槐耳制劑輔助治療肝細胞癌的作用機制及其臨床應用進展

謝鎧嶺，徐 鋒

中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院 普通外科，沈陽 110004

原發(fā)性肝癌是我國第二大疾病相關死亡原因，其中80%以上為肝細胞癌(HCC)，嚴重威脅著居民的生命和健康[1]。HCC起病隱匿，早期缺乏癥狀，絕大部分患者確診時已是中晚期，失去了手術治療機會。盡管醫(yī)療技術水平不斷提高，新的靶向藥物和免疫檢查點抑制劑等不斷涌現(xiàn)，但現(xiàn)階段我國HCC患者總體療效尚不理想，5年總體生存率不足15%[2]。因此，HCC綜合治療任重道遠。

中醫(yī)具有扶正固本、活血消癥的作用?；倍嵌嗫拙普婢彼ň淖訉嶓w。槐耳清膏是槐耳菌質發(fā)酵后的熱提取物，由10余種礦物質和多種有機成分構成，主要活性成分為蛋白多糖。槐耳顆粒即槐耳清膏顆粒劑型，已被應用于HCC的綜合治療[3-5]中，具有改善肝區(qū)疼痛、腹脹、乏力等癥狀的作用，可顯著提高HCC的治療效果。隨著研究不斷深入，發(fā)現(xiàn)其作用機理愈加復雜，內容涉及抑制細胞增殖[6-12]、誘導細胞凋亡[6-8]和自噬[13-14]、抑制細胞轉移與侵襲[15-18]、抑制血管內皮細胞增殖以阻斷新血管生成[18-19]、免疫調節(jié)作用[20-27]、增強化療敏感性[28-30]、改善肝損傷[31-32]以及調控與HCC發(fā)生發(fā)展進程相關的靶點和信號通路[10-12]等，但確切機制尚未完全闡明。故本文對槐耳在HCC中的研究進展進行總結，以期為其機制的深入研究和臨床應用提供參考。

1 槐耳抗HCC作用機制

1.1 調控HCC生物行為以及抑制周圍血管形成

1.1.1 抑制HCC細胞增殖 HCC是一種細胞周期性疾病，其發(fā)生發(fā)展與細胞增殖失控密切相關。過往的研究[6-10]證明槐耳可誘導HCC細胞周期阻滯以抑制其增殖?；倍甯嗫赏ㄟ^抑制MAPK信號通路下調細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)、CylinD、β-catenin等細胞周期調控蛋白以誘導HCC細胞G1/S期阻滯[6-8]?；倍甯嗫上抡{微小染色體維持蛋白(minichromosome maintenance protein,MMC)的表達，阻滯HCC細胞于G1/S期[9]?；倍甯噙€可上調CDK抑制劑P18的表達以誘導細胞周期G0/G1阻滯[10]。此外，還有研究[11]表明槐耳可上調HBx基因和下調CEACAM1基因表達以抑制HCC細胞增殖；槐耳清膏可下調核纖層蛋白(LaminB1)的表達并增強腎母細胞過表達基因(nephroblastoma overexpressed，NOV)水平，從而抑制HCC細胞的增殖和侵襲能力[10]；槐耳還可促進Yes相關蛋白1(Yes-associated protein 1,YAP1)細胞核移位至細胞質，從而促進YAP1的磷酸化和泛素化降解等過程以抑制HCC細胞的增殖、遷移[12]。

1.1.2 激活凋亡和自噬 細胞凋亡是癌癥發(fā)生發(fā)展進程中的一道天然屏障，通過藥物誘導細胞凋亡治療癌癥具有重要意義。過往的研究發(fā)現(xiàn)槐耳能激活Caspse級聯(lián)以誘導HCC細胞凋亡。Bao等[8]發(fā)現(xiàn)，槐耳多糖可激活p38 MAPK 信號通路，上調促癌蛋白Bax和生存素的表達、下調抑癌蛋白Bcl-2的表達，從而誘導HCC細胞凋亡。Zhang等[6]研究顯示，槐耳清膏能激活Caspse3、上調Cleaved-Caspse3和Cleaved-PARP的表達以誘導HCC細胞凋亡。槐耳清膏還能通過抑制MEK-ERK信號通路誘導HCC細胞凋亡[7]。

