莊 輝

北京大學(xué) 醫(yī)學(xué)部，北京 100191

1 HBV大表面蛋白(large HBV surface protein，LHBs)、中表面蛋白(middle HBV surface protein，MHBs)、小表面蛋白(small HBV surface protein，SHBs)的基因結(jié)構(gòu)和特點

在自然條件下，HBV在冷凍電鏡下為直徑約52 nm的球狀顆粒[1-2]，其外膜由3種外膜蛋白和不同脂類組成，包裹20面體核衣殼核心，該核心由240個核心蛋白亞單位組成，直徑約36 nm；病毒體偶爾也可含直徑為32 nm核衣殼核心，由180個核心亞單位組成。除病毒體外，被感染的肝細胞也分泌HBV表面蛋白的球狀顆粒(直徑為20 nm)和絲狀顆粒(圖1)。在高病毒血癥患者的血清中，表面蛋白顆粒數(shù)量一般較病毒體多1000～10 000倍。由于這些顆粒不含病毒DNA，因此無傳染性，只形成抗原血癥[3]。

圖1 HBV體和亞病毒顆粒(引自參考文獻[3])

3種HBV表面蛋白均在一個開放讀碼框(open reading frame)內(nèi)，由框內(nèi)啟動子編碼，由2個不同的mRNA翻譯：一個2.4 kb mRNA翻譯LHBs，另一個2.1 kb mRNA翻譯MHBs和SHBs，并各自由特異的啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄，通過對蛋白表達的不同調(diào)節(jié)，合成大、中、小 3種表面蛋白。LHBs mRNA的preS1啟動子含有肝臟特異性轉(zhuǎn)錄因子(即肝細胞核因子1)的結(jié)合位點[4]，其功能弱于preS/S啟動子[5]。

3種HBV表面蛋白基因由S、preS2和preS1組成，因HBV基因型不同，preS1可編碼108個、或118個、或119個氨基酸，為LHBs，在甘氨酸2位點為豆蔻?；疦末端，僅LHBs有此末端；preS2區(qū)長55個氨基酸，為MHBs，僅MHBs有乙?；疦末端；S區(qū)編碼226個氨基酸[3]，為SHBs(圖2)。

LHBs在20 nm球狀顆粒上僅占1%～2%，但在絲狀顆粒和完整病毒體中高達20%，含受體結(jié)合域，為感染肝細胞所必須，應(yīng)用核苷(酸)類似物(NUC)治療時，HBV量減少，LHBs也減少；MHBs在病毒體和2種亞單位顆粒中占5%～10%，其對HBV復(fù)制不起主要作用，在HBeAg 陽性患者中可檢測到，但在HBeAg 陰性患者中很少檢測到，表明MHBs與HBeAg表達相關(guān)；SHBs主要在HBV亞單位顆粒上，因此，NUC治療不導(dǎo)致SHBs減少[3]。

注：a，LHBs、MHBs和SHBs基因結(jié)構(gòu)；b，preS1和preS2區(qū)域結(jié)構(gòu)。感染性區(qū)(2～77 aa)；感染-干擾豆蔻酰化前S1肽與假設(shè)的結(jié)合位點重疊；受體結(jié)合位點：關(guān)鍵的結(jié)合位點(9～18 aa)，輔助的結(jié)合位點(28～48 aa)；豆蔻酰化信號區(qū)(2～9 aa)；形成外膜的關(guān)鍵區(qū)：preS1(92～108 aa)與preS2(1～5 aa)。

2 HBV LHBs、MHBs和SHBs的檢測方法

20世紀70年代初期，有研究[6-12]報告HBsAg是由若干種多肽組成，但由于研究方法不同，各報告的HBsAg多肽數(shù)量及其分子量不完全一致。1984、1987年，Heermann等[13-14]應(yīng)用單克隆抗體蛋白印跡試驗，發(fā)現(xiàn)HBsAg由GP42、P39、GP36、GP33、GP27和P24等 6種蛋白組成，GP42和P39為LHBs，GP36和GP33為MHBs，GP27和P24為SHBs(圖2)。單克隆抗體A18/7為LHBs特異性抗體，其僅與LHBs起免疫反應(yīng)，與MHBs和SHBs不起免疫反應(yīng)；單克隆抗體Q19/10為MHBs特異性抗體，其僅與MHBs起免疫反應(yīng)，與LHBs和SHBs不起免疫反應(yīng)。因此，目前應(yīng)用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測血清LHBs和MHBs，即分別用A18/7和Q19/10單克隆抗體包被酶標(biāo)板微孔，加入待檢血清，如果待檢血清中含有LHBs或MHBs，即與包被于酶標(biāo)板微孔中的單克隆抗體結(jié)合，再加入酶標(biāo)記的A18/7或Q19/10單克隆抗體(A18/7-HRP或Q19/10-HRP)，形成“包被抗體-抗原-酶標(biāo)抗體”復(fù)合物，最后加入顯色劑顯色。根據(jù)顏色深淺度判定LHBs或MHBs含量。SHBs為間接計算獲得，即總HBsAg量減去LHBs和MHBs量[15-19]。

