陳 勤，劉美佳，劉迪秋，曲 媛，崔秀明，葛 鋒,*

(1.昆明理工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650500；2.云南省三七資源可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500)

珠子參()為五加科人參屬藥用植物，具有補(bǔ)肺養(yǎng)陰、祛瘀止痛、止血的作用，是重要的常用中藥材，為歷版《中國(guó)藥典》收錄。三萜皂苷是珠子參的主要活性成分，目前已從珠子參中分離出的40多種皂苷，分為達(dá)瑪烷型(人參皂苷Rb1、Re、Rd等)和齊墩果酸型(竹節(jié)參皂苷Ⅳ和Ⅳa等)兩個(gè)大類。人參屬的大部分藥材，如人參、三七、西洋參等主要含達(dá)瑪烷型皂苷，而珠子參與其他人參屬植物在三萜皂苷成分方面有顯著差異，其主要含齊墩果烷型皂苷，使得珠子參具有特殊的臨床應(yīng)用和獨(dú)特價(jià)值。因此，探討珠子參皂苷的生物合成途徑，以及開展皂苷合成的調(diào)控研究對(duì)豐富人參屬植物三萜生物合成的認(rèn)識(shí)具有重要意義。

已有研究表明，在植物次生代謝調(diào)控過程中，與單一關(guān)鍵酶的影響相比，雙酶協(xié)同調(diào)控的效果更好，譬如鯊烯合酶基因()與羥甲基戊二酰輔酶A還原酶基因()在三七中同時(shí)過表達(dá)，三七皂苷的合成量比單獨(dú)過表達(dá)更多；在靈芝中，鯊烯環(huán)氧酶基因()和共表達(dá)比和單獨(dú)過表達(dá)更能促進(jìn)靈芝酸的產(chǎn)生。人參屬藥用皂苷為三萜皂苷，主要通過甲羥戊酸(MVA)途徑合成，參與三萜皂苷骨架形成的法尼基焦磷酸合成酶(FPS)是三萜皂苷生物合成的關(guān)鍵酶之一。此外，齊墩果烷型皂苷是珠子參的主要生物活性成分，齊墩果烷型皂苷合成支路的第一個(gè)關(guān)鍵酶——-香樹脂醇合酶(-AS)可能會(huì)顯著影響PJS的合成。研究表明，珠子參-基因(-)在水稻中表達(dá)，可使水稻合成齊墩果酸；在人參中，通過RNA干擾下調(diào)-基因表達(dá)，可導(dǎo)致齊墩果烷型皂苷含量減少，達(dá)瑪烷型皂苷含量增加。這些結(jié)果說明，調(diào)控-的表達(dá)可以有效影響齊墩果烷型皂苷的生物合成。本研究在珠子參細(xì)胞中成功實(shí)現(xiàn)和-基因的同時(shí)過表達(dá)，以探討三萜骨架形成關(guān)鍵酶基因協(xié)同皂苷合成分支重要基因調(diào)控三萜皂苷合成的有效性和可行性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

從云南省麗江市玉龍縣獲取珠子參藥材，經(jīng)云南大學(xué)虞泓教授鑒定為五加科人參屬珠子參()。取珠子參藥材根部為外植體，誘導(dǎo)愈傷組織，愈傷組織在含有2.0 mg·L2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)和1.0 mg·L激動(dòng)素(KT)的MS瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)，每45 d傳代一次。皂苷標(biāo)準(zhǔn)化合物來自國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)樣品信息中心，其他化學(xué)品購(gòu)于生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 過表達(dá)載體的構(gòu)建

通過異硫氰酸胍法提取珠子參總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。(GenBank登錄號(hào)KP684141)和-(GenBank登錄號(hào)KP658156)通過特異性引物(表1)擴(kuò)增。-的RT-PCR如下：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，56 ℃/54 ℃ 30 s，72 ℃ 70 s，32個(gè)循環(huán)。72 ℃延伸7 min。擴(kuò)增片段，經(jīng)Ⅰ和Ⅰ酶切后插入pCAMBIA2300s，構(gòu)建重組載體pCAMBIA2300s-。同樣，-S由Ⅰ和Ⅰ酶切后以相同方式構(gòu)建pCAMBIA2300s--重組載體。通過凍融法將分別具有卡那霉素和潮霉素抗性的過表達(dá)載體pCAMBIA2300s-和pCAMBIA1300s--轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細(xì)胞。