自噬是一種將細胞材料輸送到溶酶體進行降解的細胞死亡機制，當前認為自噬起到促進腫瘤細胞存活和抑制腫瘤細胞生長雙重作用[33]。楊愛琳等[13]研究發(fā)現(xiàn)，槐耳清膏可激活細胞自噬以抑制HCC細胞增殖。黎文信等[14]研究發(fā)現(xiàn)槐耳清膏可能通過抑制 Akt/mTOR 信號通路誘導自噬，發(fā)揮抗腫瘤效應。

1.1.3 抑制上皮間質轉化(EMT)以阻礙HCC細胞的侵襲和轉移 EMT是癌癥發(fā)展過程中的關鍵環(huán)節(jié)，細胞通過EMT失去部分上皮細胞特性，獲得部分間質細胞特性，從而獲得侵襲和遷移的能力[34]。Zheng等[15-16]研究證實，槐耳多糖可抑制PI3k/Akt信號通路，下調星型膠質細胞1(AEG-1)shRNA的表達，從而阻斷HCC細胞的EMT。Li等[17-18]研究發(fā)現(xiàn)，槐耳多糖可通過抑制AUF-1/AEG-1信號通路、上調上皮標志物E-cadherin表達、下調間質標志物N-cadherin表達以阻斷HCC細胞的EMT，抑制裸鼠異種移植模型中HCC細胞向肺轉移。由此可見，槐耳可通過抑制EMT，從而阻礙HCC細胞的侵襲和轉移。

1.1.4 抑制周圍血管生成 HCC是高度血管化的腫瘤，HCC細胞在生長過程中能分泌多種細胞因子誘導血管內皮細胞增殖以促進新生血管形成，加速HCC細胞的轉移進程；同時由于新血管的生成使得腫瘤細胞獲得更多的營養(yǎng)，加快了HCC細胞的增殖速度。因此，抑制新血管生成是HCC治療的有效策略之一。Zou等[19]研究發(fā)現(xiàn)，槐耳多糖可下調血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和低氧誘導因子(hypoxia inducible factor,HIF)1α的表達，以及降低微血管密度(microvessel density,MVD)；其還可通過下調HIFα/VEGF和AUF-1/AEG-1信號通路，降低MVD，從而抑制新血管生成[18]。由此可見，槐耳能夠通過抑制血管生成發(fā)揮抗腫瘤作用。

1.2 調控免疫應答

1.2.1 固有免疫應答的調節(jié) 巨噬細胞是固有免疫應答的重要組成部分。在腫瘤微環(huán)境中，巨噬細胞存在兩種極化狀態(tài)：經(jīng)典激活的巨噬細胞(M1型)和替代激活的巨噬細胞(M2型)。在腫瘤微環(huán)境中，M1型巨噬細胞主要發(fā)揮抗腫瘤作用，M2型巨噬細胞主要發(fā)揮促進腫瘤生長作用[35]。有研究[20]顯示，槐耳清膏可抑制小鼠巨噬細胞M2極化和促進巨噬細胞M1活化?；倍嗵沁€可顯著上調一氧化氮合酶mRNA的表達，進而刺激巨噬細胞分泌NO以發(fā)揮抗腫瘤作用[21]。Yang等[22]研究發(fā)現(xiàn)，槐耳多糖可通過TLR4-NF-κB/MAPA信號通路刺激M1型巨噬細胞上調TNFα、IL-6和COX-2的表達，釋放這些免疫因子。綜上所述，槐耳可促進巨噬細胞M1活化、抑制巨噬細胞向M2極化，以增強巨噬細胞的抗腫瘤作用。

1.2.2 適應性免疫應答調節(jié) 當前認為CD4+和CD8+T淋巴細胞是T淋巴細胞亞群中的重要組成部分，在腫瘤免疫應答中，CD8+T淋巴細胞是最主要的效應細胞，CD4+T淋巴細胞能促進免疫細胞的增殖、分化以及免疫細胞間的相互作用[23]。在腫瘤微環(huán)境中，腫瘤細胞通過多種途徑使機體處于免疫紊亂狀態(tài)，主要表現(xiàn)為CD4+T淋巴細胞減少、CD8+T淋巴細胞升高，CD4+T/CD8+T比值下降。Li等[24]發(fā)現(xiàn)，H22荷瘤小鼠經(jīng)槐耳多糖干預后，外周血中CD4+T淋巴細胞百分比顯著升高、CD8+T淋巴細胞數(shù)量顯著減低。周林等[25]通過小鼠肝癌肝移植復發(fā)模型發(fā)現(xiàn)槐耳能提高小鼠外周血中CD4+T與CD8+T淋巴細胞的百分比。上述研究說明槐耳可在一定程度上糾正由腫瘤細胞引起的免疫紊亂。

