硅膠柱層析純化利普司他汀工藝研究

劉俊果，陳 敏，張 弘，吳立強(qiáng)

(1.河北科技大學(xué)食品與生物學(xué)院，河北 石家莊 050018；2.華北制藥股份有限公司，河北 石家莊 050015；3.保定九孚生化有限公司，河北 保定 072150)

利普司他汀(結(jié)構(gòu)式見圖1)是由毒三素鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)生的一種次級(jí)代謝產(chǎn)物，具有胰脂肪酶抑制活性[1-2]，能有效減少脂肪的分解和吸收。利普司他汀的四氫衍生物奧利司他(Orlistat) 已被羅氏公司成功開發(fā)為減肥藥賽尼可[3-4]，是目前唯一一個(gè)作為非中樞神經(jīng)系統(tǒng)作用而上市的治療肥胖癥的減肥藥物[5-6]，在促進(jìn)肥胖患者體重降低的同時(shí)能有效改善由肥胖癥帶來的心血管等疾病的困擾，且安全性和耐受性良好[7]。

圖1 利普司他汀的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structural formula of Lipstatin

硅膠柱層析法分離效果好，操作簡(jiǎn)單，易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化，是目前分離純化一些生化產(chǎn)物的主流方法[8-9]，如白藜蘆醇、平貝總堿等。作者從毒三素鏈霉菌的發(fā)酵液中獲得利普司他汀粗品，采用硅膠柱層析法對(duì)利普司他汀相品進(jìn)行分離純化，考察洗脫劑配比、洗脫體積、洗脫流速、載樣量等參數(shù)[10-11]對(duì)利普司他汀純度和回收率的影響，以期為利普司他汀的分離純化研究提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

利普司他汀粗品(色譜純度66.917%)，自制。

正庚烷、丙酮，分析純，天津永大化學(xué)試劑有限公司；乙腈，色譜純，F(xiàn)isher Chemical；甲酸，色譜純，鵬發(fā)化工有限公司；蒸餾水，自制。

LC-PDA型高效液相色譜儀，島津企業(yè)管理(中國(guó))有限公司；KQ-250B型超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；玻璃層析柱(Φ45 mm×200 mm)。

1.2 濕法裝柱

硅膠活化：取60 g硅膠(120目)，于120 ℃烘箱中干燥0.5 h，加入正庚烷充分?jǐn)嚢杈鶆?，常溫下浸? h，備用。

裝柱和平衡：在層析柱內(nèi)加入高約 100 mm的正庚烷，打開閥門使之緩慢流出，充分潤(rùn)洗柱子；將活化好的硅膠攪拌均勻，超聲10 min，沿玻璃棒一次性轉(zhuǎn)入層析柱內(nèi)，自然沉降，并用橡膠錘輕敲柱壁，趕走氣泡，裝實(shí)硅膠；在層析柱上層塞一團(tuán)脫脂棉，防止上樣時(shí)沖壞硅膠表面；用正庚烷淋洗至柱平衡。

1.3 硅膠柱層析純化

稱取一定量的利普司他汀粗品，用無水正庚烷溶解，配制成濃度為250 g·L-1的樣品溶液，均勻加入層析柱中，加入洗脫劑進(jìn)行柱層析，收集洗脫液；60 ℃下減壓蒸餾濃縮回收洗脫劑，濃縮物用甲醇定容，采用HPLC法測(cè)定洗脫液中利普司他汀的純度及回收率。分別考察洗脫劑配比、洗脫體積、洗脫流速及載樣量對(duì)利普司他汀的純度及回收率的影響。

2 結(jié)果與討論

2.1 利普司他汀粗品除油相后的雜質(zhì)分析

利普司他汀粗品用乙腈除油相后蒸干溶劑，溶解并過濾后進(jìn)行HPLC分析，結(jié)果如圖2所示。

圖2 利普司他汀粗品除油相后的HPLC圖譜Fig.2 HPLC spectrum of crude Lipstatin after oil phase removal

