陳 凡,丁能水,李奕雅,汪小東,許弟群

（1.閩南師范大學生物科學與技術學院,福建 漳州 363000；2.福建傲農生物科技集團股份有限公司,福建 漳州 363000；3.閩南師范大學體育學院,福建 漳州 363000）

聚合酶鏈式反應（polymerase cain reaction，PCR）是一種指數級擴增微量基因片段的核酸檢測技術，擁有極高的靈敏度，被廣泛應用于醫(yī)學檢測、環(huán)境監(jiān)測、轉基因食品、水產養(yǎng)殖等多個領域.以常規(guī)PCR技術為基礎，衍生出諸如多重PCR（Multiplex PCR）、實時熒光定量PCR（qPCR）、巢式PCR（Nested PCR）等技術，又進一步擴大了PCR 技術的應用范圍[1].自2020年初新冠疫情爆發(fā)以來，基于PCR 技術的“核酸檢測”，更是作為確診COVID-19 的“金標準”，為人們所熟知[2].實際應用中，由于PCR 及其衍生技術具有極高的靈敏度，故其反應過程特別是試劑混合與加樣步驟特別容易受到污染物（如陽性DNA 氣溶膠等）的干擾，得出假陽性結果.且假陽性的產生原因極難排查，更難以徹底解決，長期以來不斷困擾著廣大檢驗人員和科技工作者[3-4].因此，實驗室環(huán)境中的污染物控制一直是相關檢測穩(wěn)定性的重要影響因素.

一般情況下，若PCR 反應體系中存在dUTP，則dUTP 能與dTTP 產生競爭，摻入擴增產物中，形成帶有尿嘧啶（U）的DNA 分子.而尿嘧啶-DNA 糖基化酶（Uracil-DNA Glycosylase，UDG）能特異性地切斷DNA 分子中尿嘧啶堿基與脫氧核糖間的N-糖苷鍵，移去尿嘧啶，生成無堿基位點，在DNA 片段上挖開缺口[5].帶有缺口的DNA在隨后的PCR循環(huán)中，將無法作為完整的模板被擴增.基于這一特性，UDG被用于PCR反應中的污染控制，且效果得到了肯定[6-10].

近年來，PCR 預混液試劑盒得到普遍應用，使用時僅需加入適量引物、模板和水即可進行PCR 擴增，簡化了操作，也減少了操作過程中可能導致的污染.因此，在常規(guī)和定量PCR 實驗中，預混試劑盒已經占據了主導地位.然而，此類試劑盒中的酶和dNTP 以預混方式存在，濃度不可自由調節(jié)，若要向其中添加dUTP，實現(xiàn)抗污染效果，則與傳統(tǒng)試劑盒相比，其反應條件的優(yōu)化更加困難.實際使用中，若體系中dUTP含量過高，則DNA 聚合酶活性將受到抑制，導致擴增效率（檢測靈敏度）降低甚至完全無法擴增模板；若dUTP 含量過低，則不能保證PCR 產物中摻入足量的尿嘧啶，對UDG 活性的發(fā)揮不利[10].因此，本研究以PCR產物中A-T占比存在較大差異的鯉魚浮腫病病毒（CEV）和羅非魚湖病病毒（TiLV）核酸檢測為例，對使用PCR 預混液時，dUTP 的添加量及對應條件下UDG 的去污染效果進行了評價研究，以期為該條件下UDG抗污染手段的應用和優(yōu)化提供實驗設計和使用效果的量化參考.

1 材料與方法

1.1 感受態(tài)細胞、工具酶與試劑

化學感受態(tài)細胞DH5α（E.coliDH5α，轉化效率>5×108cfu/μg）購于上海唯地生物技術有限公司.San-Prep柱式質粒DNA小量抽提試劑盒，4S Red Plus核酸染色劑，DNA分子量標準Marker（100～5 000 bp），瓊脂糖，SanTaq Plus PCR 擴增試劑盒（下文簡稱“SanTaq”），SGExcel UltraSYBR Master 預混液，SGExcel GoldStar TaqMan Master 預混液等，購于生工生物工程（上海）股份有限公司.2×Rapid Taq Master Mix（下文簡稱“RapidTaq”），E.coliUDG（5 U/μL），dUTP（100 mM）等，購于南京諾唯贊生物科技股份有限公司.2×HLingene PCR Master Mix（下文簡稱“HLTaq”）購于上?；萘枭锛夹g有限公司.引物合成與質粒測序委托蘇州金唯智生物科技有限公司進行.若無特殊說明，各試劑使用時均嚴格按照對應的說明書要求進行操作或設置反應條件.

