譚天宇，才冬杰，王之盛，左之才，*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，動物疫病與人類健康四川省重點(diǎn)實驗室，四川 成都 611130；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物營養(yǎng)研究所，四川 成都 611130)

肺泡巨噬細(xì)胞是調(diào)節(jié)肺部炎癥反應(yīng)維持肺炎癥微環(huán)境的最重要的免疫細(xì)胞。在肺部受到外來(如細(xì)菌、病毒感染)或內(nèi)在致病因素(如內(nèi)源性炎癥介質(zhì))刺激后，肺泡巨噬細(xì)胞被活化并釋放促炎細(xì)胞因子、趨化因子等促進(jìn)肺部炎癥反應(yīng)的發(fā)生。但過度的炎癥反應(yīng)會加重肺組織損傷，肺泡巨噬細(xì)胞的活化被認(rèn)為是多種肺部疾病(如急性肺損傷)的始發(fā)因素。有研究表明，高濃度的葡萄糖(即高糖)也能夠活化肺泡巨噬細(xì)胞，引起促炎細(xì)胞因子釋放。葡萄糖本是細(xì)胞重要的能量來源，保證了細(xì)胞能量的需求與利用，但高糖(體外試驗一般為25.5 mmol·L)能通過氧化應(yīng)激途徑激活并上調(diào)糖基化終末產(chǎn)物受體(RAGE)與Toll樣受體4(TLR4)，進(jìn)一步激活下游信號通路MyD88/NF-κB，從而促進(jìn)炎癥反應(yīng)。目前有關(guān)高糖體外促炎作用機(jī)制的研究主要有人單核細(xì)胞、牛主動脈內(nèi)皮細(xì)胞等，而高糖促進(jìn)BAMs促炎細(xì)胞因子釋放的過程是否伴隨著RAGE-TLR4-MyD88-NF-κB上調(diào)，尚不清楚。

綜上所述，本文研究葡萄糖濃度變化對BAMs RAGE-TLR4-MyD88-NF-κB基因表達(dá)以及對促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β及IL-6釋放的影響，初步探討高糖促進(jìn)BAMs炎癥反應(yīng)的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

高糖DMEM、低糖DMEM培養(yǎng)基購自索萊寶(中國)，胎牛血清購自生工生物工程有限公司(中國)，TNF-α、IL-1β、IL-6的ELISA檢測試劑盒購自晶美生物工程有限公司(中國)，Premix酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自寶生物公司(日本)。

原代牛肺泡巨噬細(xì)胞采自健康牛新鮮肺部組織。

-、、4、-65、88的實時熒光定量檢測引物見表1，引物由生工生物工程有限公司合成。

表1 各基因?qū)崟r熒光定量引物序列Table 1 Primer sequence of genes for real-time PCR

1.2 方法

1.2.1 牛肺泡巨噬細(xì)胞的采集與分組處理

參照文獻(xiàn)[13]中原代牛肺泡巨噬細(xì)胞采集方法，肺泡巨噬細(xì)胞陽性率大于96%。在四川省雅安市某肉牛屠宰場中，取出無呼吸道癥狀肉牛眼觀健康無病變的新鮮且完整的牛肺，結(jié)扎氣管防止污染，帶回四川農(nóng)業(yè)大學(xué)雅安校區(qū)獸醫(yī)院進(jìn)行原代肺泡巨噬細(xì)胞的分離。用經(jīng)過高壓滅菌且含有200 IU·mL青霉素、200 μg·mL鏈霉素的PBS對肺表面進(jìn)行沖洗，并將PBS經(jīng)氣管灌入肺部，使用注射器收集灌洗液，重復(fù)3次。收集到的灌洗液經(jīng)200目尼龍紗布過濾，1 200×離心6 min，收集細(xì)胞。PBS洗滌細(xì)胞，1 200 r·min離心6 min，用含10%胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，對細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，置于37 ℃二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h。PBS洗去未貼壁細(xì)胞，消化重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×10mL，并通過臺盼藍(lán)染色法計算細(xì)胞存活率。分裝于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3 h。用5.5 mmol·L(Ⅰ組、對照組)、15.5 mmol·L(Ⅱ組)和25.5 mmol·L葡萄糖(Ⅲ組)及5.5 mmol·L葡萄糖+20 mmol·L甘露醇(Ⅳ組、滲透壓對照組)誘導(dǎo)BAMs 12 h，并使用25.5 mmol·L葡萄糖誘導(dǎo)BAMs 0、3、6、12、24 h，每組設(shè)置3個平行。分別收集處理后的上清液及下層細(xì)胞，上清液用于ELISA檢測TNF-α、IL-1β、IL-6水平，下層細(xì)胞用于檢測、4、88、-的mRNA轉(zhuǎn)錄水平。