3 檢測血清HBV LHBs、MHBs和SHBs的臨床意義

3.1 LHBs、MHBs和SHBs水平與HBV基因型有關(guān) Peiffer等[20]對德國HBeAg陰性(HBV DNA<100 000 IU/mL、ALT<2倍正常值上限)A～E基因型慢性乙型肝炎(CHB)患者血清LHBs、MHBs和SHBs組成進行了比較，除B基因型LHBs比例高于MHBs以外，A、C、D、E基因型MHBs比例均高于LHBs；B基因型LHBs比例高于其他基因型；D基因型MHBs比例最高(圖3)。

圖3 HBV A～E基因型患者LHBs、MHBs和SHBs組成比較(引自參考文獻[20])

Rinker等[17]比較了21例B基因型和49例C基因型HBeAg陽性CHB患者，B基因型患者LHBs比例較C基因型高2倍以上(13% vs 6%)。Pfefferkorn等[16]分析46例D和C基因型HBeAg陰性CHB患者血清LHBs、MHBs和SHBs組成，D基因型CHB患者LHBs和MHBs比例(7.1%±3.5%、3.1%±2.2%)均高于A基因型(5.4%±2.4%、2.4%±1.7%)，與Peiffer等[20]報告基本一致。

3.2 LHBs和MHBs消失可預(yù)測急性乙型肝炎康復(fù) Gerken等[21]對20例急性乙型肝炎患者動態(tài)檢測總HBsAg、LHBs和MHBs，其中16例檢測到LHBs，15例檢測到MHBs。其中，1例首份血清標(biāo)本LHBs陽性但MHBs陰性患者，于發(fā)病后1周內(nèi)HBeAg和總HBsAg均消失；50%的患者于發(fā)病后1周內(nèi)MHBs陰轉(zhuǎn)，50%的患者于發(fā)病后4周內(nèi)LHBs陰轉(zhuǎn)，所有MHBs和LHBs轉(zhuǎn)陰患者總HBsAg均消失，表明為自限性急性乙型肝炎。對1例無并發(fā)癥急性乙型肝炎患者的系列血清標(biāo)本動態(tài)檢測HBV DNA、HBeAg、抗-HBe、LHBs、MHBs和總HBsAg，結(jié)果顯示，發(fā)病第1天即可檢測到HBV DNA、HBeAg、LHBs、MHBs和總HBsAg，于發(fā)病后第3周和第4周MHBs和LHBs先后轉(zhuǎn)陰，于發(fā)病后第4周HBV DNA檢測不到，第18周總HBsAg消失(圖4)。因此，MHBs和LHBs消失可預(yù)測急性乙型肝炎康復(fù)。Pfefferkorn等[19]報告，相較于LHBs，MHBs可以更早地預(yù)測HBsAg消失，與Gerken等[21]報告一致。

圖4 1例無并發(fā)癥急性乙型肝炎患者LHBs、MHBs和HBsAg動態(tài)變化(引自參考文獻[21])

3.3 LHBs和MHBs可預(yù)測CHB患者HBsAg消失 Pfefferkorn等[19]對83例CHB患者進行回顧性分析，其中64例經(jīng)NUC治療，17例總HBsAg消失；19例經(jīng)聚乙二醇干擾素α-2a(PEG-IFN-2a)治療48周，3例HBsAg消失；63例總HBsAg未消失作為對照，檢測總HBsAg消失與未消失組患者治療前和治療中血清LHBs、MHBs和SHBs水平。與總HBsAg未消失組比較，治療前，總HBsAg消失組的MHBs中位數(shù)水平較低(P=0.005)；在治療過程中，總HBsAg消失組MHBs和LHBs比例快速下降，但無血清學(xué)應(yīng)答或只有HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換的患者MHBs和LHBs比例無下降；經(jīng)NUC獲得總HBsAg消失的所有患者于治療6個月時均檢測不到MHBs，平均在總HBsAg消失前(12.8±8.7)個月MHBs即檢測不到。應(yīng)用受試者工作特征(ROC)曲線分析表明，NUC治療前MHBs比例是總HBsAg消失最早的預(yù)測指標(biāo)[ROC曲線下面積(AUC)=0.726，P=0.019]；經(jīng)PEG-IFNα-2a治療獲得總HBsAg消失的患者，其MHBs和LHBs比例的動態(tài)變化相似。本研究表明，血清MHBs定量檢測可預(yù)測NUC治療應(yīng)答。