調節(jié)性T淋巴細胞(Treg)在腫瘤免疫應答和移植免疫耐受中扮演著重要角色。研究[26]表明，即使Treg能誘導免疫耐受，但HCC患者術前的高Treg水平往往與生存時間和復發(fā)率呈顯著負相關。這可能與Treg通過與CD4+T和CD8+T淋巴細胞直接或間接的相互作用影響腫瘤免疫有關。例如Treg可通過抑制CD8+T淋巴細胞釋放穿孔素和顆粒酶幫助腫瘤細胞實現(xiàn)免疫逃逸[27]。因此，降低患者術前的Treg水平，對于增強免疫和抗腫瘤作用，改善患者預后具有重要意義。Zhou等[36]在臨床試驗中發(fā)現(xiàn)，槐耳顆粒、西羅莫司和胸腺肽聯(lián)合方案可顯著降低肝移植患者的Treg和AFP水平，增加CD8+T淋巴細胞數(shù)量，降低術后復發(fā)率。Zhou等[27]還通過小鼠HCC肝移植復發(fā)模型，發(fā)現(xiàn)槐耳顆粒、西羅莫司和胸腺肽聯(lián)合方案通過AKT-mTOR信號通路下調Treg 的表達、減少抑制性細胞因子的分泌，提高CD8+T淋巴細胞的數(shù)量與活性，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。上述研究表明，槐耳具有改善負性免疫調節(jié)和改善腫瘤預后的作用。

1.3 逆轉耐藥性和改善肝功能 藥物治療(化療、靶向和免疫治療)是治療癌癥患者的重要手段之一。但隨著患者使用時間的推移，會對藥物產(chǎn)生耐藥性，使得藥物的治療效果停滯不前?；倍谝欢ǔ潭壬夏苣孓DHCC的耐藥性[28-30]?；倍甯嗫赏ㄟ^下調多藥耐藥基因1(multiple drug resistence 1,MDR1)表達和抑制細胞膜表面P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)功能，逆轉HCC細胞對阿霉素的多重耐藥性[28]?；倍?lián)合奧沙利鉑可在一定程度上增強HCC細胞對奧沙利鉑的化療敏感性，其機制可能與下調YAP表達有關[29]。槐耳顆粒還能下調HIF1α/VEGF信號通路，逆轉HCC細胞對索拉非尼的耐藥性[30]。

臨床上，HCC患者往往伴有不同程度的肝功能異常，提示肝癌細胞對肝臟造成了損傷。Xu等[31]通過小鼠誘癌模型發(fā)現(xiàn)槐耳能顯著降低肝癌小鼠血清轉氨酶水平，探究其機制發(fā)現(xiàn)與槐耳下調P53基因有關，這表明槐耳可能具有改善肝損傷的作用。另外有研究[32]顯示槐耳顆粒可緩解奧沙利鉑對肝臟造成的損傷，其機制與槐耳可上調PI3K/AKT/Nrf2通路有關。

2 槐耳顆粒的臨床應用現(xiàn)狀

現(xiàn)代醫(yī)學主要應用手術、介入、放化療等手段治療HCC，但是療效往往不太理想。近年來，關于槐耳顆粒聯(lián)合西醫(yī)療法的臨床研究較多，并取得了相應的進展。

