劉莉莉，高何璇 ，楊亞文，包瑩瑩，何玉琴，*，楊志杰，陳衛(wèi)剛，葛文博

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學 生命科學技術(shù)學院，甘肅 蘭州 730070；2.蘭州銀行 網(wǎng)絡金融部，甘肅 蘭州 730070；3.甘肅農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學院，甘肅 蘭州 730070)

高原甘加藏羊是典型的季節(jié)性發(fā)情哺乳動物，生活在甘南藏族自治州海拔2 800 m以上的青藏高原天然草場高寒牧區(qū)，是甘肅優(yōu)良的地方品種，也是我國寶貴的畜牧資源。甘加藏羊2.5歲開始配種，發(fā)情周期平均為(16±2)d，每年產(chǎn)羔一次，每次一羔，繁殖率低，影響了藏羊農(nóng)牧業(yè)的快速發(fā)展。因此，研究與藏羊繁殖生理活動有關的生殖激素的調(diào)控作用機理，提高繁殖率擴大種群內(nèi)優(yōu)秀種羊數(shù)量，對甘肅草地畜牧業(yè)的發(fā)展具有非常重要的意義。

甲狀腺激素(thyroid hormone，TH)包括三碘甲腺原氨酸 (triiodothyronine，T3)、四碘甲腺原氨酸 (thyroxine，T4)。TH 通過其特異性受體THRβ(thyroid hormone receptor β，THRβ)對動物生長發(fā)育、生殖活動等具有重要的調(diào)控作用。THRβ屬于核受體超家族成員。有文獻報道，THRβ在人和嚙齒類動物下丘腦弓狀核、室旁核、視上核及腹正中核等與生殖和代謝有關的核團上有特別高的表達，在黃金倉鼠整個發(fā)育過程中下丘腦、垂體、睪丸、卵巢有THRβ的表達。T3可以通過THRβ對下丘腦的黑色素瘤轉(zhuǎn)移抑制基因()表達和親吻素(kisspeptin)的蛋白表達產(chǎn)生影響，而基因通過其特異性G蛋白偶聯(lián)受體54(GPR54)直接作用于GnRH神經(jīng)元調(diào)控GnRH的脈沖釋放，進而影響促卵泡素(FSH)和促黃體素(LH)的分泌，對哺乳動物初情期的啟動，發(fā)情排卵等生殖活動發(fā)揮著重要作用。以上報道提示，TH及THRβ參與調(diào)控哺乳動物的繁殖活動。但目前有關TH及其THRβ對甘加藏羊繁殖活動的調(diào)控研究尚未見報道。本研究首次從基因和蛋白水平對甘加藏羊發(fā)情周期和乏情期松果體、HPO軸組織中mRNA及其蛋白的表達和分布規(guī)律進行了研究，以期為進一步闡明TH對藏羊生殖活動的調(diào)控及其機理研究提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與樣品采集

在甘加藏羊非繁殖季節(jié)(3—4月)和繁殖季節(jié)(7—9月)，于甘肅省甘南藏族自治州夏河縣甘加鄉(xiāng)海拔2 800 m以上的藏綿羊養(yǎng)殖合作社隨機選擇2.5～3.5歲雌性健康且未孕的雌性甘加型藏綿羊30只，分為5組，每組6只。在藏羊繁殖季節(jié)，參照四期分法，根據(jù)公羊爬跨試情以及陰道脫落細胞圖片觀察，將發(fā)情周期分為發(fā)情期(0—36 h)、發(fā)情后期(39—72 h)、間情期(4—13 d)、發(fā)情前期(14—16 d)。在藏羊非繁殖季節(jié)，確定乏情期為試驗對照組。采用頸部局部麻醉頸動脈放血法無痛處死試驗羊，將處死的試驗羊迅速解剖，取出各時期松果體、下丘腦、垂體、卵巢等組織。將所取組織平均分為2份：一份置于液氮速凍后移至-80 ℃冰箱，備用；另一份置于4%多聚甲醛中固定，備用。