1.3 PjFPS轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系與PjFPS/β-AS轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的建立

參照文獻(xiàn)[15]的方法，進(jìn)行珠子參細(xì)胞的遺傳轉(zhuǎn)化。選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好(細(xì)胞無顆粒狀且呈現(xiàn)淡黃色)的珠子參細(xì)胞轉(zhuǎn)接于含有40 mg·L乙酰丁香酮的MS預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基上，并置于25 ℃暗培養(yǎng)3 d。隨后，將預(yù)培養(yǎng)3 d的珠子參愈傷組織細(xì)胞完全浸沒于活化的含有重組質(zhì)粒pCAMBIA2300S-的LBA4404農(nóng)桿菌菌液中，于25 ℃、110 r·min振蕩培養(yǎng)20 min。振蕩培養(yǎng)結(jié)束后，將珠子參細(xì)胞轉(zhuǎn)接至含有40 mg·L乙酰丁香酮的MS共培養(yǎng)基上，于25 ℃黑暗條件下共培養(yǎng)3 d。共培養(yǎng)結(jié)束后，用含有400 mg·L頭孢霉素的無菌水清洗5～6次，以充分去除農(nóng)桿菌。清洗結(jié)束后，用無菌濾紙吸干珠子參愈傷組織細(xì)胞表面的液體。將珠子參細(xì)胞轉(zhuǎn)接至含有400 mg·L頭孢霉素的MS除菌培養(yǎng)基上，放置于25 ℃黑暗條件下除菌培養(yǎng)15 d。培養(yǎng)結(jié)束后，將珠子參愈傷組織細(xì)胞轉(zhuǎn)接至含有50 mg·L硫酸卡那霉素和25 mg·L潮霉素的MS瓊脂培養(yǎng)基上選擇培養(yǎng)上(開始記錄生長(zhǎng)時(shí)間)，可以得到穩(wěn)定過表達(dá)基因的細(xì)胞系。再通過相同的方法將重組質(zhì)粒pCAMBIA1300s--轉(zhuǎn)入已過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系中，細(xì)胞系在含有50 mg·L硫酸卡那霉素和25 mg·L潮霉素的MS瓊脂培養(yǎng)基上選擇培養(yǎng)后(開始記錄生長(zhǎng)時(shí)間)，得到穩(wěn)定過表達(dá)-基因的細(xì)胞系。

采用基因組PCR技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性細(xì)胞系。采用CTAB法提取生長(zhǎng)了35 d左右的珠子參細(xì)胞基因組DNA。用轉(zhuǎn)基因細(xì)胞轉(zhuǎn)移DNA(T-DNA)區(qū)的卡那霉素抗性基因(II)和潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(II)檢測(cè)陽(yáng)性細(xì)胞系，所用引物見表1。

表1 PCR引物Table 1 Primers used for PCR

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到35 d時(shí)，通過qRT-PCR檢測(cè)關(guān)鍵酶基因(-、、、、和)的轉(zhuǎn)錄水平。18(GenBank登錄號(hào)D85171)序列作為內(nèi)參基因，所用引物見表2。反應(yīng)程序：95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣重復(fù)3次。用2法計(jì)算不同細(xì)胞中基因相對(duì)表達(dá)水平。