2.1 手術聯(lián)合槐耳顆粒 肝切除術仍是目前最普遍的治療HCC的手段，但肝切除術后5年復發(fā)率接近70%。Chen等[37]進行的一項多中心、大樣本、前瞻性隨機對照試驗(RCT)證明槐耳顆粒輔助治療能有效降低HCC根治性切除術后的復發(fā)和肝外轉移，槐耳顆粒組的2年無復發(fā)生存率(62.39% vs 49.05%，P<0.001)和總生存率(95.19% vs 91.46%，P=0.020 7)顯著高于未使用槐耳顆粒組，槐耳顆粒可降低肝外復發(fā)率(8.60% vs 13.61%，P=0.001 8)。基于此研究，槐耳顆粒被推薦用于肝切除術后輔助治療[38]。但上述研究存在一定的局限性，患者隨訪時間只有2年，而研究者以患者2年復發(fā)率來推測5年總生存率狀況，因此需要進一步更長時間的高質量RCT來驗證。

熱消融近年來成為早期HCC的首選治療方案，Wang等[3]進行的一項隊列研究顯示槐耳顆粒聯(lián)合治療能提高早期HCC患者的生存率，降低復發(fā)率和肝外轉移率。

肝移植是目前治療HCC最徹底，最有效的治療方案。雖然免疫抑制劑降低了患者免疫排斥反應的發(fā)生率，但是增加了患者復發(fā)和轉移風險。Lei等[39]研究顯示，槐耳組肝移植術后無瘤生存率顯著高于對照組(未服用槐耳顆粒)(P=0.029)，并且槐耳組10個月和30個月的腫瘤預測復發(fā)率顯著低于對照組(P<0.05)。Zhou等[36]研究顯示西羅莫司、胸腺肽聯(lián)合槐耳顆粒治療組肝移植患者1、3、5年的術后總生存率和無進展生存率顯著高于西羅莫司聯(lián)合胸腺肽治療組(P值均<0.001)。研究表明，槐耳顆粒既能改善患者術后的免疫功能、降低腫瘤復發(fā)轉移概率，同時亦不會增加免疫排斥反應的發(fā)生率。

2.2 經(jīng)肝動脈化療栓塞術(TACE)聯(lián)合槐耳顆粒 對于不能接受外科手術的晚期HCC患者，TACE已經(jīng)成為首選治療方案。但單純的TACE往往很難徹底消滅腫瘤，而槐耳顆粒的抗腫瘤作用可起到協(xié)同增強的效果[40]。一項Meta 分析[41]表明，TACE聯(lián)合槐耳顆粒治療原發(fā)性肝癌可提高客觀應答率、疾病控制率以及6 和 12 個月總生存率。Zhao等[4]研究顯示TACE聯(lián)合槐耳顆粒組的6、12個月總生存率(100% vs 90.3%；93.5% vs 80.6%)和腫瘤6、12個月客觀應答率(87.1% vs 73.3%；72.4% vs 64.3%)均顯著高于單純TACE組(P值均<0.05)，且聯(lián)合組行TACE次數(shù)明顯低于單純TACE組(P<0.05)，表明槐耳顆粒具有延長TACE治療間隔時間的作用，這可能與槐耳顆粒具有增強化療藥物的抗腫瘤效果有關。王海瑞等[42]進行的一項前瞻性隊列研究顯示TACE聯(lián)合槐耳顆粒能延長腫瘤進展時間，提高臨床療效。一項病例報道[43]顯示，1例HCC伴腎靜脈-下腔靜脈腫瘤栓塞和肺轉移的患者自2016年9月9日—2017年8月22日接受載藥微球-經(jīng)肝動脈化療栓塞術(DEB-TACE)(共3個周期)并聯(lián)合槐耳顆粒(3次/d，20 g/次，口服)治療后，AFP降至正常水平，并在2018年4月—2021年3月隨訪期間發(fā)現(xiàn)胸部結節(jié)完全消失，肝區(qū)、腎靜脈和下腔靜脈區(qū)腫瘤處于完全緩解狀態(tài)。

2.3 藥物聯(lián)合治療 近年來，臨床上開展的相關研究顯示化療藥物或靶向藥物聯(lián)合槐耳顆粒治療HCC可以明顯提高治療效果，改善患者生存質量和預后。如FolFox4方案聯(lián)合槐耳顆粒治療HCC術后復發(fā)或轉移患者的AFP降低率、生存質量改善率均顯著高于單純化療組(P值均<0.05)，并且能減少不良反應發(fā)生率[5]。