1.2 陽性質粒與引物

陽性質粒pUC19-CEV和pUC19-TiLV均由本課題組構建并保存.CEV陽性質粒包含鯉魚浮腫病病毒的P4a 蛋白基因保守序列以及5′UTR 序列[11]，TiLV 陽性質粒包含羅非魚湖病病毒基因的保守序列[12].質粒結構及檢測中使用的引物結合位點與擴增片段長度如圖1所示，對應的引物序列如表1所示.質粒提取過程嚴格按照抽提試劑盒說明書進行.以TE緩沖液溶解純化后的質粒分子，并采用NanoDrop 2000c超微量分光光度計（thermo fisher）測定其濃度.

表1 本研究使用的引物Tab.1 Primers used in this study

圖1 本研究使用的陽性質粒結構及對應的引物結合位點示意圖Fig.1 Schematic representation of the positive plasmid structures and corresponding primer binding sites used in this study

1.3 PCR條件與步驟

本研究使用的PCR 反應條件為，（1）常規(guī)PCR（SanTaq、HLTaq、RapidTaq）：95 ℃（120 s）→95 ℃（15 s）→55 ℃（15 s）→72 ℃（SanTaq 和HLTaq 為1 000 bp/min，RapidTaq 固定為5 s，35 循環(huán)）→72 ℃（120 s）→10 ℃（Hold）；（2）染料法qPCR（SGExcel UltraSYBR）：95 ℃（180 s）→95 ℃（15 s）→55 ℃（20 s）→72 ℃（30 s，40循環(huán)）；（3）探針法qPCR（SGExcel GoldStar TaqMan）：95 ℃（180 s）→95 ℃（20 s）→60 ℃（30 s，40循環(huán)）.其中常規(guī)PCR 使用GE9612T-S 基因擴增儀（杭州柏恒科技有限公司）完成，熒光定量PCR 使用QuantStudio?6實時熒光定量PCR系統(tǒng)（Applied Biosystems）完成.

巢式PCR步驟，（1）CEV：使用“BF+BR”引物組擴增模板中的528 bp片段，經瓊脂糖凝膠電泳確認能夠擴增出特異性DNA 條帶的樣品，以TE 緩沖液將第一輪擴增產物稀釋1 000 倍，作為第二輪反應的模板.再使用“IF+IR”擴增第二輪模板中的478 bp 片段，并通過瓊脂糖凝膠電泳（1.5%，下同）檢測特異性條帶.若第一輪擴增后無法檢測到特異性條帶，則直接使用該產物（不稀釋）作為模板進行第二輪擴增并檢測.（2）TiLV：除引物外，檢測與模板準備步驟與CEV一致，第一輪使用引物組“Nested ext-1+ME1”，擴增產物共415 bp；第二輪使用引物組“ME1+ME2”，擴增產物共250 bp.

熒光定量PCR：取待測DNA 作為模板，直接通過SYBR Green 染料法或TaqMan 探針法進行定量檢測，每個樣品使用3個復孔.此外，為便于數據比較并提高實驗的穩(wěn)定性，在各標準曲線的建立過程中，均以全長質粒作為擴增模板.

1.4 Taq酶對dUTP的耐受性檢驗

向PCR反應體系中添加不同濃度的dUTP溶液，形成特定的dUTP濃度梯度，再利用各PCR預混液對pUC19-CEV 和pUC19-TiLV 質粒的巢式第一輪陽性片段進行擴增，并利用瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結果，以確認dUTP濃度對PCR反應的影響.

1.5 UDG反應條件

按照特定的實驗設計，將同一擴增條件下得到的PCR 產物分裝若干份，并向每份PCR 產物中添加一定量的UDG，對反應體系進行漩渦混勻，再將混合液以2 000 g離心15 s，隨后轉移到水浴鍋或PCR 儀內，37 ℃孵育10 min，使UDG 充分發(fā)揮作用，降解底物.最后將孵育溫度提升至95 ℃，維持2 min，對UDG 進行滅活處理.經UDG 處理后的PCR 產物，可通過瓊脂糖凝膠電泳進行半定量評價，或以TE 緩沖液稀釋1 000倍后，以qPCR法對降解效果進行定量評價.

