安雪花，李冬雪，代德茂，余世鋒，趙美芹，吳聲敢，趙學(xué)平，*

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營養(yǎng)研究所，浙江 杭州 310021；2.北京大農(nóng)時代農(nóng)藥技術(shù)研究所，北京 100016；3.北京科發(fā)偉業(yè)技術(shù)有限公司，北京 100125)

農(nóng)藥的大量使用給生態(tài)環(huán)境帶來極大的危害，尤其是水生態(tài)環(huán)境中的農(nóng)藥會直接危害溞類、魚類、藻類等水生生物，甚至通過飲用水或食物影響人體健康。

丁氟螨酯是日本大?；瘜W(xué)公司開發(fā)的新型?；译骖悮Ⅱ齽?，主要用于果樹、蔬菜、茶等農(nóng)作物和花卉上螨蟲類的防治。丁氟螨酯與現(xiàn)有的殺蟲劑無交互抗性，對其他物種的毒性也較小。研究發(fā)現(xiàn)，田間施用后，從1 d開始，丁氟螨酯在沉積物中會降解為B-1，在水中主要降解為B-3。Li等對地下水中的丁氟螨酯進行檢測，發(fā)現(xiàn)原始沉積量為5.0 mg·kg時，半衰期為3.1 d。雖然丁氟螨酯因易在水環(huán)境中降解成有毒的代謝產(chǎn)物已被歐盟禁止使用，但丁氟螨酯在我國的應(yīng)用依然廣泛。目前，關(guān)于丁氟螨酯的研究大多還集中在丁氟螨酯的生物活性、檢測方法和環(huán)境殘留測定上，涉及丁氟螨酯及其代謝物水生生物毒性的研究資料還鮮見報道。大型溞(Straus)廣泛生活在自然水域，具有分布廣、繁殖快、經(jīng)濟易得、易于在試驗室培養(yǎng)、對毒物敏感等特點，被廣泛用于水生生物毒理試驗。本研究以大型溞為受試生物，以丁氟螨酯及其8種代謝物[A-2、AB-1 dimer、AB-1、AB-11、B-1、B-3、Target 1(B-2)和Met-1]為研究對象，通過48 h急性毒性和21 d慢性毒性試驗，補充丁氟螨酯的生態(tài)毒理學(xué)數(shù)據(jù)，以期為水生態(tài)系統(tǒng)中丁氟螨酯的風(fēng)險評估提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和儀器

大型溞引自沈陽化工研究院有限公司安全評價中心，用Elendt M4培養(yǎng)基培養(yǎng)和繁殖大型溞。在本實驗室培養(yǎng)期間，喂食近頭狀偽蹄形藻()。選擇實驗室條件下孤雌繁殖3代以上、溞齡不超過24 h的非頭胎健康溞用于試驗。

98%丁氟螨酯，山東省聯(lián)合農(nóng)藥工業(yè)有限公司；A-2、B-1、B-3，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；AB-1、AB-1 dimer、AB-11、Target 1(B-2)、Met-1，上海藥明康德新藥開發(fā)有限公司。丁氟螨酯及其8種代謝物的結(jié)構(gòu)式詳見圖1。

主要試劑包括：乙腈(色譜純)，Merck公司；甲酸(色譜純)、甲酸銨(色譜純)、甲醇(色譜純)，Anaqua Chemicals Supply公司；乙酸乙酯(分析純)、鹽酸(分析純)、無水硫酸鈉(分析純)，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；氯化鈉(分析純)，蘭溪市屹達化工試劑有限公司；丙酮(分析純)，永華化學(xué)科技(江蘇)有限公司。

主要儀器包括：ABSciex Exion LCAD-Triple Quad5500液相色譜串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國ABSciex公司；ACQUITY UPLCBEH C色譜柱(2.1 mm×100 mm×1.7 μm)，美國Waters公司；LunaOmega Polar C色譜柱(2.1 mm×50 mm×3 μm)，美國Phenomenex公司；BSG-400光照培養(yǎng)箱，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 急性毒性試驗

參照GB/T 31270.13—2014《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準(zhǔn)則 第13部分：溞類急性活動抑制試驗》和NY/T 3273—2018《難處理農(nóng)藥水生生物毒性試驗指南》的方法開展急性毒性試驗。

