高原雨點鴿與詹森鴿胸肌轉(zhuǎn)錄組差異表達基因篩選與功能分析

蘭國湘，金思琪，李星潤，劉喜雨，李國美，董新星，*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學 動物科學技術學院，云南 昆明 650201；2.大理農(nóng)林職業(yè)技術學院 動物科學學院，云南 大理 671003)

隨人民生活水平提高，對鴿子的利用逐漸從肉用向觀賞、比賽方向發(fā)展，賽鴿運動逐漸興起。賽鴿應具備堅固結實的骨骼、發(fā)達有力的肌肉、緊密堅挺的羽毛。胸肌在飛行中貢獻95%以上的力量，是鳥類中最重要的飛行肌肉，與飛翔有關的胸大肌負責向下煽動翅膀，胸小肌負責揚起翅膀，一般胸大肌比胸小肌發(fā)達。著名的詹森鴿原產(chǎn)于比利時，其特點是爆發(fā)力強，飛行速度快，適宜中短距離賽段。高原雨點鴿是我國第一代軍鴿品種，具有遠翔的能力和抗高原強磁的特點，耐受力強，可負重飛行。本研究對高原雨點鴿和詹森鴿的胸肌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行分析，挖掘調(diào)控鴿子與飛行能力有關的功能基因，為賽鴿培育提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

選取性別相同、10～12月齡的高原雨點鴿和詹森鴿各3只，屠宰后采集胸肌組織，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 纖維性狀組織學測定

參考蔣明雅等的方法測定肌纖維橫截面積和直徑。

1.3 RNA提取與轉(zhuǎn)錄組測序

用Trizol法提取總RNA，Nano Photometer分光光度計檢測RNA純度，Qubit3.0Flurometer檢測RNA濃度，安捷倫2100 RNA Nano 6000 Assay Kit檢測RNA的完整性。RNA檢測合格的樣品各取3 μg構建轉(zhuǎn)錄組文庫，用Illumina HiSeq 2500測序平臺進行雙端測序，得到150 bp的雙端測序reads。

1.4 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

1.4.1 數(shù)據(jù)質(zhì)控

原始數(shù)據(jù)去除接頭和低質(zhì)量reads后得到高質(zhì)量測序數(shù)據(jù)(clean data)，將clean data通過HISAT2(v2.1.0)比對到參考基因組，獲取序列在參考基因組上的位置與特征信息。

1.4.2 差異表達基因篩選

轉(zhuǎn)錄本的表達量計算用fragments per kilobase million reads (FPKM)法，以|logFC|>1且<0.05為閾值篩選差異表達基因。

1.4.3 差異表達基因GO與KEGG分析

利用基因本體(gene ontology，GO)富集分析計算每個GO Term的基因數(shù)目。用京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)數(shù)據(jù)庫對每個pathway應用超幾何檢驗進行富集分析，確定差異基因參與的信號通路。

1.5 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡分析

用STRING數(shù)據(jù)庫進行蛋白質(zhì)互作分析，采用R語言統(tǒng)計與其他蛋白質(zhì)相互作用關系最多的節(jié)點，取前45個進行可視化作圖。

1.6 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)

提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄建cDNA文庫，根據(jù)、3、1、1、1基因序列設計引物(表1)，引物由擎科生物有限公司合成。以反轉(zhuǎn)錄得到的胸肌cDNA為模板進行qRT-PCR，以β肌動蛋白基因(-)作為內(nèi)參，驗證基因表達量，每個樣本進行3 次重復。PCR擴增體系為20 μL：cDNA模板1 μL，上、下游引物各0.8 μL，2×SYBRSelect MasterMix 10 μL，ddHO 7.4 μL。PCR反應條件為：95 ℃預變性1 min；95 ℃變性10 s，55 ℃退火5 s，72 ℃延伸10 s，40個循環(huán)；用2法計算基因的相對表達量。