1.6 UDG對模板DNA降解效果的評價

電泳法：使用PCR預混液以及不同的巢式引物對CEV和TiLV陽性片段進行擴增.隨后參照方法1.5，使用不同的UDG濃度對擴增產物進行處理.再對處理后的PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測.

染料法qPCR：使用特定PCR 預混液和引物組擴增pUC19-CEV（擴增用引物組為“BF+BR”）或pUC19-TiLV（擴增用引物組為“Nested-ext1+ME1”）質粒中的陽性DNA 片段，再采用不同濃度的UDG 對PCR產物進行降解，最后將降解產物以TE緩沖液稀釋1 000倍，作為qPCR模板，配合巢式引物上機檢測.檢測時使用基于SYBR Green的熒光染料和ROX參比作為熒光定量依據.

探針法qPCR：使用特定的PCR 預混液和引物組擴增pUC19-CEV（擴增用引物組為“BF+BR”）或pUC19-TiLV（擴增用引物組為“SF+SR”）中的陽性DNA 片段，并采用不同濃度的UDG 對PCR 產物進行降解，再將降解產物以TE緩沖液稀釋1 000倍后，作為qPCR模板，配合探針法引物上機檢測.檢測時使用基于FAM-BHQ1的探針和ROX參比作為熒光定量依據.

1.7 統(tǒng)計學處理

所有數據使用Minitab v17.0 軟件進行數值統(tǒng)計.熒光定量PCR 復孔檢測結果的Ct 值以“平均值±標準差”表示（由于qPCR 數據的平均值遠大于標準差，使各檢測結果的CV 值均小于1%，故圖5-6 不對標準差進行繪制），利用線性回歸得到不同模板添加量對應的回歸方程與決定系數后，根據回歸方程反推待測樣品中的模板含量并進行相互比較與計算.

2 結果與討論

2.1 Taq酶對dUTP的耐受性分析

不同Taq酶對dUTP作為反應底物的耐受性實驗結果如圖2所示.由圖中的電泳條帶可見：SanTaq和HLTaq的擴增產量均隨著反應體系中dUTP濃度的增加而呈現(xiàn)降低趨勢.更為明顯的是，RapidTaq對體系中dUTP 的存在完全不耐受，僅向反應體系中添加100 μmol/L 的dUTP 即可完全抑制其活性.因此，后續(xù)實驗不再以RapidTaq為實驗材料展開進一步探討.反觀SanTaq和HLTaq對應的實驗結果，可以發(fā)現(xiàn)：在檢測CEV基因時，若dUTP濃度達到400 μmol/L，則SanTaq的擴增效率顯著降低；若dUTP濃度達到800 μmol/L，則HLTaq 的擴增性能也有明顯下降.而檢測TiLV 基因時，dUTP 對兩種酶特別是HLTaq 擴增性能的影響則相對較小.這一現(xiàn)象產生的原因可能在于：CEV模板中A-T堿基的占比為68.4%，遠高于TiLV的50.6%（圖1），導致CEV模板擴增過程中Taq酶與dUTP的相互作用更為頻繁.

圖2 三種Taq酶對dUTP的耐受性實驗結果Fig.2 Experiment results of the dUTP tolerance with three Taq DNA polymerase

為確保PCR 體系中加入的dUTP 不對擴增效率產生較大干擾，本研究以近年來參與全國水生動物防疫系統(tǒng)實驗室檢測能力驗證的檢驗數據為基礎，計算得到：標準核酸抽提手段下，病魚樣本中能夠提取到的CEV陽性DNA模板濃度最小值約等價于pUC19-CEV質粒0.022 pg/μL；病魚中的TiLV陽性RNA經逆轉錄后，對應的DNA模板濃度最小值約等價于pUC19-TiLV質粒0.007 pg/μL.因此，本研究考察了陽性質粒用量0.2 pg/μL 以及0.002 pg/μL 情況下，dUTP 濃度梯度對兩種Taq 酶擴增效果的影響，結果（圖3）表明：（1）dUTP用量不超過200 μmol/L時，兩種酶在高低兩種模板濃度下的擴增效果受dUTP影響較?。唬?）dUTP用量不超過800 μmol/L時，即使在低模板濃度下，兩種酶也能通過PCR擴增準確判斷陽性模板的存在.其中，HLTaq 在dUTP 濃度達到1 800 μmol/L的情況下，對低濃度模板依然有效.為便于橫向比較，后續(xù)統(tǒng)一以200 μmol/L的dUTP濃度為基本反應條件，展開進一步研究.