1.2 甘加藏羊松果體和HPO軸組織THRβ mRNA檢測

依照RNA提取試劑盒(北京，TransGen)說明書實驗流程進行操作，分別提取甘加藏羊發(fā)情周期和乏情期松果體、下丘腦、垂體和卵巢組織中的總RNA，并測定RNA濃度和純度，將測定好的總RNA溶液分別稀釋至500 ng·μL。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京，TransGen)，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA鏈。根據(jù)NCBI中綿羊和-mRNA CDS區(qū)序列利用Primer Premier 5.0軟件進行引物設計，并由上海生工生物科技有限公司合成引物(表1)。以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，RT-qPCR反應總體系為20 μL：模板1 μL，上、下游引物各0.8 μL，2×TransStartm Tip Green qPCR SuperMix 10 μL，ddHO 7.4 μL。每個樣品設3個重復。擴增條件：95 ℃預變性30 s；94 ℃變性5 s，60 ℃ 退火延伸30 s，循環(huán)次數(shù)45次。所得相關數(shù)據(jù)用2方法進行計算，每個基因相對表達量均以內(nèi)參基因為基準進行校正。所有數(shù)據(jù)均以“平均值±標準差”表示，用SPSS 26.0軟件進行單因素方差分析，顯著性水平選定為=0.05。

表1 THRβ和β-actin基因引物序列Table 1 Primers sequences of THRβ and β-actin gene

1.3 甘加藏羊松果體和HPO軸組織THRβ蛋白檢測

用蛋白裂解液(1 mL裂解液+10 μL蛋白酶抑制劑)(Bioss，北京)提取各組織總蛋白，以BCA試劑盒(Bioss，北京)測定濃度，于十二烷基硫酸鈉(sodium dodecy sulfate，SDS)上樣緩沖液中100 ℃水浴 10 min 變性蛋白，冰上靜置5 min備用。制備12%封底膠、12%分離膠和5%濃縮膠后以6 μL上樣量進行SDS-PAGE電泳，電泳完畢對照Marker預染條帶切取THRβ(53 kDa)、β-actin(42 kDa)對應條帶，濕轉(zhuǎn)法將分離膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜(Solarbio，北京)上。PBST(PBS+tween 20)(Bioss，北京)洗膜20 min，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。孵育一抗(1∶500)，4 ℃過夜。PBST洗膜4 h，37 ℃孵育二抗(1∶4 500)1 h，PBST洗膜4 h，暗室曝光成影拍照。利用Image Pro-Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)進行灰度值分析，并利用SPSS 26.0軟件進行差異性分析。

1.4 甘加藏羊松果體和HPO軸組織THRβ免疫組織化學染色

將4%甲醛固定好的松果體、下丘腦、垂體、卵巢組織包埋制作5 μm厚石蠟切片，常規(guī)脫蠟處理后微波法抗原修復10 min，再用3% HO濕盒37 ℃孵育15 min，正常山羊血清工作液(A液)37 ℃封閉15 min，THRβ一抗稀釋液(兔抗羊，1:350)，陰性對照組一抗用PBS代替，4 ℃孵育過夜后37 ℃孵育1 h，然后用生物素標記的二抗(B液，山羊抗兔IgG)37 ℃孵育15 min，再用辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素親和工作液(C液)37 ℃孵育15 min。每次孵育后均用PBS(0.01 mol·L，pH=7.4)洗滌3次，每次5 min。DAB顯色1 min，蘇木精復染1 min，返藍，脫水透明后中性樹膠封片。免疫組織化學染色結(jié)果用Motic SK210型光學顯微鏡觀察拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘加藏羊松果體、HPO軸組織中THRβ mRNA及其蛋白表達分析

RT-qPCR、Western blot檢測結(jié)果顯示，甘加藏羊發(fā)情周期和乏情期松果體、下丘腦、垂體、卵巢組織中均有mRNA和蛋白的表達，且各時期表達差異明顯(圖1和圖2)。松果體中mRNA和蛋白表達量均在乏情期最高，顯著(<0.05)高于發(fā)情周期；下丘腦中mRNA表達量在發(fā)情后期最高，與其他各時期差異顯著(<0.05)，蛋白表達量在間情期最高，與乏情期差異不顯著(>0.05)，與其他3個時期差異顯著(<0.05)；垂體中mRNA和蛋白表達量均在間情期最高，其中蛋白表達量在間情期與發(fā)情前期差異不顯著(>0.05)，其他各時期差異均顯著(<0.05)；卵巢中mRNA和蛋白表達量均在發(fā)情后期最高，與其他各時期差異顯著(<0.05)。

A，松果體;B，下丘腦;C，垂體;D，卵巢。同一系列柱上無相同字母的表示各時期mRNA或蛋白的相對表達量差異顯著(P<0.05)。A，Pineal gland;B，Hypothalamus;C，Pituitary;D，Ovary.Bars marked without the same letters on the same series indicated significant differences in the relative expression of mRNA or protein at different periods at P<0.05.圖1 甘加藏羊發(fā)情周期和乏情期松果體和HPO軸組織中THRβ mRNA和蛋白相對表達量Fig.1 Relative expression of THRβ mRNA and protein in Pineal gland and HPO axis during estrus cycle and anestrus of Ganjia Tibetan sheep