表2 qRT-PCR引物Table 2 Primers used for qRT-PCR

1.5 轉(zhuǎn)基因珠子參細(xì)胞酶活性測(cè)定

為了研究轉(zhuǎn)基因與未轉(zhuǎn)基因的珠子參細(xì)胞系中關(guān)鍵酶FPS和-AS活性的變化情況，對(duì)FPS和-AS活性進(jìn)行了測(cè)定。酶活性測(cè)定方法如下：取1 g生長(zhǎng)了35 d左右新鮮愈傷組織加入2 mL BufferA 進(jìn)行研磨，BufferA由0.1mol·L蔗糖、0.05 mol·L氯化鈉、0.04 mol·L磷酸二氫鉀、0.03 mol·LEDTA鈉鹽組成，pH 值7.2。在4 ℃、12 000×離心2次，每次離心15 min，棄上清，沉淀加入500 μL BufferB和50%甘油，手動(dòng)勻漿，37 ℃溫浴60 min，得到含有可溶性PjFPS和β-AS的蛋白溶液；Buffer B由0.1 mol·L蔗糖、0.05 mol·L氯化鈉、0.04 mol·L磷酸二氫鉀、0.03 mol·LEDTA鈉鹽、0.02 mol·L二硫蘇糖醇(DTT)構(gòu)成，pH值7.2。用考馬斯亮藍(lán)法分別測(cè)定PjFPS和β-AS蛋白的濃度。將上述蛋白進(jìn)行如下操作：890 μL反應(yīng)緩沖液，100 μL NADPH溶液，10 μL蛋白提取液(0.2 mg·L)，37 ℃溫浴20 min后，隨后加入底物以啟動(dòng)酶催化反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間60 min，用紫外分光光度計(jì)在340 nm處測(cè)定吸光度。根據(jù)以下公式計(jì)算FPS和β-AS活性，酶活性(μmol·min·mg)=(-)/6.22×0.20×60。

1.6 總?cè)圃碥盏亩糠治?/h3>

取不同濃度的珠子參總皂苷溶液與香草醛-冰乙酸和高氯酸溶液進(jìn)行反應(yīng)，測(cè)定不同濃度珠子參皂苷標(biāo)品在550 nm的吸光度，以吸光度為橫橫坐標(biāo)()，珠子參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品濃度為縱坐標(biāo)()制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取20 g生長(zhǎng)60 d左右的新鮮珠子參細(xì)胞在55 ℃干燥至恒重。用體積分?jǐn)?shù)70%甲醇超聲后離心，蒸發(fā)甲醇，之后將提取物溶解于10 mL蒸餾水中，用相同體積的水飽和正丁醇再次抽提，蒸發(fā)正丁醇，得到總皂苷。將0.1 g珠子參總皂苷溶于10 mL甲醇，加入顯色劑香草醛-高氯酸測(cè)定總皂苷含量，在550 nm處測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線定量。

1.7 單體皂苷的HPLC分析

標(biāo)準(zhǔn)曲線制作。以Rd標(biāo)準(zhǔn)曲線為例，將Rd溶解于甲醇，配制成1 mg·mL溶液，取不同體積(2、4、6、8、10、15 μL)的溶液進(jìn)行HPLC檢測(cè)，以峰面積為橫坐標(biāo)()，濃度為縱坐標(biāo)()制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

采用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定單體皂苷(人參皂苷Rb1和Rd，竹節(jié)參皂苷IV和IVa)的含量。色譜柱為Waters-XTerra-MS-C18(5μm，250mm×4.6mm，USA)，流動(dòng)相為0.05%磷酸水溶液和乙腈。梯度洗脫：0—20 min，20%乙腈；20—30 min，20%～35%乙腈；30—40 min，35%乙腈；40—50 min，35%～40%乙腈；50—60 min，40%～100%乙腈。流速為1.0 mL·min，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm。使用標(biāo)準(zhǔn)曲線用于定量分析。將1.6節(jié)制得的珠子參細(xì)胞系總皂苷溶液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后，采用上述高效液相色譜條件測(cè)定珠子參細(xì)胞中重要單體皂苷含量。

1.8 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。采用檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，<0.05表示對(duì)照組和轉(zhuǎn)基因細(xì)胞之間差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 PjFPS和Pjβ-AS在珠子參中的表達(dá)