表1 實時熒光定量PCR引物序列Table 1 Primer sequences of qRT-PCR

2 結果與分析

2.1 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估

6個樣品的RNA測序文庫共得297.16 M讀長為150 bp的雙末端原始讀段(raw reads)，產(chǎn)生高質(zhì)量堿基417.25 Gb，高質(zhì)量序列所占比例均在90%以上，Q30均在93%以上，所有樣品比對基因組上的序列比例均在83%以上(表2)，說明測序質(zhì)量較高，可用于后續(xù)分析。

表2 測序輸出結果Table 2 Output of sequencing data

2.2 高原雨點鴿與詹森鴿胸肌轉(zhuǎn)錄組差異基因篩選

以|logFC|>1、<0.05為篩選差異顯著基因的閾值，共檢測到75個顯著差異表達基因，其中，高原雨點鴿相對于詹森鴿49個基因上調(diào)表達，26個基因下調(diào)表達(圖1)。

圖1 高原雨點鴿與詹森鴿胸肌差異表達基因火山圖Fig.1 Volcano plots of DEGs in breast muscle between Plateau raindrop pigeon and Janssen pigeon

2.3 差異顯著基因GO富集分析

GO分析結果(表3)顯示：差異基因主要富集在肌肉生長相關條目(JAK-STAT級聯(lián)、骨骼肌細胞分化、肌管分化調(diào)控等)、能量利用相關條目(支鏈氨基酸代謝過程、脂質(zhì)分解過程、支鏈氨基酸代謝過程等)、肌肉生長與能量利用相關條目(細胞代謝過程調(diào)節(jié)、初級代謝過程調(diào)節(jié)等)。

表3 肌肉生長、能量利用相關的差異表達基因主要顯著富集GO條目Table 3 Main GO items of DEGs enrichment analysis related to muscle growth and energy utilization

2.4 差異基因KEGG富集分析

KEGG通路富集分析表明，差異表達基因主要富集在22條信號通路，其中，胰島素信號通路、胰島素抵抗等7條通路與肌肉生長、能量利用均有關(表4)，細胞因子信號傳導抑制因子3基因(suppressor of cytokine signaling 3，3)、磷脂酶Cε1基因(phospholipase cepsilon-1，1)、信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄活化因子1基因(signal transducer and activator of transcription 1，1)、乙酰輔酶A羧化酶β基因(acetyl-CoA carboxylase beta，)、蛋白磷酸酶1調(diào)節(jié)亞基3C基因(protein phosphatase 1 regulatory subunit 3C，13)、低氧誘導因子1α基因(hypoxia inducible factor 1 alpha，1)等與肌肉生長、能量利用有關的基因顯著富集于以上通路。

表4 肌肉生長與能量利用相關的差異表達基因主要顯著富集信號通路Table 4 Pathways of DEGs enrichment analysis related to muscle growth and energy utilization

2.5 高原雨點鴿與詹森鴿胸肌差異表達基因編碼的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡分析

為進一步研究差異表達基因編碼的蛋白質(zhì)之間的調(diào)控關系，用STRING數(shù)據(jù)庫進行蛋白互作分析。從圖2可以看出，成纖維細胞生長因子6 (fibroblast growth factor 6，6)基因位于網(wǎng)絡起始端，1、生肌決定因子1(myogenic differentiation 1，1)、血管內(nèi)皮細胞生長因子A(vascular endothelial growth factor A，)位于網(wǎng)絡核心位置；互作網(wǎng)絡分為3大支，第1支由3、1、低氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor 1 subunit alpha，1)、1、SET和MYND結構域蛋白1(SET and MYND domain containing 1，1)等基因組成，通過自身編碼蛋白激活轉(zhuǎn)錄調(diào)控肌肉細胞分化，或編碼蛋白與受體激活作為轉(zhuǎn)錄激活因子參與調(diào)控肌細胞的分化；第2支由Mg/Mn依賴的蛋白磷酸酶1K(protein phosphatase，Mg/Mndependent 1K，1)、丙酮酸脫氫酶激酶4(pyruvate dehydrogenase kinase 4，4)、丙酮酸脫氫酶磷酸酶催化亞基1 (pyruvate dehydrogenase phosphatase catalytic subunit 1，1)等基因組成，通過磷酸化過程，參與調(diào)節(jié)葡萄糖代謝，增加能量生成；第3支由1、單酰甘油脂肪酶(monoglyceride lipase，)、脂肪酰胺水解酶(Fatty acid amide hydrolase，)等基因組成，編碼蛋白與酶類通過催化反應轉(zhuǎn)化為甘油，參與脂肪代謝。