1.2.2 實時熒光定量PCR檢測牛肺泡巨噬細(xì)胞、4、88和-的mRNA轉(zhuǎn)錄水平

對收集到的BAMs中總RNA采用Trizol法進(jìn)行提取，并測定總RNA濃度及純度，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒對總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到的cDNA置于-80 ℃保存?zhèn)溆?。以cDNA為模板，對每組、4、88、-的mRNA水平進(jìn)行檢測。實時熒光定量PCR反應(yīng)體系：上下游引物各0.5 μL，Premix6.0 μL，cDNA模板5.0 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，循環(huán)40次，每個循環(huán)后檢測熒光強(qiáng)度值。實時定量PCR的結(jié)果采用 2法進(jìn)行計算，用內(nèi)參基因-對各基因表達(dá)水平均一化，2法計算公式:△CT=CT-CT，△△CT=△CT-△CT。

1.2.3 ELISA檢測牛肺泡巨噬細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6濃度

參照ELISA試劑盒說明書檢測每組上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白濃度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS22.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果用′±表示，多重比較進(jìn)行組間統(tǒng)計學(xué)處理。<0.05為差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義，<0.01表示差異具有極顯著統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度葡萄糖對BAMs RAGE、TLR4、MyD88、NF-κB p65基因表達(dá)及促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α釋放的影響

Ⅲ組、4、88和-65mRNA表達(dá)極顯著(<0.01)高于Ⅰ組，Ⅰ組、Ⅱ組及Ⅳ組間、4、88和-65的mRNA表達(dá)均無顯著性差異(>0.05)。即只有25.5 mmol·L葡萄糖處理BAMs 12 h能夠引起、4、88、-65基因表達(dá)相較于Ⅰ組極顯著(<0.01)上調(diào)，并且與25.5 mmol·L葡萄糖引起的滲透壓升高無關(guān)(圖1)。Ⅲ組上清液中的IL-1β、IL-6及TNF-α濃度極顯著(<0.01)高于其他各組(Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ組)，而Ⅱ組上清液中IL-1β、IL-6濃度極顯著(<0.01)高于Ⅰ組與Ⅳ組，TNF-α濃度顯著(<0.05)高于Ⅰ組與Ⅳ組。即15.5 mmol·L和25.5 mmol·L葡萄糖處理BAMs 12 h，能引起B(yǎng)AMs促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6釋放增加，且25.5 mmol·L相較于15.5 mmol·L葡萄糖增加更顯著(<0.01)，并且與25.5 mmol·L葡萄糖引起的滲透壓升高無關(guān)(圖2)。

*表示與對照組差異顯著(P<0.05)，**表示與對照組差異極顯著(P<0.01)。下同。* meaned there was a significant difference from the control group (P<0.05)，** meaned there was a very significant difference from the control group (P<0.01).The same as below.圖1 不同濃度葡萄糖處理BAMs 12 h對RAGE、TLR4、MyD88、NF-κBp65基因表達(dá)的影響Fig.1 Effects of different concentrations of glucose on gene expression of RAGE，TLR4，MyD88 and NF-κB p65 in bovine alveolar macrophages induced for 12 hours

圖2 不同濃度葡萄糖誘導(dǎo)BAMs 12 h對IL-1β、IL-6及TNF-α釋放的影響Fig.2 Effects of different concentrations of glucose on releasing of IL-1β，IL-6，TNF-α in bovine alveolar macrophages induced for 12 hours

2.2 25.5 mmol·L-1葡萄糖處理不同時間對BAMs RAGE、TLR4、MyD88、NF-κB p65基因表達(dá)及促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α釋放的影響

、4、88及-mRNA水平均在12 h處于峰值，極顯著(<0.01)高于其他時間點(diǎn)；mRNA水平在6 h顯著高于0 h(<0.05)，在24 h極顯著(<0.01)高于0、3、6 h，其他時間點(diǎn)間無顯著性差異(>0.05)；88、4、-65mRNA水平在3 h時顯著(<0.05)高于0 h，4 mRNA水平6 h時顯著(<0.05)高于0、3、24 h，但88、-65在3、6、24 h間無顯著性差異(>0.05)。-65在24 h時仍極顯著(<0.01)高于0 h，但4、88 24 h與0 h無顯著性差異(>0.05)，如圖3所示。

圖3 高糖誘導(dǎo)時間對牛肺泡巨噬細(xì)胞RAGE、TLR4、MyD88、NF-κB p65基因表達(dá)的影響Fig.3 Effects of different high glucose induction time on gene expression of RAGE，TLR4，MyD88 and NF-κB p65 in bovine alveolar macrophages

TNF-α、IL-1β、IL-6濃度在6、12、24 h均極顯著(<0.01)高于0 h，在3～24 h呈現(xiàn)時間依賴效應(yīng)，24 h時IL-1β、TNF-α顯著(<0.05)高于12 h，但I(xiàn)L-6 24 h與12 h無顯著性差異(>0.05)，如圖4所示。

圖4 高糖誘導(dǎo)時間對BAMs IL-1β、IL-6及TNF-α釋放的影響Fig.4 Effects of different high glucose induction time on releasing of IL-1β，IL-6，TNF-α in bovine alveolar macrophages