Rinker等[17]對74例單用PEG-IFNα-2a和53例用PEG-IFNα-2a聯(lián)合拉米夫定治療HBeAg 陽性慢性乙性肝炎患者，動態(tài)檢測總HBsAg、LHBs、MHBs、SHBs水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LHBs、MHBs和SHBs預(yù)測PEG-IFNα-2a應(yīng)答并不優(yōu)于HBV DNA、HBeAg、總HBsAg，與Pfefferkorn等[19]報告一致。

Zhu等[15]對41例經(jīng)恩替卡韋治療和21例經(jīng)PEG-IFNα-2a治療的HBeAg陽性CHB患者于基線和抗病毒治療后4、12、24、36和48周定量檢測LHBs、HBsAg和HBV DNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血清LHBs水平與HBV DNA和HBsAg呈正相關(guān)(相關(guān)系數(shù)分別為0.635和0.588)；2組患者血清LHBs和HBV DNA水平下降顯著，但HBsAg下降緩慢；PEG-IFNα-2a組于治療第4周血清LHBs為88.46 ng/mL的病毒學(xué)應(yīng)答的陽性和陰性預(yù)示值分別為88.9%和100%，優(yōu)于預(yù)測恩替卡韋治療應(yīng)答；聯(lián)合LHBs、總HBsAg和HBV DNA可更好地預(yù)測病毒學(xué)應(yīng)答和血清學(xué)應(yīng)答。該結(jié)果與Rinker等[17]和Pfefferkorn等[19]報告不完全一致，可能與檢測方法不同有關(guān)。因此，需對LHBs和MHBs檢測方法進行標(biāo)準化。

3.4 治療過程中MHBs升高可能與肝細胞癌(HCC)有關(guān) Brancaccio等[18]對30例乙型肝炎肝硬化患者隨訪38(12～48)個月，其中13例發(fā)生HCC。發(fā)生HCC患者與未發(fā)生HCC患者入組時的LHBs、MHBs和SHBs中位數(shù)水平無差異；在治療過程中，發(fā)生HCC患者與未發(fā)生HCC患者的SHBs下降>25%或持續(xù)穩(wěn)定的比例相似，分別為58.3% vs 47.1%(SHBs下降>25%)和25% vs 29.4%(SHBs持續(xù)穩(wěn)定)；相反，發(fā)生HCC患者MHBs水平升高>25%比例高于未發(fā)生HCC患者，分別50% vs 11.8%(P=0.02)；發(fā)生HCC患者與未發(fā)生HCC患者的LHBs動態(tài)變化無差異。因此，在治療過程中，動態(tài)檢測MHBs可確定發(fā)生HCC的風(fēng)險，其機制尚需進一步研究。

3.5 LHBs或MHBs檢測可確定非活動期HBV感染 Pfefferkorn等[16]對14例急性HBV感染、44例非活動期HBV感染、46例HBeAg陰性CHB、68例HBeAg陽性CHB和11例HBV/HDV合并感染患者應(yīng)用preS1和preS2 ELISA法檢測LHBs和MHBs，應(yīng)用商品試劑定量檢測總的HBsAg，結(jié)果顯示，不同期HBV感染者的表面蛋白組成不同，非活動期患者的LHBs和MHBs比例低于其他各期(P<0.000 1)；HBV/HDV合并感染患者的LHBs高于其他各期(P<0.000 1)；ROC曲線分析表明，LHBs、MHBs和總HBsAg確定非活動期HBV感染的AUC分別為0.89、0.73和0.62，表明LHB和MHBs確定非活動期HBV感染的敏感度和特異度優(yōu)于HBsAg。

4 小結(jié)

總HBsAg由LHBs、MHBs和SHBs組成；LHBs、MHBs和SHBs水平與HBV基因型有關(guān)；LHBs和MHBs消失提示急性乙型肝炎康復(fù)；MHBs顯著下降可預(yù)測NUC治療應(yīng)答和HBsAg消失；治療過程中MHBs升高可能與HCC發(fā)生有關(guān)；非活動期HBV感染患者的MHBs和LHBs水平較低，用其確定非活動期HBV感染優(yōu)于總HBsAg；HBV/HDV合并感染者LHBs水平較高。但當(dāng)前，關(guān)于LHBs、MHBs和SHBs臨床意義的研究仍較少，亟需進一步探討。

利益沖突聲明：作者聲明不存在利益沖突。