圓圈代表蛋白質(zhì)，其顏色深淺表示在網(wǎng)絡中的權重，顏色越深表示權重越大。直線代表蛋白質(zhì)之間的相互作用，線條越粗表示相互作用越大。Circles represented proteins，and their color shades represented their weights in the network，with darker colors representing greater weights.Straight lines represented interactions between proteins，with thicker lines representing grater interactions.圖2 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡Fig.2 Protein interaction network

2.6 高原雨點鴿與詹森鴿胸肌差異基因qRT-PCR

為檢驗RNA-seq數(shù)據(jù)可靠性，從與肌肉生長和能量利用有關的差異表達基因中隨機選擇、3、1、1、1基因進行qRT-PCR驗證。轉(zhuǎn)錄組測序結果表明：高原雨點鴿胸肌1、1、1基因相對表達量高于詹森鴿，而、3基因相對表達量低于詹森鴿。qRT-PCR結果表明：高原雨點鴿胸肌1、1、1基因相對表達量高于詹森鴿，、3基因相對表達量低于詹森鴿，與轉(zhuǎn)錄組測序結果一致(圖3)。

2.7 高原雨點鴿和詹森鴿胸肌組織形態(tài)比較

詹森鴿和高原雨點鴿胸肌組織的石蠟切片(HE染色)見圖4。詹森鴿胸肌肌纖維橫切面能看到輪廓較為完整的肌纖維，肌纖維直徑(22.77±2.05)μm，肌纖維密度為(1 443±256)根·mm，肌內(nèi)脂肪沉積較充分；高原雨點鴿肌纖維直徑(20.27±1.72)μm，肌纖維密度為(1 553±159)根·mm，肌內(nèi)脂肪開始沉積。

A，轉(zhuǎn)錄組測序結果；B，qRT-PCR結果。A，Transcriptome sequencing results;B，qRT-PCR results.圖3 高原雨點鴿和詹森鴿胸肌差異表達基因的相對表達水平Fig.3 Relative expression levels of DEGs in breast muscle between Plateau raindrop pigeon and Janssen pigeon

A，高原雨點鴿(40×40)；B，詹森鴿(40×40)。A，Plateau raindrop pigeon(40×40);B，Janssen pigeon(40×40).圖4 高原雨點鴿和詹森鴿胸肌肌纖維橫切面Fig.4 Breast muscle fiber transection of Plateau raindrop pigeon and Janssen pigeon

3 討論

鴿子飛行依賴于發(fā)達的胸肌，飛行時胸肌收縮消耗大量能量，能量供給對賽鴿飛行至關重要，能量產(chǎn)生速率決定了骨骼肌的工作能力。本試驗對高原雨點鴿、詹森鴿胸肌轉(zhuǎn)錄組進行測序分析，篩選到1、、1、3、1、1、1、等與肌肉生長和能量代謝有關的差異表達基因。

3.1 與肌肉生長相關的差異表達基因

1在心臟和肌肉特異表達，具有激活下游基因轉(zhuǎn)錄的功能，可促進肌肉細胞成熟、分化。王娟等研究表明，1可能是胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factor 1，-1)下游靶基因，1可能與存在協(xié)同激活效應，促進肌纖維分化。早期成肌細胞1缺失并不影響增殖，但抑制分化，導致肌纖維減少，骨骼肌特異性基因的表達減少。本試驗中，高原雨點鴿1基因相對表達量比詹森鴿高，1基因富集于骨骼肌細胞分化、肌管分化、成肌細胞分化、橫紋肌細胞分化等條目，可能導致高原雨點鴿胸肌肌纖維分化，形成更多的紅肌纖維，耐力較好，更適宜中長距離飛行。