2.2 THRβ免疫陽性反應產(chǎn)物在甘加藏羊松果體和HPO軸組織中的分布

免疫組化試驗結(jié)果顯示，松果體、HPO軸組織中THRβ免疫反應產(chǎn)物為黃色或棕黃色，分布細胞漿和細胞核，所有對照組試驗的標本均呈陰性，證明所用抗體具有THRβ免疫反應的特異性。

THRβ免疫陽性產(chǎn)物松果體組織中主要分布在松果體細胞胞漿(圖3中A～E)，細胞呈卵圓形或圓形，其中在發(fā)情后期(圖3中C)著色深、強陽性表達。下丘腦組織中THRβ主要分布在神經(jīng)膠質(zhì)細胞、大神經(jīng)元胞體和椎體細胞胞漿中有陽性表達(圖3中F～J)，其中在發(fā)情前期(圖3中F)和發(fā)情期(圖3中G)陽性表達強，染色深。在腺垂體組織中，THRβ主要分布在嗜酸性和嗜堿性細胞胞漿(圖3中K～O)，其中在發(fā)情期(圖3中L)弱著色，在其它四個時期有強陽性表達、濃染。卵巢組織中，THRβ免疫陽性細胞在卵泡顆粒層、卵泡內(nèi)膜、黃體細胞中均有分布(圖3中P～T)，其中在顆粒層細胞和黃體細胞免疫陽性產(chǎn)物著色深，高表達。

3 結(jié)果與討論

本研究結(jié)果表明，甘加藏羊發(fā)情周期各個時期和乏情期mRNA及其蛋白在松果體 和HPO軸組織中的相對表達量呈動態(tài)變化，且存在一定的差異，這種表達的差異從基因和蛋白水平證明了THRβ參與甘加藏羊生殖調(diào)控，為進一步研究甲狀腺激素及其受體對動物生殖生理活動的調(diào)控機制提供了科學的參考依據(jù)。

3.1 甘加藏羊松果體組織中的THRβ表達對藏羊繁殖的影響

PE，發(fā)情前期；E，發(fā)情期；ME，發(fā)情后期；DE，間情期；AE，乏情期。PE，Proestrus;E，Estrus;ME，Metestrus;DE，Diestrus;AE，Anestrus.圖2 甘加藏羊發(fā)情周期和乏情期松果體、HPO軸中THRβ的蛋白含量Fig.2 Content of THRβprotein in pineal gland and HPO axis during estrus cycle and anestrus of Ganjia Tibetan sheep

松果體是動物體內(nèi)重要的神經(jīng)內(nèi)分泌器官，光周期和季節(jié)變化可以調(diào)節(jié)松果體節(jié)律性分泌褪黑素(MT)來調(diào)控動物的生殖等活動，MT作用于垂體結(jié)節(jié)部的促甲狀腺激素和脫碘酶解碼外界光信號，并通過血液中TH 與作用于下丘腦內(nèi)側(cè)基底部(MBH)正中隆起上的甲狀腺激素受體結(jié)合，從而激活整個HPO軸，調(diào)控HPO軸相關生殖激素的變化。有研究報道顯示，松果體分泌的MT對TH具有調(diào)節(jié)作用，張明泉等以人和大鼠作為研究對象，以對光線敏感的松果體為突破口，證實冬夏季節(jié)機體內(nèi)TH的變化與松果體的高位調(diào)節(jié)有關?？涤衩鞯韧ㄟ^去除大鼠松果體，觀察大鼠甲狀腺形態(tài)和TH分泌功能的變化，證實松果體可能通過抑制大鼠甲狀腺分泌TH來調(diào)控動物的繁殖活動。目前已有報道顯示，TH及其受體THRβ對動物的生殖活動具有調(diào)控作用，尤其在啟動和終止季節(jié)性發(fā)情哺乳動物的發(fā)情過程中發(fā)揮著非常重要的作用。本研究首次對藏羊松果體組織進行免疫組織化學染色發(fā)現(xiàn)，THRβ在甘加藏羊整個發(fā)情周期和乏情期松果體組織的松果體細胞胞漿均有陽性表達，其中在發(fā)情后期強表達。傳統(tǒng)的觀點認為，甲狀腺激素受體(THR)屬于核受體，T3 通過結(jié)合到胞核內(nèi)的THRβ 而起作用。但已有研究報道指出，在大鼠背側(cè)海馬神經(jīng)元細胞中，TH被證實可通過與胞漿內(nèi)THRβ結(jié)合，并快速激活 PI3K/AKT-mTOR 信號通路，且這種快速激活是不依賴于蛋白質(zhì)和 RNA 的合成，而本研究也證實THRβ是在甘加藏羊松果體細胞胞漿發(fā)揮其調(diào)控作用，提示TH也可產(chǎn)生非基因組效應。且mRNA及其蛋白表達量在發(fā)情前期到發(fā)情期呈現(xiàn)下降趨勢，從間情期開始呈現(xiàn)上升趨勢，在乏情期表達最高，THRβ在松果體組織中的這種動態(tài)差異表達提示其參與調(diào)控藏羊的發(fā)情周期生殖活動。