依據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，選定丁氟螨酯、B-1、B-3、Target 1(B-2)和Met-1做限度試驗，用Elendt M4培養(yǎng)基分別將其配制成50、120、130、400、400 mg·L的試驗濃度。同時，在預(yù)試驗確定的濃度范圍內(nèi)按一定比例間隔設(shè)置A-2(8.37、10.0、12.1、14.5、17.4、20.8、25.0 mg·L)、AB-1 dimer(6.06、7.30、8.71、10.5、12.6、15.1 mg·L)、AB-1(7.01、8.50、10.3、12.4、15.0、18.2、22.0 mg·L)和AB-11(217、255、302、356、420 mg·L)的試驗濃度。試驗選擇半靜態(tài)法，試驗開始24 h后更換一次試驗溶液。

分子式后括號中的數(shù)值為其分子量。Data in brackets after molecular formular show responding molecular weight.圖1 丁氟螨酯及其代謝物的結(jié)構(gòu)式、分子式和分子量Fig.1 Chemical structure，molecular formula and molecular weight of cyflumetofen and its metabolites

試驗時，移取50.0 mL試驗溶液加入到結(jié)晶皿(直徑60 mm)中，每皿加5只試驗用溞后放入光照培養(yǎng)箱。試驗周期為48 h，期間不投餌。試驗期間保持全黑暗，溫度為20.1～20.8 ℃。

在開展丁氟螨酯及其8種代謝物對大型溞急性毒性的試驗期間，分別在試驗開始時和試驗溶液更換前取樣，進行濃度分析。

1.2.2 慢性毒性試驗

參照經(jīng)濟合作與發(fā)展組織(OECD)提出的方法進行慢性毒性試驗。

根據(jù)丁氟螨酯對大型溞急性毒性的試驗結(jié)果和慢性毒性的預(yù)試驗結(jié)果，設(shè)置50.0 mg·L的試驗濃度。同時設(shè)置空白對照組和溶劑對照組(丙酮，濃度為0.100 mL·L)。每個試驗組設(shè)置12個平行(結(jié)晶皿)，每個平行含50.0 mL試驗溶液和1只親溞。試驗期間，溶氧量為8.32～8.67 mg·L，pH值為7.24～7.42，硬度為140 mg·L，溫度為19.8～20.9 ℃，水面處光照強度為1 020～1 470 lx。試驗周期為21 d。試驗期間，每天每皿投喂10.0～15.0 μL的8.14×10mL近頭狀偽蹄形藻溶液。每24 h更換1次試驗溶液，分別測定1、2、3、4、5、14、15、20 d換溶液前后試驗溶液中丁氟螨酯的實際濃度。

試驗期間，每天觀察親溞的外觀和存活情況，及時移除出生的幼溞，計算存活幼溞的數(shù)量，記錄親溞的死亡率和產(chǎn)幼溞的數(shù)量。試驗結(jié)束時，測定所有存活親溞的體長。

1.3 試驗溶液濃度測定

1.3.1 樣品前處理

丁氟螨酯、AB-11、B-3、Target 1(B-2)和Met-1樣品前處理：移取5.000 mL樣品，先加入一滿勺氯化鈉，渦旋30 s，再加入10.00 mL乙腈，渦旋1 min，靜置分層，然后用乙腈稀釋至標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)后過0.22 μm濾膜，待檢測。

A-2和AB-1樣品前處理：移取5.00 mL樣品，用甲醇定容至10.00 mL，渦旋30 s，然后用50%(體積分?jǐn)?shù))甲醇溶液稀釋至標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)后過0.22 μm濾膜，待檢測。

AB-1 dimer樣品前處理：移取20.0 mL樣品，先加入一滿勺氯化鈉，再加入10.00 mL丙酮，然后加入20.0 mL乙酸乙酯提取，重復(fù)1次，之后劇烈震蕩，靜置分層。取2次的乙酸乙酯相(上層)過無水硫酸鈉，收集至250 mL平底燒瓶中，于40 ℃水浴濃縮干，用2.00 mL乙腈定容，過0.22 μm濾膜，待檢測。

