著差異。應(yīng)用FlowCam和顯微鏡對(duì)野外樣品中的目標(biāo)藻種(東海原甲藻)計(jì)數(shù)結(jié)果同樣具有線性相關(guān)性, 但FlowCam計(jì)數(shù)結(jié)果相對(duì)偏低, 推測(cè)主要原因在于野外樣品中目標(biāo)藻種的不均勻分布, 以及樣品濃縮過(guò)程中的損失。與顯微鏡計(jì)數(shù)相比, FlowCam可以通過(guò)VisualSpreadsheet軟件自動(dòng)識(shí)別目標(biāo)藻種(Camoying, 2016)306, 大大提高了樣品的計(jì)數(shù)效率, 但識(shí)別準(zhǔn)確性仍然存在欠缺。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, FlowCam對(duì)藻種識(shí)別的召回率和準(zhǔn)確率與建庫(kù)策略有關(guān), 建庫(kù)細(xì)胞數(shù)增加會(huì)提高對(duì)目標(biāo)藻細(xì)胞的召回率, 但會(huì)降低識(shí)別的準(zhǔn)確率。由于FlowCam對(duì)樣品的計(jì)數(shù)效率很高, 而識(shí)別準(zhǔn)確性相對(duì)較差, 因此, 在實(shí)際樣品分析過(guò)程中, 可優(yōu)先選擇高召回率以減少對(duì)樣本中目標(biāo)藻細(xì)胞的遺漏, 再輔以人工判讀提高藻種識(shí)別的準(zhǔn)確性, 實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)藻種快速、準(zhǔn)確地識(shí)別和計(jì)數(shù)。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中可以看出, FlowCam對(duì)藻種的識(shí)別結(jié)果還與藻種形態(tài)特征有關(guān)(任琳琳, 2013)。與米氏凱倫藻相比, 東海原甲藻的形態(tài)特征更為明顯。因此, 當(dāng)東海原甲藻的建庫(kù)細(xì)胞數(shù)達(dá)到50個(gè)時(shí), FlowCam對(duì)東海原甲藻的召回率即可達(dá)到90%以上; 而米氏凱倫藻建庫(kù)細(xì)胞數(shù)在1 000個(gè)以上, 才能達(dá)到較高的召回率。當(dāng)采用野外樣品中的東海原甲藻建庫(kù)時(shí), 采用10個(gè)藻細(xì)胞即可達(dá)到較高的召回率。綜上, 為保障對(duì)目標(biāo)藻種的高召回率, 在具體工作中應(yīng)針對(duì)不同形態(tài)、不同狀態(tài)的藻種, 考慮構(gòu)建不同細(xì)胞數(shù)的影像庫(kù)。

圖6 2018年福建三沙海域甲藻藻華期間獲取的凱倫藻和東海原甲藻FlowCam影像圖

圖7 2018年福建三沙海域甲藻藻華過(guò)程中凱倫藻豐度變化狀況

圖8 2018年福建三沙海域甲藻藻華過(guò)程中FlowCam和顯微鏡檢測(cè)東海原甲藻細(xì)胞豐度對(duì)比

目前, FlowCam自帶的圖像分析軟件VisualSpreadsheet可以區(qū)分具有不同形態(tài)特征的浮游植物種類。但是, 受到圖像分辨率和數(shù)據(jù)分析方法等因素的限制, 對(duì)形態(tài)特征相似的浮游植物識(shí)別能力仍然有限(余肖翰等, 2013), 制約了對(duì)浮游植物的準(zhǔn)確分類和識(shí)別。利用FlowCam獲取的圖像, 可以通過(guò)針對(duì)性地研發(fā)圖像提取和處理方法, 進(jìn)一步提高浮游生物分類的準(zhǔn)確性(Kerr, 2020)。如Promdaen等(2014)提出了一種將藻類從圖像背景中分離出來(lái)的圖像分割方法, 可以解決藻類邊界不清晰、藻類鞭毛外觀透明、接觸污染物體等分割難點(diǎn), 用序列最小優(yōu)化算法(SMO)進(jìn)行分類, 準(zhǔn)確率可達(dá)97.22%。Otálora等(2021)3用FlowCam獲取了小球藻()和一種柵藻()的細(xì)胞圖像信息, 基于人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(ANN)進(jìn)行圖像分析, 可以實(shí)現(xiàn)對(duì)藻細(xì)胞的自動(dòng)識(shí)別。Sosik等(2007)開(kāi)發(fā)了一種基于圖像特征提取的方法, 通過(guò)組合大小、形狀、對(duì)稱性和紋理等圖像信息, 結(jié)合機(jī)器學(xué)習(xí)算法對(duì)浮游植樣品進(jìn)行分類。通過(guò)改進(jìn)的卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型(CNN)進(jìn)行藻類圖像分析和深度學(xué)習(xí)后, 對(duì)藻細(xì)胞分類準(zhǔn)確率達(dá)98%～99% (Pant, 2020; Yadav, 2020)。將FlowCam圖像獲取與先進(jìn)的圖像分類算法相結(jié)合, 有望進(jìn)一步提高對(duì)藻種的分類識(shí)別能力(孫曉霞等, 2014)。