3.2 甘加藏羊HPO軸組織中的THRβ表達對藏羊繁殖的影響

雌性哺乳動物的生殖生理活動受HPO軸的調(diào)控，且有多種激素和其它因子的協(xié)調(diào)參與，其中下丘腦GnRH的脈沖式分泌是激活動物發(fā)情周期的關鍵，其脈沖釋放增加引起青春期啟動，升高的LH作用于卵巢產(chǎn)生雌二醇(E2)，促進青春期發(fā)育與成熟，對維持正常的性功能和生殖功能起重要的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，下丘腦內(nèi)注射T3能影響 LH 分泌，而LH是HPO軸調(diào)控動物季節(jié)性動情節(jié)律的關鍵激素，提示T3可能參與調(diào)控季節(jié)性發(fā)情動物的繁殖活動。已有研究證實在黃金倉鼠HPGA發(fā)育的整個過程中其下丘腦、垂體、卵巢中均有THRβ的表達。本研究結(jié)果顯示，THRβ在甘加藏羊發(fā)情周期各個時期HPO軸組織中均有表達，且不同組織THRβ的表達量有顯著差異，提示THRβ參與調(diào)控甘加藏羊的生殖活動。對下丘腦組織免疫組織化學染色發(fā)現(xiàn)，在下丘腦的神經(jīng)細胞和椎體細胞中均有THRβ陽性表達，證實下丘腦組織中THRβ是在這兩種細胞中發(fā)揮其生物學功能。研究發(fā)現(xiàn)，mRNA的相對表達量從發(fā)情前期開始呈現(xiàn)上升趨勢，在發(fā)情后期達到最大值，而蛋白表達量在間情期達到最大值?；蚝偷鞍妆磉_出現(xiàn)偏差的主要原因一方面可能是基因表達的內(nèi)源機制，另一方面可能是由于一些特殊外在環(huán)境因素所影響，比如藏羊高海拔的生存環(huán)境等可能對藏羊機體中從基因到蛋白的表達產(chǎn)生影響。已有研究證實在嚙齒動物和綿羊大部分下丘腦KISS1細胞均表達雌激素受體α(ERα)，而雌激素的反饋作用正是由下丘腦中 Kisspeptin-GPR54信號系統(tǒng)實現(xiàn)，T3可以通過THRβ對下丘腦中GT1-7神經(jīng)元細胞的1 基因表達產(chǎn)生影響，且T3缺乏可引起發(fā)育期大鼠大腦基因表達的升高，由此提示卵巢分泌的雌激素在發(fā)情后期和間情期通過調(diào)控下丘腦THRβ的表達量來影響GT1-7神經(jīng)元基因的表達進而實現(xiàn)對下丘腦 GnRH 的反饋調(diào)節(jié)，影響垂體FSH和LH的分泌，調(diào)控動物的生殖活動。