B-1樣品前處理：移取5.00 mL樣品，用乙腈定容至10.00 mL，渦旋30 s，然后用50%(體積分?jǐn)?shù))甲醇溶液稀釋至標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)后過0.22 μm濾膜，待檢測。

1.3.2 檢測條件

液相條件：分析A-2樣品時，使用LunaOmega Polar C色譜柱；分析其他樣品時，均使用ACQUITY UPLCBEH C色譜柱。柱溫均為40 ℃。將分析各樣品時用到的流動相、流速、進樣體積和保留時間整理于表1。

表1 檢測丁氟螨酯及其代謝物時用到的流動相、流速、進樣體積和保留時間參數(shù)Table 1 Mobile phase，flow rate，injection volume and retention time for determination of cyflumetofen and its metabolites

丁氟螨酯、AB-1 dimer、AB-1、AB-11、B-3、Target 1(B-2)、Met-1的質(zhì)譜條件：毛細管電壓5.5 kV，氣簾氣35 psi(1 psi=6.895 kPa)，噴撞氣8 psi，噴霧氣50 psi，輔助加熱氣50 psi，離子源溫度550 ℃，射入電壓10 V，碰撞室射出電壓16 V。定性、定量模式均為MRM(多反應(yīng)監(jiān)測模式)，電離方式為ESI+(電噴霧電離)。

A-2的質(zhì)譜條件：針電流3.5 mA，氣簾氣35 psi，噴撞氣8 psi，噴霧氣50 psi，離子源溫度450 ℃，射入電壓10 V，碰撞室射出電壓16 V。定性、定量模式均為MRM，電離方式為APCI+(大氣圧化學(xué)電離)。

B-1的質(zhì)譜條件：毛細管電壓-4.5 kV，氣簾氣35 psi，噴撞氣8 psi，噴霧氣50 psi，輔助加熱氣55 psi，離子源溫度550 ℃，射入電壓-10 V，碰撞室射出電壓-14 V。定性、定量模式均為MRM，電離方式為ESI-。

將丁氟螨酯、A-2、AB-1 dimer、AB-1、AB-11、B-1、B-3、Target 1(B-2)、Met-1的其他質(zhì)譜檢測參數(shù)整理于表2。

表2 丁氟螨酯及其代謝物的質(zhì)譜檢測參數(shù)Table 2 Parameters for mass spectrometric analysis of cyflumetofen and its metabolites

1.4 數(shù)據(jù)處理

用Excel 2016軟件整理數(shù)據(jù)，用DPS v18.10軟件進行數(shù)據(jù)分析。

根據(jù)急性毒性試驗中的實測濃度和各處理組大型溞的平均受抑制率進行回歸分析，建立“劑量-效應(yīng)”線性方程，計算EC(半數(shù)抑制濃度)和95%置信區(qū)間。

2 結(jié)果與分析

2.1 回歸方程和添加回收率

在一定濃度[丁氟螨酯、AB-1 dimer、AB-1、AB-11、B-1、Target 1(B-2)：0.000 500～0.100 mg·L；A-2：0.050 0～2.00 mg·L；B-3、Met-1：0.000 100～0.050 0 mg·L]內(nèi)，丁氟螨酯及其8種代謝物在Elendt M4培養(yǎng)基中的定量離子峰面積()與進樣濃度()均呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)()均大于0.998 5(表3)。

表3 丁氟螨酯及其代謝物的回歸方程、最低檢出限和回收率Table 3 Regression equation，limit of quantitation and average recovery of cyflumetofen and its metabolites

向空白基質(zhì)中添加丁氟螨酯及其8種代謝物，通過回收率試驗評價本文所用檢測方法的準(zhǔn)確度和精密度。丁氟螨酯的平均回收率為102%～105%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.97%～2.01%；8種代謝物的平均回收率為78.8%～104%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.04%～7.34%。

以上結(jié)果表明，本試驗所使用的分析方法可滿足試驗要求。

2.2 大型溞的毒性效應(yīng)