2.2 UDG用量對模板降解效果的影響（電泳法）

UDG 用量對模板降解效果的影響如圖4所示.通過對圖4A-D 組結果的分析，可知：（1）UDG 對不含U 的底物不產生降解，可認為UDG 在本研究使用的反應條件下無非特異活性；（2）不同UDG 濃度對含U的底物均產生了極其顯著的降解效果，且可以認為：隨著UDG 濃度的升高，降解效果愈發(fā)理想（降解產物的分子量均一性逐漸提高）.但對比圖中展示的各電泳結果，也能看出：UDG 用量超過0.2 U/10 μL 時（即試劑說明書推薦的最低用量），降解效果未隨用量的提高而發(fā)生顯著變化.

圖4 不同UDG濃度對各PCR產物的降解效果Fig.4 Amplicon degradation by UDG concentration gradient

2.3 UDG用量對模板降解效果的影響（染料法qPCR）

以qPCR（染料法）對UDG的降解效果進行定量評價，結果如圖5所示（因同組實驗中任意兩個數據均存在顯著差異，故圖中不再額外標記）.當使用0.05、0.2、1 U/10 μL 三種濃度的UDG 處理同一PCR 產物時，不論擴增模板是CEV 還是TiLV 陽性片段，也不論使用了何種預混液，UDG 均表現(xiàn)出良好的降解效果.僅在0.05 U/10 μL的用量下，其模板的平均降解水平就可達99.9%左右；若提高UDG用量至1 U/10 μL，則平均降解水平可上升至99.98%左右.

從本組結果可推導如下結論：（1）UDG 對幾種含U 模板均有顯著降解效果，若使用0.2 U/10 μL 的UDG，則降解效率通常在99.95%以上.（2）從降解效率分析，與0.2 U/10 μL 的UDG 濃度相比，若僅使用0.05 U/10 μL，其作用效果明顯下降；若使用1 U/10 μL 的UDG 濃度，則效率提高有限或不提高.（3）使用SanTaq 擴增的產物，其降解效率普遍高于HLTaq，其原因可能在于：1)同條件下，SanTaq 可能更容易將dUTP 摻入終產物，有利于UDG 發(fā)揮作用；2)SanTaq反應體系的配方（如緩沖液濃度、pH 值等）對UDG 的活性更為友好；3)SanTaq擴增效率較HLTaq更低，在酶活相同的情況下，更低的底物濃度對反應完全更為有利.但具體由哪個因素主導，仍有待進一步研究.

2.4 UDG用量對模板降解效果的影響（探針法qPCR）

以qPCR（探針法）對UDG的降解效果進行定量評價，其實驗結果如圖6所示（因同組實驗中任意兩個數據均存在顯著差異，故圖中不再額外標記），當使用由低到高三種UDG濃度處理同一PCR產物時，其結果與圖5相似——不同的UDG濃度均能在本組實驗中展現(xiàn)出對模板的降解效果.

圖5 不同UDG濃度對不同PCR產物降解效果的定量分析(qPCR染料法)Fig.5 SYBR Green based quantitative evaluation of amplicon degradation by UDG concentration gradient

圖6 不同UDG濃度對不同PCR產物降解效果的定量分析(qPCR探針法)Fig.6 TaqMan based quantitative evaluation of amplicon degradation by UDG concentration gradient