A、F、K、P，發(fā)情前期；B、G、L、Q，發(fā)情期；C、H、M、R，發(fā)情后期；D、I、N、S，間情期；E、J、O、T，乏情期。P，松果體細胞；BV，血管；GC，神經(jīng)膠質(zhì)細胞；NC，神經(jīng)元；Nu，神經(jīng)細胞核；AC，嗜酸性細胞；BC，嗜堿性細胞；CC，嫌色細胞；FA，卵泡腔；GV，卵母細胞核；LC，黃體細胞；TF，卵泡膜；SG，顆粒層。A，F(xiàn)，K，P，Proestrus;B，G，L，Q，Estrus;C，H，M，R，Metestrus;D，I，N，S，Diestrus;E，J，O，T，Anestrusl.P，Pineal cell;BV，Blood vessel;GC，Glial cell;NC，Nerve cell;Nu，Neuronuclei;AC，Acidophilic cell;BC，Basophilic cell;CC，Chromophobe cell;FA，F(xiàn)ollicular antrum;GV，Germinal vesicle;LC，Luteal cell;TF，Theca folliculi;SG，Stratum granulosum.圖3 甘加藏羊發(fā)情周期和乏情期松果體和 HPO軸組織中THRβ免疫陽性反應產(chǎn)物分布Fig.3 Location of THRβ immunoreactive products of in pineal and HPO axis of Ganjia Tibetan sheep during the estrus cycle and anestrus

垂體作為機體內(nèi)重要的內(nèi)分泌腺，接受來自下丘腦分泌的GnRH，促進 FSH和LH的分泌，進而影響卵巢性激素的合成和分泌，參與調(diào)控動物的生殖生理活動。Hodin等人在大鼠垂體中檢測到T3的功能性受體mRNA的表達。而本研究結(jié)果顯示，在垂體組織的遠側(cè)部的嗜酸性細胞、嗜堿性細胞的細胞漿中均有THRβ的陽性表達，其基因和蛋白表達量均從發(fā)情前期開始呈現(xiàn)下降趨勢，在發(fā)情期達到最小值，之后開始呈現(xiàn)上升趨勢，在間情期達到最大值，提示THRβ在垂體組織中主要在間情期的嗜酸性和嗜堿性細胞中參與調(diào)控甘加藏羊生殖活動。主要原因可能是雌激素的反饋調(diào)節(jié)。已有研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠垂體前葉中檢測到T3的功能性THRβ，而垂體前葉是負責調(diào)節(jié)促性腺激素釋放激素合成和分泌的區(qū)域，其分泌的LH是下丘腦-垂體-卵巢軸調(diào)控雌性動物發(fā)情、排卵等生殖活動的橋梁，且包瑩瑩等的研究發(fā)現(xiàn)，在藏羊垂體組織中也檢測到基因和蛋白的表達，而THRβ能誘導ERα的轉(zhuǎn)錄，接受來自性腺激素的反饋調(diào)節(jié)，再次證實本研究結(jié)果。

卵巢作為主要的雌性生殖器官，對下丘腦和垂體所釋放的生殖激素較為敏感，其釋放的E2轉(zhuǎn)而調(diào)控自身或?qū)Υ贵w和下丘腦進行反饋調(diào)節(jié)，繼而參與機體生殖過程。Vissenberg等人發(fā)現(xiàn)，在卵巢上存在甲狀腺激素受體和甲狀腺激素轉(zhuǎn)運體的表達，其通過對105篇文獻灰度總結(jié)，數(shù)據(jù)顯示甲狀腺激素水平的改變影響卵泡發(fā)育、精子生成，降低受孕率，T3 可以促進顆粒細胞增殖，并通過 PI3K/Akt信號通路抑制其凋亡。本研究對藏羊的卵巢進行免疫組織化學染色，發(fā)現(xiàn)在卵巢組織的卵泡顆粒細胞胞漿和胞核、卵泡內(nèi)膜細胞及黃體細胞胞漿中均有THRβ的陽性表達，其中在卵泡顆粒層細胞和黃體細胞胞漿有強陽性表達，提示THRβ參與調(diào)控卵泡的發(fā)育和黃體的成熟。而文獻報道顯示卵巢分泌的雌激素的反饋作用是通過Kisspeptin/GPR54信號系統(tǒng)實現(xiàn)的，而T3能通過THRβ影響1基因啟動子活性來實現(xiàn)對mRNA 表達和 Kisspeptin 蛋白表達的調(diào)控。而本研究也證實mRNA和蛋白表達量均在發(fā)情后期達到最大值，在乏情期達到最小值，由此提示卵巢中THRβ可能通過卵巢中的雌激素反饋作用于下丘腦kisspeptin，參與GnRH脈沖釋放的神經(jīng)內(nèi)分泌過程來實現(xiàn)對性腺系統(tǒng)的繁殖調(diào)控。且有研究證實在甘加藏羊整個發(fā)情周期卵巢顆粒細胞上存在雌激素受體(ERs)、KISS1和GPR54的表達。綜上所述，THRβ主要在發(fā)情后期調(diào)控甘加藏羊的生殖活動，參與調(diào)控卵泡發(fā)育和排卵等生殖活動。