我們前期研究已經(jīng)獲得了過表達(dá)基因的珠子參細(xì)胞系，以該細(xì)胞系為基礎(chǔ)，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)了-基因的過表達(dá)，獲得同時(shí)過表達(dá)-雙基因的細(xì)胞系。通過擴(kuò)增位于載體T-DNA區(qū)的II和II抗性基因，篩選出4株-轉(zhuǎn)基因細(xì)胞(T1、T2、T3和T4)(圖1)。以上述T1～T4株系的cDNA為模板進(jìn)行和-基因相對(duì)表達(dá)量的分析，結(jié)果表明，與未轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系相比，4株陽(yáng)性細(xì)胞系中和-基因的相對(duì)表達(dá)量均有一定程度的提高(圖2)，其中，T3株系和T4株系的和-基因相對(duì)表達(dá)量增加最為顯著，基因相對(duì)表達(dá)量最高為對(duì)照組的8倍左右，而-基因相對(duì)表達(dá)量最高為對(duì)照組的10倍左右。此外，在和-基因過表達(dá)細(xì)胞中，皂苷合成主代謝流和下游分支代謝流相關(guān)的其他關(guān)鍵酶基因(、、和)的表達(dá)量也出現(xiàn)了不同程度提高(圖2)。

2.2 PjFPS和Pjβ-AS活性分析

A，nptⅡ基因的PCR結(jié)果；B，hptⅡ基因的PCR結(jié)果；M，DL2000 DNA marker；1，對(duì)照組細(xì)胞；2，攜帶hptⅡ基因空載的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系；3～6，PjFPS/β-AS轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。A，PCR result of nptⅡ;B，PCR result of hptⅡ;M，DL2000 DNA marker;1，Cell lines of control;2，Transgenic cell lines containing empty vector of hptⅡ gene;3-6，PjFPS/β-AS-transgenic cells.圖1 轉(zhuǎn)基因珠子參細(xì)胞中nptⅡ和hptⅡ的PCR分析Fig.1 PCR analysis of nptⅡ and hpt Ⅱ in transgenic P. japonicus cells

FPS，法尼基焦磷酸合成酶基因；SS，鯊烯合酶基因；β-AS，β-香樹脂醇合成酶基因；HMGR，3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶基因；SE，鯊烯環(huán)氧化酶基因；DS，達(dá)瑪烯二醇合成酶基因。WT，對(duì)照組細(xì)胞系；T1、T2、T3和T4，PjFPS/β-AS過表達(dá)細(xì)胞系；T5，轉(zhuǎn)空載體轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。*和**分別表示與對(duì)照組相比在P<0.05和P<0.01水平差異顯著。下同。FPS，F(xiàn)arnesyl pyrophosphate synthase gene;SS，squalene synthase gene;β-AS，β-amyrin synthase gene;HMGR，3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A reductase gene;SE，squalene cyclooxygenase gene;DS，damacendiol synthase gene.WT，wild-type cell line;T1，T2，T3 and T4，four PjFPS/β-AS overexpression cell lines;T5，trans-empty vector transgenic cell line.* and ** meant significant differences between control (non-transgenic cells)and transgenic cell lines at the level of P<0.05 andP<0.01.The same as below.圖2 轉(zhuǎn)PjFPS/β-AS珠子參細(xì)胞關(guān)鍵酶基因的相對(duì)表達(dá)水平Fig.2 Relative expression levels of key enzyme genes inP. japonicus cells