3 討論

高糖能夠促進(jìn)細(xì)胞炎癥反應(yīng)，并與IL-1β、IL-6及TNF-α等促炎因子水平呈正相關(guān)。目前研究發(fā)現(xiàn)，高糖主要通過TLR4、RAGE等固有免疫受體發(fā)揮促炎作用，但受體下游信號傳導(dǎo)途徑尚有待進(jìn)一步研究。TLR4是機(jī)體重要的模式識別受體，能夠識別諸多病原相關(guān)分子模式如細(xì)菌脂多糖等，激活下游炎癥信號通路，在先天性免疫中發(fā)揮重要作用。Devaraj等研究發(fā)現(xiàn)，25.5 mmol·L高糖能誘導(dǎo)人單核細(xì)胞TLR4表達(dá)上調(diào)，并進(jìn)一步促進(jìn)NF-κB的活化，促進(jìn)單核細(xì)胞炎癥反應(yīng)。Li等研究發(fā)現(xiàn)，25.5 mmol·L高糖能夠誘導(dǎo)人巨噬細(xì)胞TLR4的激活，并促進(jìn)TNF-α與IL-1β的合成與釋放。高糖相關(guān)體外細(xì)胞試驗中，25.5 mmol·L葡萄糖濃度是對于大部分體外培養(yǎng)細(xì)胞的高糖濃度，因此本次研究也采用25.5 mmol·L作為最高葡萄糖濃度。在本次研究中發(fā)現(xiàn)，25.5 mmol·L葡萄糖處理3 h后，BAMs4、-65基因表達(dá)顯著上調(diào)，并于12 h達(dá)到峰值，并通過檢測BAMs培養(yǎng)上清液發(fā)現(xiàn)，在該過程中IL-1β、IL-6及TNF-α濃度與25.5 mmol·L葡萄糖處理時間呈正相關(guān)，IL-1β、IL-6濃度于24 h達(dá)到峰值，TNF-α于12 h達(dá)到峰值。上述結(jié)果表明，25.5 mmol·L葡萄糖能夠促進(jìn)BAMs促炎因子IL-1β、IL-6及TNF-α的釋放，該過程可能與激活TLR4/NF-κB有關(guān)。

RAGE是機(jī)體另一個重要的模式識別受體，與TLR4發(fā)揮類似的作用，RAGE與TLR4共享部分配體及下游炎癥信號通路。Zhao等研究發(fā)現(xiàn)，25.5 mmol·L高糖能夠通過激活RAGE，激活下游MAPK/NF-κB炎癥信號通路，誘導(dǎo)人星形膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。髓樣分化因子88(MyD88)是TLR4胞內(nèi)重要的接頭蛋白，能夠接收TLR4傳導(dǎo)至胞內(nèi)的信號，并進(jìn)一步傳導(dǎo)至NF-κB，使NF-κB活化入核，促進(jìn)細(xì)胞合成炎性細(xì)胞因子如TNF-α、IL-1β、IL-6等。但有研究提出，MyD88可能接收來自RAGE傳導(dǎo)至胞內(nèi)的信號，并激活下游炎癥信號通路?；诖耍覀冄芯堪l(fā)現(xiàn)，BAMs經(jīng)25.5 mmol·L葡萄糖處理6 h后，基因顯著上調(diào)，在該過程中88、-65同樣顯著上調(diào)，、88、-65基因表達(dá)于12 h達(dá)到峰值。因此，推測MyD88活化與高糖誘導(dǎo)的RAGE激活也有關(guān)聯(lián)，并進(jìn)一步傳導(dǎo)至NF-κB，發(fā)揮促炎作用。有研究指出，RAGE與TLR4在不同細(xì)胞或不同處理下，發(fā)揮主要功能的受體不同。在本次研究發(fā)現(xiàn)高糖處理24 h后，4、88基因表達(dá)與0 h無顯著差異，、-65基因表達(dá)仍顯著高于0 h，但-65基因表達(dá)顯著低于12 h，提示高糖處理BAMs 24 h后，激活NF-κB維持炎癥反應(yīng)的主要受體可能為RAGE。

牛在應(yīng)激條件下(如運(yùn)輸應(yīng)激)血糖濃度常顯著升高。并且在應(yīng)激過程中，牛肺部常產(chǎn)生由機(jī)體與病原共同導(dǎo)致的肺部過度炎癥反應(yīng)，而肺泡巨噬細(xì)胞在肺部炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，體外高糖能夠誘導(dǎo)BAMs釋放促炎細(xì)胞因子，但還需動物試驗來進(jìn)一步討論血糖升高和運(yùn)輸應(yīng)激過程中肺部炎癥反應(yīng)的關(guān)系。

綜上所述，高糖能夠誘導(dǎo)BAMs促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的釋放，并且該過程可能與高糖激活BAMs RAGE-TLR4-MyD88-NF-κB炎癥信號通路有關(guān)。本試驗初步探討了高糖促進(jìn)BAMs炎癥反應(yīng)的分子機(jī)制，以期為高糖相關(guān)肺部炎性疾病的預(yù)防及治療提供新的思路。