3.2 與能量利用有關的差異表達基因

基因可編碼絲氨酸水解酶，催化單?；视娃D(zhuǎn)化為游離脂肪酸和甘油，為能量消耗提供燃料?；虮磉_時，會降解2-花生四烯酰甘油，促進脂質(zhì)儲存。本試驗中，基因在高原雨點鴿胸肌的相對表達量比詹森鴿低，主要富集于脂肪酸生物合成過程、二?；视痛x過程、甘油三酯分解過程等條目，可能導致高原雨點鴿胸肌脂質(zhì)減少，快速飛行時能量供應不足，爆發(fā)力不如詹森鴿。有研究表明，賽鴿飛翔骨骼肌運動能量消耗加大，主要靠水解游離脂肪酸、甘油提供能量。

1基因可編碼支鏈α-酮酸脫氫酶，促進支鏈氨基酸分解。本試驗中，高原雨點鴿1基因相對表達量比詹森鴿高，該基因富集于支鏈氨基酸分解過程、支鏈氨基酸代謝過程等條目，該基因可通過催化支鏈氨基酸分解，為高原雨點鴿長距離飛行提供足夠的能量。

3.3 同時調(diào)控肌肉生長和能量利用的基因

本試驗中，高原雨點鴿3基因表達量比詹森鴿低，3基因是細胞因子信號轉(zhuǎn)導抑制因子家族的成員之一，影響肌肉組織中多種細胞因子的信號轉(zhuǎn)導，可通過負反饋方式調(diào)節(jié)細胞因子與激素介導的酪氨酸蛋白激酶/信號傳導子和轉(zhuǎn)錄激活子信號傳導通路，促進成肌細胞分化。同時，3可正調(diào)控胰島素樣生長因子(IGF-1)信號通路，IGF-1可促進骨骼肌肥大、肌纖維體積增加。高原雨點鴿3基因表達量低，可能導致高原雨點鴿胸肌肌纖維直徑變小，肌肉收縮時的力量不如詹森鴿，比賽時爆發(fā)力比詹森鴿差，組織學觀測結果也表明，詹森鴿肌肉生長可能早于高原雨點鴿，詹森鴿胸肌肌纖維處于肥大期，肌纖維直徑較大、發(fā)育較為充分，已經(jīng)可以看到較為明晰的肌纖維輪廓，而高原雨點鴿則處于肌纖維生長期。另一方面，3基因是瘦素受體信號轉(zhuǎn)導的負反饋調(diào)節(jié)因子，瘦素受體可激活JAK-STAT通路調(diào)控靶基因表達，調(diào)控脂肪沉積。高濃度瘦素可誘導3 mRNA和蛋白質(zhì)在成熟脂肪細胞表達。當3基因表達時，抑制瘦素受體信號轉(zhuǎn)導，導致長鏈脂肪酸合成與氧化速度加快，促黑激素分泌減少，食欲增加，脂肪沉積增加。高原雨點鴿3基因相對表達量下調(diào)，可能導致高原雨點鴿食欲降低、采食量減少、脂肪沉積減少，能量底物減少，從而導致爆發(fā)力不如詹森鴿。組織學觀測表明，詹森鴿胸肌可以看到明顯的脂滴，脂肪沉積較充分，而高原雨點鴿胸肌脂滴較少。