與染料法qPCR檢測不同的是：利用qPCR（探針法）檢測特定目標時，為保證擴增效率，通常要求擴增的片段小于200 bp[16].但更短的片段意味著更低的尿嘧啶摻入概率，勢必對UDG的作用效果產生影響.因此，本組實驗的結果明顯可見：（1）與圖5所示數據相比，當擴增產物較短時（探針法CEV 產物為76 bp，TiLV產物為67 bp），UDG對潛在污染物的降解效率有明顯下降.即便使用較高的UDG濃度，其CEV模板降解效率也只能達到99.9%左右，相比染料法的結果降低了約10 倍，且這一現(xiàn)象在TiLV 模板的降解中（最高降解率僅98.438%）更為明顯.因此，可認為過短的產物對UDG的降解作用不利.（2）使用探針法檢測時，CEV模板（A-T：65.8%）降解效率明顯高于TiLV模板（A-T：50.7%），可見底物的A-T含量對UDG活性的影響很大，含量越高則UDG 作用效果越好.（3）本組實驗數據顯示HLTaq 擴增產物的降解效率高于SanTaq，與圖5所示結論相反.推測其原因可能在于：探針法檢測過程中，熒光信號的強弱不單取決于擴增反應本身，探針分子與模板的結合能力也至關重要.且探針分子只能選擇性地結合DNA雙鏈中的某一鏈，故探針分子中腺嘌呤（A，能夠與模板中的T或U配對）的數量與分布就可能對反應過程中的熒光信號產生較大影響.而通過分析CEV 探針（qProbe）和TiLV 探針（TiLV-P1）的序列，可以發(fā)現(xiàn)其中A 的占比均小于整個陽性模板的均值.特別是TiLV-P1 中，A 占比僅5.6%，遠低于探針法擴增區(qū)域中的20.9%，故檢測時可能呈現(xiàn)出與染料法不一致的結果.因此，在UDG 對底物的降解效率評價中，染料法的實驗結果可能更具有參考價值.（4）HLTaq擴增產物，在UDG用量為0.05 U/10 μL時，降解效率遠不及0.2 U/10 μL以上的條件，也從另一方面佐證了SanTaq的反應體系配方對UDG活性的表達更為有利，即使用HLTaq擴增檢測模板時，需使用較高（過量）的UDG濃度，才能達到理想的效果.

3 結語

UDG 屬于生物進化過程中較為保守的DNA 修復酶系，是由六個亞家族組成的蛋白質超家族.除了其自身獨特的生物學功能外，在PCR反應中，UDG通常被用于DNA殘留污染的清除.

（1）UDG 的實際作用效果受到擴增產物大小、產物中A-T 堿基比例，以及Taq 酶自身對反應體系中dUTP濃度耐受的影響.總體而言，擴增產物越長，產物中A-T堿基對越多，Taq對dUTP耐受性越好的情況下，越有利于UDG 的抗污染作用.故使用UDG 作為抗污染試劑前，建議根據具體實驗材料，首先進行預實驗，摸索得到較好的反應條件后，再鋪開后續(xù)的研究或檢測工作.

（2）使用SanTaq 和HLTaq 兩種PCR 預混液試劑盒作為檢測工具時，向反應體系中添加200 μmol/L 的dUTP，并使用0.2 U/10 μL 的UDG 濃度清除潛在陽性污染物，是一種比較適宜的條件（僅使用HLTaq，則dUTP濃度可進一步提高）.在這一條件下，若進行常規(guī)PCR，則UDG對污染物的清除效率在99.9%以上，且多數情況高于99.95%.若實驗環(huán)境中僅存在輕度污染，UDG 能夠較好地發(fā)揮作用.若使用qPCR（探針法）作為檢測手段，則同樣條件下污染物的清除率只能達到96.5%以上，對于高靈敏度的qPCR體系，這一清除率則略顯不足.但值得注意的是：研究中使用了陽性片段的降解產物作為模板進行定量評價.事實上，此類降解產物中仍不乏能夠正常結合引物或探針的片段，只是模板斷裂后擴增效率大幅下降而已，但其仍具備誘導產生熒光信號的能力.故可認為：本研究中UDG 的降解效率實際上優(yōu)于qPCR 法的定量檢測結果.若需要更為準確地評價UDG的作用效果，則必須借助數字PCR等更為先進的檢測工具.

（3）鑒于UDG 的作用特點，若污染物不含或少含尿嘧啶堿基，則其難以發(fā)揮作用.因此，在實際操作中，其抗污染能力是有一定限度的，操作人員除了添加dUTP和UDG作為抗污染手段外，更應該注意養(yǎng)成良好的操作習慣，并注意加強實驗室標準化管理，才能確保檢測的準確度.

本研究系統(tǒng)地分析了以PCR預混液試劑盒為檢測工具時，UDG 酶在CEV 和TiLV 檢測中的抗污染作用，一方面總結得出了檢測時較為適宜的dUTP和UDG 用量，另一方面也為特定條件下UDG 對污染性模板的清除率做了定量統(tǒng)計，能為該技術的具體應用與進一步優(yōu)化提供實驗依據.