由圖2可知，利普司他汀是極性較弱的物質(zhì)，雜質(zhì)1#～9#先于利普司他汀主峰出峰，說明其極性弱于利普司他汀；雜質(zhì)10#～12#后于利普司他汀主峰出峰，說明其極性強(qiáng)于利普司他汀。雜質(zhì)1#～12#的相對(duì)保留時(shí)間分別為0.24、0.28、0.40、0.50、0.69、0.71、0.75、0.82、0.95、1.10、1.20、1.50，含量分別為1.221%、1.383%、1.252%、1.320%、0.977%、1.704%、14.989%、1.271%、0.578%、0.055%、2.467%、0.807%。利普司他汀粗品用乙腈除油相后的純度為66.917%，即為硅膠柱層析上樣的純度。

2.2 洗脫劑配比的確定

根據(jù)利普司他汀的極性、溶劑沸點(diǎn)、后續(xù)溶劑回收等，選取丙酮-正庚烷作為洗脫劑。用1 BV正庚烷平衡層析柱，然后按3%的載樣量(以硅膠質(zhì)量計(jì)，下同)慢慢且均勻加入樣品溶液，上樣結(jié)束后分別用6 BV的5%丙酮-正庚烷、10%丙酮-正庚烷、15%丙酮-正庚烷、20%丙酮-正庚烷、30%丙酮-正庚烷洗脫，洗脫流速為1 BV·h-1，收集洗脫液，采用HPLC法測(cè)定洗脫液中利普司他汀的純度及回收率，結(jié)果如圖3所示。

圖3 洗脫劑配比對(duì)利普司他汀層析效果的影響Fig.3 Effect of eluent ratio on chromatography effect of Lipstatin

由圖3可知，以5%丙酮-正庚烷、10%丙酮-正庚烷為洗脫劑時(shí)，洗脫液中利普司他汀的純度和回收率均較低，大部分利普司他汀吸附于硅膠上，沒有被完全洗脫下來；以15%丙酮-正庚烷為洗脫劑時(shí)，利普司他汀純度為80.358%，回收率為81.88%；繼續(xù)增加丙酮比例，利普司他汀的純度逐漸降低，回收率逐漸升高，雖然以30%丙酮-正庚烷為洗脫劑時(shí)，利普司他汀回收率高達(dá)92.00%，但更多的雜質(zhì)也隨之被洗脫下來，導(dǎo)致純度僅為66.266%。綜合考慮，選擇15%丙酮-正庚烷洗脫利普司他汀組分。

2.3 洗脫體積及洗脫曲線

由2.1可知利普司他汀粗品除油相后有弱極性雜質(zhì)存在，根據(jù)2.2洗脫結(jié)果，可先分別用1 BV的5%丙酮-正庚烷、10%丙酮-正庚烷洗脫非極性及弱極性雜質(zhì)；然后用7 BV的15%丙酮-正庚烷洗脫硅膠柱上的利普司他汀組分，直至把大部分利普司他汀洗脫下來；最后用2 BV的30%丙酮-正庚烷洗脫強(qiáng)極性雜質(zhì)。按2.2條件上樣，按上述程序梯度洗脫，洗脫流速為1 BV·h-1，然后按1 BV 1個(gè)餾分分段收集洗脫液，采用HPLC法測(cè)定洗脫液中利普司他汀的純度及回收率，洗脫曲線如圖4所示。

圖4 利普司他汀的洗脫曲線Fig.4 Elution curve of Lipstatin

由圖4可知，餾分1和2洗脫出來的大部分是非極性或弱極性雜質(zhì)，硅膠上依舊吸附大量的利普司他汀；餾分3洗脫出極少量的利普司他汀，為洗脫過渡段；餾分4將部分利普司他汀洗脫下來；餾分5、6的洗脫量最大，將大部分利普司他汀洗脫下來；餾分7～9的洗脫量減少，只將殘留的利普司他汀洗脫下來。餾分4～8中利普司他汀的純度及回收率呈先升高后降低的趨勢(shì)，且純度較高，說明利普司他汀主要是由15%丙酮-正庚烷洗脫劑洗脫下來的；餾分9～11中利普司他汀的純度及回收率迅速降低，說明層析柱中硅膠吸附的利普司他汀絕大部分已經(jīng)被洗脫下來，后續(xù)主要是由30%丙酮-正庚烷洗脫劑洗脫極性較強(qiáng)的雜質(zhì)。表明，上述梯度洗脫程序能較好地分離利普司他汀。在餾分接收過程中，將餾分 1～3合并，為弱極性組分段；餾分4～8合并，為利普司他汀組分段；餾分9～11合并，為較強(qiáng)極性組分段。