在急性毒性試驗期間，在試驗開始時和試驗進行24 h更換試驗溶液前分別取樣，測定丁氟螨酯及其8種代謝物的濃度(表4)。對于丁氟螨酯、AB-11、Target 1(B-2)和Met-1而言，2個時間點測定濃度的偏差大于20%，表明其在試驗條件下有不同程度的降解。其中，Target 1(B-2)在試驗開始時測定的濃度為0.031 5 mg·L，試驗進行6 h時濃度已低于檢出限，表明其降解速率較高。對于A-2、AB-1 dimer、AB-1、B-1和B-3而言，2個時間點測定濃度的偏差小于20%，說明其在24 h內(nèi)較穩(wěn)定。根據(jù)GB/T 31270.13—2014《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準(zhǔn)則》和《農(nóng)藥登記環(huán)境影響試驗常見問題解答》的要求，本研究采用試驗開始時和試驗進行24 h時試驗溶液更換前實測濃度的幾何平均值計算其對大型溞的急性毒性效應(yīng)值。

表4 急性毒性試驗丁氟螨酯及其代謝物濃度分析Table 4 Analysis results of cyflumetofen concentration in acute toxicity test mg·L-1

丁氟螨酯對大型溞的慢性毒性試驗結(jié)果(表5)顯示：丁氟螨酯濃度在更換試驗溶液周期(24 h)內(nèi)有降解?？紤]到丁氟螨酯對大型溞的長期效應(yīng)，慢性毒性試驗的結(jié)果以試驗期間測定結(jié)果的時間加權(quán)平均值0.017 8 mg·L表示。

表5 慢性毒性試驗中丁氟螨酯的濃度變化Table 5 Analysis results of cyflumetofen concentration in chronic toxicity test

在急性毒性試驗中，空白對照組的大型溞活動正常，無一死亡。經(jīng)測定，丁氟螨酯對大型溞的48 h-EC為>0.011 5 mg·L(表6)，參照GB/T 31270.13—2014《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準(zhǔn)則 第13部分：溞類急性活動抑制試驗》和NY/T 3273—2018《難處理農(nóng)藥水生生物毒性試驗指南》，認(rèn)為丁氟螨酯在溶解度范圍內(nèi)對大型溞的活動無毒性效應(yīng)。Target 1(B-2)和Met-1對大型溞的48 h-EC分別為>0.031 5 mg·L和>0.032 8 mg·L，與母體毒性類似，在溶解度范圍內(nèi)，大型溞活動正常，無一死亡。B-1和B-3對大型溞的48 h-EC均大于133 mg·L，A-2、AB-1 dimer、AB-1和AB-11對大型溞的48 h-EC分別為7.20、0.000 127、1.71、0.316 mg·L，95%置信區(qū)間分別為6.90～7.51、0.000 106～0.000 151、1.56～1.87、0.297～0.335 mg·L。依據(jù)GB/T 31270.13—2014《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準(zhǔn)則 第13部分：溞類急性活動抑制試驗》的毒性分級標(biāo)準(zhǔn)，B-1和-B-3對大型溞的急性毒性為低毒，A-2和AB-1為中毒，AB-11為高毒，AB-1 dimer為劇毒?？梢?，丁氟螨酯代謝物中AB-1 dimer的急性毒性大于母體。

表6 基于半靜態(tài)法測得的丁氟螨酯及其代謝物對大型溞的EC50(48 h)Table 6 EC50 values (48 h)of cyflumetofen and its metabolites to Daphnia magna Straus by semi-static method

在為期21 d的慢性毒性試驗中，空白對照組和溶劑對照組在整個試驗過程中親溞死亡率均為0，且每只親溞的初次生殖時間、生殖總胎數(shù)、所產(chǎn)存活幼溞總數(shù)和體長的毒性數(shù)據(jù)均無顯著差異。依據(jù)文獻[11]提出的數(shù)據(jù)處理要求，將空白對照組和溶劑對照組平行合并后作為對照組與試驗組進行分析(表7)。方差分析結(jié)果顯示，丁氟螨酯最大溶解度處理組的每只親溞初次生殖時間、生殖總胎數(shù)、所產(chǎn)存活幼溞總數(shù)和體長與對照組相比差異均不顯著(>0.05)，21 d內(nèi)的無可觀察效應(yīng)濃度(NOEC)>0.017 8 mg·L，說明在丁氟螨酯溶解度范圍內(nèi)的持續(xù)暴露對大型溞繁衍的影響極小。