FlowCam目前已在浮游植物和有害藻華研究中得到較為廣泛的應(yīng)用(See, 2005; Patil, 2015; Amadei Martínez, 2020)。依據(jù)國(guó)際海事組織(IMO)頒布的《國(guó)際船舶壓載水和沉積物控制與管理公約》標(biāo)準(zhǔn), Romero-Martínez等(2017)將FlowCam應(yīng)用于船舶壓載水中的浮游植物檢測(cè)。在美國(guó)弗羅里達(dá)近海, FlowCam也被成功應(yīng)用于短凱倫藻的監(jiān)測(cè), 提高了對(duì)藻華原因種的監(jiān)測(cè)效率(Buskey, 2006)685。我國(guó)東海海域是有害藻華高發(fā)區(qū), 針對(duì)東海浮游植物已開(kāi)展了大量的現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查和研究工作(陳楠生等, 2021)。東海原甲藻和米氏凱倫藻是該海域主要的有害藻華原因種, 兩類有害藻華的形成與海域營(yíng)養(yǎng)鹽、水溫等環(huán)境因素密切相關(guān)(周名江等, 2006; 丁光茂等, 2018; 鄒雙燕, 2018; 呂頌輝等, 2019; 文世勇等, 2019)676, 此外也受到黑潮分支等物理海洋學(xué)過(guò)程的調(diào)控(于仁成等, 2017)1181。春季是東海有害藻華的高發(fā)季, 東海原甲藻幾乎每年都會(huì)形成大規(guī)模藻華, 而米氏凱倫藻僅在個(gè)別年份形成。但是, 米氏凱倫藻藻華一旦形成, 就會(huì)造成巨大的危害。2003年5月底在福建連江海域發(fā)生米氏凱倫藻藻華(龍華等, 2005); 2012年5～6月, 福建近海多次發(fā)生米氏凱倫藻藻華, 累計(jì)面積超過(guò)323 km2, 經(jīng)濟(jì)損失20.11億元(鄧華等, 2016)。因此, 需要針對(duì)米氏凱倫藻和東海原甲藻等藻華原因種開(kāi)展針對(duì)性的監(jiān)測(cè)和預(yù)警(黃海燕等, 2016; 趙聰蛟等, 2020)。本研究利用FlowCam結(jié)合人工判讀方式, 在福建三沙海域航次調(diào)查過(guò)程中監(jiān)測(cè)到東海原甲藻藻華, 并對(duì)海水中東海原甲藻的細(xì)胞密度進(jìn)行了檢測(cè), 其結(jié)果與顯微鏡計(jì)數(shù)結(jié)果較為一致, 同時(shí)還檢測(cè)到低密度的米氏凱倫藻細(xì)胞。現(xiàn)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, FlowCam可以提高樣品處理效率, 有望在今后的米氏凱倫藻和東海原甲藻藻華監(jiān)測(cè)和預(yù)警中發(fā)揮更大作用。