單獨(dú)過表達(dá)和-同時(shí)過表達(dá)的珠子參細(xì)胞株系生長(zhǎng)到第35天，進(jìn)行PjFPS和Pjβ-AS活性測(cè)定，結(jié)果見圖3。僅過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因珠子參細(xì)胞中，PjFPS活性是對(duì)照組珠子參細(xì)胞株系的2～3倍(圖3-A)，各陽(yáng)性細(xì)胞系PjFPS活性的變化與基因表達(dá)的變化趨勢(shì)基本吻合。與對(duì)照組細(xì)胞系和轉(zhuǎn)空載體的細(xì)胞系相比，-同時(shí)過表達(dá)的陽(yáng)性細(xì)胞系中PjFPS和Pjβ-AS活性均有一定程度的提高，其中，T3細(xì)胞系的PjFPS活性是對(duì)照組的3倍(圖3-B)，Pjβ-AS活性是對(duì)照組的7倍(圖3-C)。綜合和-基因的表達(dá)水平和酶活性，說明目標(biāo)關(guān)鍵酶基因的轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平都獲得了預(yù)期結(jié)果，成功在珠子參細(xì)胞中提高了皂苷合成關(guān)鍵酶PjFPS和Pjβ-AS的表達(dá)水平。

WT，對(duì)照組細(xì)胞系；F1、F2、F3和F4，PjFPS轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系；F5，轉(zhuǎn)空載體細(xì)胞系。下同。WT，Wild-type cell line;F1，F(xiàn)2，F(xiàn)3 and F4，PjFPS transgenic cell lines;F5，Trans-empty vector cell lines.The same as below.圖3 珠子參細(xì)胞系中FPS和β-AS活性Fig.3 Activities of FPS and β-AS in P. japonicus cell lines

2.3 PjFPS和Pjβ-AS過表達(dá)促進(jìn)珠子參總皂苷的合成

單獨(dú)過表達(dá)的珠子參細(xì)胞，其三萜皂苷的生物合成量明顯提高，部分細(xì)胞系中PJS含量是對(duì)照組的2倍(圖4-A)。此外，同時(shí)過表達(dá)和-基因的細(xì)胞中，三萜皂苷的生物合成過程得到了更為顯著的增強(qiáng)，其PJS含量明顯高于單獨(dú)過表達(dá)的細(xì)胞系，是單獨(dú)過表達(dá)細(xì)胞系的1.5倍；而與WT細(xì)胞系相比，PJS含量是對(duì)照組的2.5倍。說明在珠子參細(xì)胞中同時(shí)過表達(dá)和-基因可以更有效地促進(jìn)珠子參皂苷的合成，其調(diào)控皂苷合成的效果比單獨(dú)轉(zhuǎn)基因的效果更佳，說明-確實(shí)是PJS合成途徑的重要關(guān)鍵酶基因，對(duì)齊墩果烷型皂苷的合成起到了剛性調(diào)節(jié)。

圖4 過表達(dá)皂苷合成關(guān)鍵酶基因珠子參細(xì)胞的總皂苷含量Fig.4 Content of total saponins in transgenic P. japonicus cells

2.4 PjFPS和Pjβ-AS過表達(dá)促進(jìn)了珠子參細(xì)胞單體皂苷的生物合成

珠子參中具有代表性的單體皂苷Rd、Rb1、竹節(jié)參皂苷Ⅳ和Ⅳa的含量在所有轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系中均有所增加，包括單獨(dú)過表達(dá)或-同時(shí)過表達(dá)的細(xì)胞(圖5)。在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系中，達(dá)瑪烷型和齊墩果烷型皂苷的含量均高于WT細(xì)胞系，F(xiàn)4中Rd和Rb1的含量分別約為WT細(xì)胞系的2.4倍和2.0倍。在-轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中，竹節(jié)參皂苷Ⅳ和Ⅳa的含量顯著提高，而達(dá)瑪烷型皂苷含量低于單獨(dú)過表達(dá)的細(xì)胞，其最大含量分別是對(duì)照組細(xì)胞的2.2倍和2.0倍。這些結(jié)果表明，在珠子參中同時(shí)過表達(dá)和-基因比單獨(dú)表達(dá)能更有效地促進(jìn)齊墩果烷型單體皂苷的生物合成，尤其是-的過表達(dá)能夠定向增加齊墩果烷型皂苷合成支路的代謝流，獲得更多的齊墩果烷型皂苷。

圖5 珠子參細(xì)胞系中單體皂苷的含量Fig.5 Contents of monomer saponins in P. japonicus cell lines