表7 丁氟螨酯對大型溞的慢性毒性試驗結(jié)果Table 7 Chronic test result of cyflumetofen to Daphnia magna Straus

由于慢性毒性試驗花費時間較長，對試驗的條件要求也較高，人力物力消耗較大，近年來又發(fā)展出利用固定因子來評估有害物質(zhì)在環(huán)境中慢性影響的方法，即急慢性毒性比值(ACR)。根據(jù)文獻報道，當(dāng)缺乏慢性毒性數(shù)據(jù)時，在環(huán)境風(fēng)險評估中可采用ACR來預(yù)測安全濃度。一般地，判斷水生生物毒性的ACR推薦值在100，大于該推薦值時，可認(rèn)為相對安全。本研究選擇可獲得大型溞急性毒性數(shù)據(jù)EC(10%抑制濃度)和EC的A-2、AB-1 dimer、AB-1、AB-11計算ACR值(48 h-EC與48 h-EC的比)，分別為1.60、0.235、1.74和1.33(表8)，均遠小于推薦值。

表8 A-2、AB-1 dimer、AB-1和AB-11對大型溞的急慢性毒性比值Table 8 Acute-chronic toxicity ratio of A-2，AB-1 dimer，AB-1 and AB-11 to Daphnia magna Straus

3 討論

急性毒性試驗是對化學(xué)物進行安全性評價的第一手資料，在不同類型化學(xué)物的法規(guī)程序中一般為必做試驗。農(nóng)藥代謝物是評價農(nóng)藥生態(tài)環(huán)境風(fēng)險的重要指標(biāo)。Sinclair等收集了37種農(nóng)藥及其89種降解產(chǎn)物的毒性數(shù)據(jù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，70%的降解產(chǎn)物的毒性與母體化合物毒性相近或更小，30%的降解產(chǎn)物的毒性大于母體化合物，甚至有的降解產(chǎn)物毒性比母體高出一個數(shù)量級。本研究表明，丁氟螨酯代謝物AB-1 dimer對大型溞急性活動的48 h-EC為0.000 127 mg·L，毒性大于母體。

丁氟螨酯在水環(huán)境中的降解半衰期為0.9～2.2 d(降解率大于90%)，降解迅速，其主要代謝物為B-1和B-3。B-1和-B-3在水中溶解度較高，殘留時間較長，但其對大型溞活動無顯著影響。Sinclair等研究表明，即使降解產(chǎn)物的毒性小于母體化合物，但是若降解產(chǎn)物的環(huán)境行為與母體化合物有很大的差異，比如降解產(chǎn)物比母體化合物具有更大的淋溶性，那樣仍然會帶來比母體化合物更大的風(fēng)險。

生長發(fā)育狀況和繁殖能力是評價農(nóng)藥對大型溞慢性毒性的敏感指標(biāo)，也是評估生物種群增長能力的主要參數(shù)。本研究表明，大型溞暴露于丁氟螨酯21 d的無可觀察效應(yīng)濃度大于0.017 8 mg·L，對大型溞生長和繁殖無抑制效應(yīng)。諸多研究表明，丁氟螨酯在水環(huán)境中降解快，這可能導(dǎo)致其毒性降低。但目前，關(guān)于丁氟螨酯代謝物對大型溞慢性毒性效應(yīng)的研究甚少，本研究將為評價丁氟螨酯代謝物的生態(tài)風(fēng)險提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

一般而言，當(dāng)缺乏慢性毒性試驗結(jié)果時，可通過ACR值來推測慢性毒性的值。本研究基于A-2、AB-1 dimer、AB-1和AB-11的急性毒性數(shù)據(jù)計算得到的ACR值為0.235～1.60。不同物質(zhì)對大型溞的ACR值差異較大，故在缺乏慢性毒性數(shù)據(jù)時，采用ACR值來預(yù)測安全濃度需謹(jǐn)慎。

綜上所述，本研究結(jié)果可為丁氟螨酯環(huán)境風(fēng)險的表征提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支持。目前，關(guān)于丁氟螨酯代謝物毒性的研究尚不深入，今后應(yīng)進一步研究其對其他營養(yǎng)級水生生物的毒性效應(yīng)，以及在環(huán)境中的安全性。