4 結(jié)論

本研究以米氏凱倫藻和東海原甲藻為目標(biāo)藻種, 通過(guò)室內(nèi)實(shí)驗(yàn)測(cè)試了FlowCam的計(jì)數(shù)和識(shí)別準(zhǔn)確性, 并在福建三沙海域甲藻藻華過(guò)程中進(jìn)行了現(xiàn)場(chǎng)測(cè)試和應(yīng)用。研究結(jié)果表明, FlowCam計(jì)數(shù)結(jié)果準(zhǔn)確, 應(yīng)用其自動(dòng)識(shí)別功能, 可以實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)藻種的自動(dòng)識(shí)別和計(jì)數(shù), 能夠顯著提高對(duì)浮游植物樣品的檢測(cè)效率; 但目前FlowCam對(duì)藻種的識(shí)別準(zhǔn)確率低, 仍需結(jié)合人工判讀輔助, 需要研發(fā)新的圖像提取和分析方法, 進(jìn)一步提高檢測(cè)效率。目前在應(yīng)用FlowCam進(jìn)行目標(biāo)藻種識(shí)別時(shí), 其召回率和準(zhǔn)確率與建庫(kù)細(xì)胞的形態(tài)特征、數(shù)量、來(lái)源密切相關(guān), 需要針對(duì)不同的目標(biāo)藻種構(gòu)建不同大小的藻種庫(kù), 以提高召回率, 減少分析過(guò)程中對(duì)目標(biāo)藻細(xì)胞的遺漏。對(duì)2018年福建近海甲藻藻華的現(xiàn)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, FlowCam樣品處理效率高, 可有效應(yīng)用于有害藻華的現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè), 可望在今后監(jiān)測(cè)和預(yù)警中發(fā)揮更大作用。

致謝 本實(shí)驗(yàn)中所用的米氏凱倫藻和劇毒卡爾藻系由廈門(mén)大學(xué)王大志教授和自然資源部第二研究所陸斗定研究員提供, 謹(jǐn)致謝忱。感謝審稿人對(duì)本論文提出的建設(shè)性修改意見(jiàn)和建議。

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APPLICATION OF FLOWCAM IN THE STUDY OF A DINOFLAGELLATE BLOOM IN THE EAST CHINA SEA

HU Xiao-Kun1, 3, ZHAO Yue5, KONG Fan-Zhou1, 2, 4, ZHANG Qing-Chun1, 2, 4, YAN Bing6, YU Ren-Cheng1, 2, 3, 4

(1. CAS Key Laboratory of Marine Ecology and Environmental Sciences, Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 2. Key Laboratory for Marine Ecology and Environmental Science, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Qingdao 266237, China; 3. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China; 4. Center for Ocean Mega-Science, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 5.College of Ocean Science and Engineering, Shandong University of Science and Technology, Qingdao 266590, China; 6. College of Life Science and Technology, Jinan University, Guangzhou 510632, China)

Harmful algal blooms (HABs) pose significant threats to aquaculture, human health and marine environment, and have become a global issue of ecological disaster. Dinoflagellate blooms caused byandin the East China Sea occurred nearly every year after 2000. Due to the complicated mechanism of these blooms, monitoring of causative species became an effective means for early-warning of HABs. FlowCam is a type of new equipment based on microscopy and flow cytometry, which can analyze particles in the flowing medium. It can realize high-throughput analysis of phytoplankton samples, which can be applied in real-time in situ monitoring of HABs. Image databases of dinoflagellates.and.were established, and the accuracy and specificity of FlowCam in detecting the two species were tested. According to the results, FlowCam is accurate in cell-counting, and there is no significant difference from the results by microscope observation. FlowCam can automatically identify the target species in mixed algal samples. A large image database will increase the recall of.and.cells, while decrease the precision in identification of the target species. The accurate identification and counting, therefore, still need the assistance of artificial interpretation of results. FlowCam was applied to detect the two target species during a bloom of dinoflagellates in the coastal water of Fujian province from April to June in 2018. Low abundance of Kareniacean cells (<120 cells/L) was detected, and the abundance of.determined by FlowCam was consisted with microscope observation. FlowCam can be effectively used in field monitoring of HABs, and it is expected to play a greater role in the HABs monitoring and early warning in the future.

FlowCam;;; harmful algal bloom; East China Sea

*科技部重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目, 2017YFC1404304號(hào); 中國(guó)科學(xué)院地球大數(shù)據(jù)戰(zhàn)略先導(dǎo)專項(xiàng), XDA19060203號(hào)。胡曉坤, 博士研究生, E-mail: huxiaokun0211@163.com

于仁成, 博士生導(dǎo)師, 研究員, E-mail: rcyu@qdio.ac.cn

2021-07-31,

2021-10-26

X55

10.11693/hyhz20210700171