本試驗中，高原雨點鴿1基因相對表達量比詹森鴿高，1基因編碼蛋白為磷脂酶，催化磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸生成三磷酸肌醇，其受體是肌肉特異性表達轉(zhuǎn)錄因子，可介導Ca釋放，對成肌細胞分化和肌肉收縮至關重要。原代培養(yǎng)的大鼠骨骼肌成肌細胞肌管中含有大量的磷酸肌醇。成肌細胞分化為肌管時，磷脂酶活性增加。高原雨點鴿1基因相對表達量比詹森鴿高，可能導致高原雨點鴿胸肌肌管數(shù)量增加、肌纖維增多、肌纖維密度增加，耐力更好，更適合長距離飛行。另外，1基因編碼的磷脂酶Cε1能水解磷脂生成二酰甘油和三磷酸肌醇，二酰甘油作為重要的第二信使分子，可激活蛋白激酶C，進一步激活一系列信號傳遞級聯(lián)途徑，上調(diào)膽固醇?；D(zhuǎn)移酶-1，促進脂質(zhì)沉積。高原雨點鴿1基因相對表達量比詹森鴿高，可能通過磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C水解磷脂生成二酰甘油和三磷酸肌醇，激活蛋白激酶C，進一步激活一系列信號傳遞級聯(lián)途徑，上調(diào)膽固醇?；D(zhuǎn)移酶-1，促進脂質(zhì)沉積，為高原雨點鴿長距離負重飛行提供足夠能量底物。

蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡分析顯示，1、1、處于蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡的核心位置。1基因是信號轉(zhuǎn)導子和轉(zhuǎn)錄激活子STATs蛋白家族成員之一，當1基因缺失時，骨骼肌生長加速，骨骼肌中甘油三酯含量降低。1基因在高原雨點鴿胸肌中上調(diào)，可能導致高原雨點鴿胸肌生長慢于詹森鴿，胸肌中甘油三酯含量高于詹森鴿。1基因是主要的生肌因子，是骨骼肌生長中基因表達的正調(diào)節(jié)劑。1基因轉(zhuǎn)染到鼠源成纖維細胞，可促進60%～90%的成纖維細胞啟動肌分化。1基因缺失可將衛(wèi)星細胞來源的原代成肌細胞轉(zhuǎn)化為棕色脂肪細胞。1基因在高原雨點鴿胸肌中下調(diào)，可能導致高原雨點鴿胸肌肌纖維細胞的肌分化慢于詹森鴿、肌肉生長變慢，脂肪細胞分化加快?；蚩赏ㄟ^調(diào)節(jié)生長因子、轉(zhuǎn)錄因子、黏連蛋白基因的表達來調(diào)節(jié)脂肪組織的結構及功能，過表達會增加血管密度以抵制肥胖，使白色脂肪棕色化，基因在高原雨點鴿胸肌中上調(diào)，可能導致高原雨點鴿體內(nèi)白色脂肪轉(zhuǎn)化為棕色脂肪，分解白色脂肪為二氧化碳、水和能量，有利于遠距離飛行。

4 結論

高原雨點鴿胸肌1、1、、1、1基因相對表達量上調(diào)。1可能導致高原雨點鴿胸肌肌纖維分化形成更多的紅肌纖維；1可能導致高原雨點鴿胸肌肌管數(shù)量增加、肌纖維增多、肌纖維密度增加，同時促進脂質(zhì)沉積；1可能導致高原雨點鴿胸肌生長慢于詹森鴿，胸肌中甘油三酯含量高于詹森鴿；可能導致高原雨點鴿體內(nèi)白色脂肪轉(zhuǎn)化為棕色脂肪；1可能催化支鏈氨基酸分解，最終導致高原雨點鴿飛行時的肌肉爆發(fā)力不如詹森鴿，同時為高原雨點鴿長距離負重飛行提供足夠能量，耐力更好。

高原雨點鴿胸肌1、3、基因相對表達量下調(diào)。1可能導致高原雨點鴿胸肌肌纖維細胞的肌分化慢于詹森鴿，肌肉生長變慢；3可能導致高原雨點鴿胸肌肌纖維直徑變小，爆發(fā)力比詹森鴿差；可能導致高原雨點鴿胸肌脂質(zhì)減少，能量供應不足，爆發(fā)力不如詹森鴿，同時催化支鏈氨基酸分解，為高原雨點鴿長距離飛行提供足夠的能量，更適宜遠距離飛行。