3 討論

珠子參作為一種重要的中藥，具有抗炎、抗癌、保護(hù)心肌血管等多種藥理活性，珠子參皂苷是其主要活性成分。珠子參皂苷骨架合成途徑中的關(guān)鍵酶基因已被挖掘。人參、三七、西洋參和珠子參是人參屬的主要藥用植物，它們具有類似的人參皂苷骨架合成途徑。三七中過表達(dá)可增強(qiáng)三七皂苷的含量；人參中過表達(dá)基因可以提高總皂苷含量。在釀酒酵母中的研究證明，1和-基因共表達(dá)比單獨(dú)表達(dá)-可以更有效地增加-香樹脂醇的含量，說明三萜合成主代謝流增加可有效促進(jìn)分支代謝物的合成。在本研究中，-作為齊墩果烷型皂苷生物合成分支中的第一個(gè)酶基因，同時(shí)過表達(dá)和-比單獨(dú)過表達(dá)更加有利于珠子參皂苷的合成，說明利用2個(gè)酶基因調(diào)控人參屬植物三萜皂苷的生物合成可能是一種更有價(jià)值的策略。

在珠子參中過表達(dá)-S可促進(jìn)齊墩果烷皂苷的生物合成，表明-是齊墩果烷型皂苷生物合成分支中的關(guān)鍵酶基因。當(dāng)-和在珠子參細(xì)胞中共表達(dá)時(shí)，與單獨(dú)過表達(dá)的細(xì)胞相比，齊墩果酸型皂苷(竹節(jié)參皂苷Ⅳ和Ⅳa)含量顯著增高，而達(dá)瑪烷型皂苷、人參皂苷Rb1和Rd的含量卻有所降低。達(dá)瑪烷型皂苷和齊墩果烷型皂苷的生物合成共享前體2，3-氧化鯊烯。當(dāng)齊墩果烷型皂苷合成支路第一個(gè)關(guān)鍵酶基因-表達(dá)增加時(shí)，更多的2，3-氧化鯊烯分流到了齊墩果烷型皂苷合成支路，進(jìn)而減少了達(dá)瑪烷型皂苷合成支路所需的2，3-氧化鯊烯，導(dǎo)致達(dá)瑪烷型皂苷合成量的減少。類似的研究結(jié)果在人參皂苷的合成調(diào)控中也有所發(fā)現(xiàn)，譬如RNAi介導(dǎo)的-基因表達(dá)下調(diào)，直接導(dǎo)致齊墩果烷型皂苷合成量減少，使得更多的代謝流進(jìn)入達(dá)瑪烷型皂苷合成支路，迫使參與達(dá)瑪烷型皂苷生物合成的關(guān)鍵基因表達(dá)水平上調(diào)，進(jìn)而增加了達(dá)瑪烷型皂苷合成支路的皂苷含量。

與對(duì)照組細(xì)胞相比，所有轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系中與皂苷生物合成相關(guān)基因(、、和)的轉(zhuǎn)錄水平均增強(qiáng)，它們的上調(diào)使珠子參皂苷含量的提高趨于合理。盡管我們未對(duì)、和基因進(jìn)行人為干預(yù)，但在-轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系中，、和的表達(dá)水平均略高于轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，推測(cè)和-可能是三萜皂苷合成的重要限速步驟，2個(gè)基因的同時(shí)過表達(dá)，顯著增加了細(xì)胞可以處理的代謝流水平，進(jìn)而在一定程度上激活了整條皂苷合成途徑。

本研究探討了和-在珠子參三萜皂苷生物合成中的調(diào)控作用，證明和-是珠子參皂苷生物合成途徑中的關(guān)鍵酶基因，是皂苷合成的重要調(diào)節(jié)步驟。此外，結(jié)合前人已有研究，發(fā)現(xiàn)人參屬主要物種的皂苷骨架合成具有相似性和共性，未來可進(jìn)一步深入開展人參屬物種的統(tǒng)籌研究，從“屬”的層面探討皂苷合成的共性與個(gè)性。