缺氧誘導(dǎo)因子對肝細(xì)胞癌的作用機(jī)制及臨床意義

李宏一，羅業(yè)浩，羅筱凡，吳 笛，秦黃冠，藍(lán)紹航，呂 挺，龐宇舟

1 廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西壯醫(yī)應(yīng)用基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530200； 2 湖北民族大學(xué) 醫(yī)學(xué)部，湖北 恩施 445000

根世界衛(wèi)生組織[1]估計(jì)，2030年將有100多萬患者死于原發(fā)性肝癌。原發(fā)性肝癌包括肝細(xì)胞癌(HCC)、肝內(nèi)膽管癌和混合型肝細(xì)胞癌-膽管癌，其中HCC占比約85%[2]。HCC的發(fā)生是一個(gè)逐步的過程。慢性肝炎病毒感染、過量飲酒和非酒精性脂肪性肝炎可導(dǎo)致肝臟炎癥和組織損傷，是HCC的主要病因。肝損傷可擾亂肝血管系統(tǒng)、正常血流和O2供應(yīng)，形成一個(gè)缺氧的微環(huán)境。缺氧的Kupffer細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和肝細(xì)胞可激活肝臟中的肝星狀細(xì)胞，加快膠原蛋白沉積，導(dǎo)致纖維化和肝硬化，從而進(jìn)一步加劇缺氧。缺氧也可影響不同免疫細(xì)胞(如NK細(xì)胞)的活動(dòng)，并抑制HCC微環(huán)境中許多不同類型免疫細(xì)胞的浸潤和積累，包括腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAM)、髓源性抑制細(xì)胞(MDSC)和中性粒細(xì)胞。O2水平隨著HCC的發(fā)展而降低，從而促進(jìn)免疫抑制微環(huán)境的形成[3]。缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)是參與細(xì)胞對缺氧適應(yīng)的核心參與者，并受氧感應(yīng)脯氨酰羥化酶的調(diào)節(jié)。缺氧通過氧化還原效應(yīng)和HIF的穩(wěn)定作用影響細(xì)胞生長的諸多方面。HIF亞型可能通過改變代謝、生長和自我更新對腫瘤生長產(chǎn)生不同的影響，并可能高度依賴于環(huán)境。HIF通過促進(jìn)血管生成影響癌細(xì)胞的遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移、增殖，促進(jìn)糖酵解，治療抵抗，免疫逃避等方式影響HCC的發(fā)病和進(jìn)展[4]。探究HIF對HCC的作用機(jī)制及臨床意義，有望拓展診治HCC的新方法。

1 HIF的特性

HIF是異二聚體，由α-亞基(HIF-α，包括HIF-1α，HIF-2α/EPAS1和HIF-3α)和β-亞基(HIF-β，包括HIF-1β/ARNT1、ARNT2和ARNT3)組成。在人類和其他脊椎動(dòng)物中，存在3種不同的HIF基因。在有氧(常氧)的情況下，HIF-α相互作用并與vonHippel-Lindau(VHL)蛋白結(jié)合，從而激活泛素連接酶系統(tǒng)，導(dǎo)致HIFa的蛋白酶體降解，HIF-1α蛋白的表達(dá)被抑制到非常低的水平。而在缺氧期間，脯氨酰羥化酶不活躍，導(dǎo)致HIF-α穩(wěn)定并與HIF-1β二聚。二聚化后，HIF易位至細(xì)胞核，與包含序列5[0]-[A/G]CGTG-3[0]的啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)的E-box樣缺氧反應(yīng)元件結(jié)合。HIF激活控制細(xì)胞氧穩(wěn)態(tài)的基因，包括紅細(xì)胞生成/血管生成和線粒體代謝有關(guān)的基因。缺氧細(xì)胞通過主要由HIF調(diào)控的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后機(jī)制對抗壓力。這些分子變化使細(xì)胞能夠適應(yīng)缺氧，主要通過轉(zhuǎn)用糖酵解來降低耗氧量，并減少細(xì)胞分裂(如細(xì)胞分裂)所需的能量。大多數(shù)實(shí)體瘤都有一定程度的缺氧，這與臨床療效有關(guān)。HIF活性的誘導(dǎo)上調(diào)了涉及癌癥許多特征的基因，包括代謝重編程，細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移以及對治療的抵抗[5-6]。

除了氧依賴性機(jī)制外，HIF的表達(dá)和活性還受氧非依賴性機(jī)制的控制，這些機(jī)制調(diào)節(jié)了基因轉(zhuǎn)錄、mRNA翻譯、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用和HIF-1α亞基的翻譯后修飾。在炎癥反應(yīng)中，HIF-1α基因的轉(zhuǎn)錄上調(diào)是以NF-κB依賴性方式實(shí)現(xiàn)的，并涉及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducers and activators of transcription 3，STAT3)和Sp1。此外，生長因子對PI3K/AKT通路的激活可導(dǎo)致HIF-1α mRNA和蛋白質(zhì)合成增加。HIF-1α也通過與其他蛋白質(zhì)的結(jié)合而受到調(diào)節(jié)[7]。