索拉非尼作為治療晚期肝癌的一線藥物，據(jù)報道其聯(lián)合槐耳顆粒能提高臨床療效。張慶輝等[44]研究顯示，索拉非尼聯(lián)合槐耳顆粒治療原發(fā)性肝癌術后復發(fā)的療效顯著好于單純索拉非尼治療組，槐耳顆?？娠@著提高客觀應答率(46.7% vs 20%，P<0.05)、疾病控制率(76.7% vs 50%，P<0.05)、1年生存率(60% vs 33.3%，P<0.05)和無進展生存期[(4.77±2.27)個月 vs (3.57±1.78)個月，P<0.05]，降低不良反應發(fā)生率(16.7% vs 33.3%，P<0.05)。此外，甄振華等[45]研究顯示阿帕替尼聯(lián)合槐耳顆粒治療晚期原發(fā)性肝癌的有效率為17.1%，疾病控制率為 51.4%，中位無進展生存期和中位生存時間分別為4.5個月和10.4個月，1年生存率為37.1%；但該研究樣本量小且缺少對照組，因此阿帕替尼聯(lián)合槐耳顆粒的療效值得進一步探索。

Liu等[46]進行的一項大樣本量的回顧性研究認為包括槐耳顆粒在內的中醫(yī)藥治療是HCC患者 5 年生存的獨立保護因素(校正HR=0.46，95%CI：0.40～0.52，P<0.000 1)。黨志博等[47]研究發(fā)現(xiàn)槐耳顆粒是乙型肝炎相關原發(fā)性肝癌患者生存的保護因素，且生存時間與用藥時間呈正相關。相關Meta分析[48]指出，槐耳顆粒輔助西醫(yī)療法的療效和安全性均優(yōu)于常規(guī)西醫(yī)療法。

3 小結與展望

槐耳在HCC治療中的作用機制包括抑制血管生成、抑制肝癌細胞增殖、抑制侵襲與轉移、誘導細胞凋亡、調節(jié)免疫功能等，在HCC發(fā)生發(fā)展進程中對相關靶點與信號通路起到調控作用，關于槐耳抗HCC作用機制的總體概述詳見圖1。但是，槐耳的成分相當復雜，藥理作用非常廣泛，如何從多角度、多層次、多靶點對其抗腫瘤作用及機制進行客觀、定性定量的研究，尚需更多的實驗進行探究。

槐耳顆粒作為一種中成藥，具有低毒、服用方便等優(yōu)點，已被應用于HCC的綜合治療并取得了較好的療效。雖然目前關于槐耳顆粒的RCT不斷增多，但因患者的臨床分期或肝功能不同等原因，難以明確其對不同標準下患者的治療效果。因此，今后本團隊欲探討槐耳顆粒輔助肝切除或熱消融對符合米蘭標準的HCC患者治療效果。此外，由于目前大部分為回顧性研究，單中心、樣本量小、隨機分配方法不明等原因，很多研究證據(jù)級別較低。因此未來需要開展多中心、前瞻性、大樣本且更加嚴格控制的各類RCT為臨床方案作出指導。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：謝鎧嶺負責文獻查找與整理，撰寫文章；徐鋒負責擬定寫作思路，提供意見，修改文章并最終定稿。

注：TLR4，Toll樣受體4；N-cadherin，鈣黏蛋白N；E-cadherin，鈣黏蛋白E；LaminB1，核纖層蛋白；NOV，腎母細胞過表達基因；MAPK，絲裂原活化蛋白激酶；JNK，c-Jun氨基末端激酶；ERK，細胞外調節(jié)蛋白激酶；PI3K，磷脂酰肌醇激酶；AKT，絲/蘇氨酸蛋白激酶；AEG-1 shRNA，星形膠質細胞提高基因短發(fā)夾RNA；CDK，細胞周期蛋白依賴性激酶；Cyclin，細胞周期調節(jié)蛋白；NO，一氧化氮；IL-6，白細胞介素6；COX-2，環(huán)氧化酶-2；TNFα，腫瘤壞死因子α；Bcl-2，B淋巴細胞瘤-2基因；BAX，Bcl-2基因家族中的一員；G1、S、G2、M ，細胞周期4個階段；Cry61，半胱氨酸蛋白61；CTGF，結締組織生長因子；Runx2，Runx2 家族轉錄因子2；TEAD2，轉錄增強締合域蛋白2；OXA，奧沙利鉑 。