2.4 洗脫流速的確定

按2.3洗脫條件，保持其它條件不變，分別以洗脫流速0.5 BV·h-1、0.75 BV·h-1、1.0 BV·h-1、1.5 BV·h-1洗脫，分段收集，合并餾分4～8，采用HPLC法測(cè)定洗脫液中利普司他汀的純度及回收率，結(jié)果如圖5所示。

圖5 洗脫流速對(duì)利普司他汀純度及回收率的影響Fig.5 Effect of elution flow rate on purity and recovery of Lipstatin

由圖5可知，洗脫流速為0.5 BV·h-1時(shí)，利普司他汀的純度及回收率均較低，且分離時(shí)間較長(zhǎng)，分離效果較差；而洗脫流速為1.5 BV·h-1時(shí)，由于流速過快使兩相間的濃度難以分配平衡，分離效果也不理想；雖然洗脫流速為0.75 BV·h-1、1.0 BV·h-1時(shí)，純度相差不大，但1.0 BV·h-1的洗脫流速可能較快，導(dǎo)致洗脫量較少，回收率較低。綜合考慮，選擇洗脫流速為0.75 BV·h-1。

2.5 載樣量的確定

在硅膠柱層析分離的工業(yè)生產(chǎn)中，在保證純化效果的基礎(chǔ)上一般選用最大的載樣量。分別選用1%、3%、5%、10%的載樣量，洗脫流速為0.75 BV·h-1，其它條件不變，采用HPLC法測(cè)定洗脫液中利普司他汀的純度及回收率，結(jié)果如圖6所示。

由圖6可知，載樣量為1%時(shí)，利普司他汀的純度及回收率均較低，且上樣量過低造成硅膠及洗脫劑的浪費(fèi)；載樣量為3%、5%時(shí)，能夠較好地分離純化利普司他汀，但與3%載樣量相比，5%載樣量時(shí)的純度較低；而載樣量為10%時(shí)，由于超出了硅膠的負(fù)荷量，不能將大部分利普司他汀洗脫下來，導(dǎo)致純度及回收率均較低。綜合考慮，選擇載樣量為3%。

圖6 載樣量對(duì)利普司他汀純度及回收率的影響Fig.6 Effect of loading amount on purity and recovery of Lipstatin

2.6 硅膠柱層析純化前后的雜質(zhì)分析

將2.3中收集的餾分4～8合并，過濾后進(jìn)行HPLC分析，結(jié)果如圖7所示。

圖7 硅膠柱層析純化后利普司他汀的HPLC圖譜Fig.7 HPLC spectrum of Lipstatin purified by silica gel column chromatography

由圖7可知，雜質(zhì)1#、2#、3#、4#、5#、7#、8#、9#、11#、12#的相對(duì)保留時(shí)間分別為0.24、0.28、0.40、0.50、0.69、0.75、0.82、0.95、1.20、1.50，含量分別為0.191%、0.163%、1.202%、0.298%、2.020%、4.357%、1.546%、0.578%、0.239%、0.772%。

利普司他汀屬于酯類物質(zhì)，通過硅膠柱層析法可去除微生物代謝過程中產(chǎn)生的水溶性和脂溶性色素。與硅膠柱層析前利普司他汀除油相后的HPLC圖譜相比較，經(jīng)硅膠柱層析純化后，雜質(zhì)1#、2#、3#、4#、7#、9#能部分去除，雜質(zhì)5#、8#有所增加，雜質(zhì)6#、10#能完全去除，除雜效果顯著，利普司他汀純度達(dá)到80.499%。

3 結(jié)論

采用硅膠柱層析法對(duì)利普司他汀粗品進(jìn)行分離純化，確定最佳純化工藝條件如下：以120目硅膠為固定相，依次用1 BV 5%丙酮-正庚烷、1 BV 10%丙酮-正庚烷、7 BV 15%丙酮-正庚烷、2 BV 30%丙酮-正庚烷梯度洗脫，洗脫流速為0.75 BV·h-1，載樣量為3%，收集7 BV 15%丙酮-正庚烷的洗脫液。在此條件下，利普司他汀純度可達(dá)80.499%。該工藝除雜效果明顯，有利于后續(xù)工序分離純化得到高純度的利普司他汀。