2 HIF在HCC中的作用機(jī)制

2.1 HIF通過促進(jìn)糖酵解使HCC適應(yīng)低氧應(yīng)激 常氧環(huán)境中的細(xì)胞將葡萄糖轉(zhuǎn)化為丙酮酸，丙酮酸進(jìn)入三羧酸循環(huán)并在線粒體中氧化磷酸化，最終產(chǎn)生三磷酸腺苷。腫瘤細(xì)胞則表現(xiàn)出葡萄糖消耗增加和向糖酵解的重要代謝轉(zhuǎn)變，丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸。即使在有氧條件下，腫瘤細(xì)胞中的這種代謝轉(zhuǎn)變依然存在，被稱為Warburg效應(yīng)[8]。通過AKT和HIF-1α介導(dǎo)的MAP17表達(dá)上調(diào)，將促進(jìn)Warburg效應(yīng)[9]。腫瘤細(xì)胞通過在無氧糖酵解中來產(chǎn)生能量，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)這一過程主要由HIF-1α調(diào)節(jié)。許多參與糖酵解的關(guān)鍵酶是HCC細(xì)胞中直接的HIF-1α靶標(biāo)，包括PGK1、PGAM1、HK2、ENO1、ALDOA、GPI、GAPDH、LDHA、PFKFB4和PKM2等[10]，同時(shí)HIF-1α可誘導(dǎo)多種糖酵解蛋白同種型(包括GLUT1和GLUT3)的過度表達(dá)和活性增加，這對于糖酵解通量控制十分重要[11]。此外，HIF-1α增加了線粒體相關(guān)酶的表達(dá)，如丙酮酸脫氫酶激酶1，其可抑制丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A，從而減少線粒體的氧化磷酸化水平和耗氧量[12]。而HIF-2α影響脂質(zhì)代謝來進(jìn)行能量代謝，如缺氧下，PI3K/AKT/mTOR通路可能是HIF-2α調(diào)控HCC的脂質(zhì)代謝途徑，進(jìn)而促進(jìn)HCC適應(yīng)無氧環(huán)境的重要機(jī)制[13]?？偟膩碚f，研究顯示HIF從不同途徑促進(jìn)了HCC的糖酵解，以適應(yīng)低氧應(yīng)激。

2.2 HIF通過促進(jìn)血管生成促進(jìn)HCC生長 HIF-1α是血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達(dá)的主要調(diào)節(jié)因子。在缺氧條件下，高水平積累的HIF-1α上調(diào)VEGF等一系列血管生成因子的表達(dá)，增強(qiáng)相關(guān)mRNA的轉(zhuǎn)錄，最后促進(jìn)腫瘤血管生成[14]。HIF-2α也是調(diào)節(jié)肝細(xì)胞中VEGF和其他血管生成因子的主要HIF[15]。HIF-2α主要作用于血管生成相關(guān)基因，包括VEGF、促紅細(xì)胞生成素、VEGF受體2(VEGFR2)、血管生成素和酪氨酸蛋白激酶受體TIE-2[16]。

除VEGF外，許多其他信號(hào)分子在缺氧條件下也通過HIF依賴性機(jī)制高表達(dá)，包括胎盤生長因子、血小板衍生生長因子β和基質(zhì)衍生因子1[17-19]，均可促進(jìn)腫瘤中的血管生成。ANG樣蛋白4也被鑒定為HIF-1α的基因靶標(biāo)，其可通過調(diào)節(jié)血管細(xì)胞黏附分子和整合素β1的表達(dá)來影響HCC血管生成和轉(zhuǎn)移[20]。因此，HIF促瘤血管的生成可促進(jìn)HCC的生長。

2.3 HIF通過介導(dǎo)侵襲轉(zhuǎn)移促進(jìn)HCC進(jìn)展 HIF誘導(dǎo)的腫瘤擴(kuò)散的機(jī)制包括上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)、TWIST等基因的激活和GLUT1等參與癌癥代謝的轉(zhuǎn)錄因子的激活。EMT涉及多種類型的腫瘤和多種腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制[21]。在HCC細(xì)胞中，缺氧條件下可通過SNAI1、SIP1、TGFβ、ROS、Notch、NF-κB、Wnt/β-catenin、PI3K/AKT等途徑的活化來誘導(dǎo)EMT，上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榭梢苿?dòng)的基質(zhì)細(xì)胞，獲得遷移到遠(yuǎn)處部位的能力[22]。細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)重塑在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。參與ECM的幾種酶沉積和重塑受缺氧和HIF的調(diào)節(jié)，包括基質(zhì)金屬蛋白酶、2-酮戊二酸5-雙加氧酶、賴氨酰氧化酶、膠原蛋白脯氨酰4-羥化酶等，同時(shí)通過HIF-1α依賴性機(jī)制，可下調(diào)HCC細(xì)胞中金屬蛋白酶2組織抑制劑的表達(dá)[23]。HIF-1α/LOX通路通過依賴于肝炎反式激活蛋白X的機(jī)制，參與ECM重塑和促進(jìn)HCC轉(zhuǎn)移[24]。

此外，微小RNA(microRNA，miRNA)也與腫瘤的遷移和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。例如，miR-23是一種常見的致癌基因，研究[25]顯示，miR-23a/b可以通過VHL-HIF-1α通路促進(jìn)HCC的發(fā)病進(jìn)展。通過抑制SMC4可顯著抑制HCC細(xì)胞的遷移，而HIF-1可通過轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和抑制miR-219來增加SMC4的表達(dá)。因此，HIF-1/miR-219/SMC4調(diào)控通路可能是促進(jìn)HCC的遷移和轉(zhuǎn)移一種機(jī)制[26]。此外，HIF-1α/miR-671-5p/TUFT1/AKT也可能是一種機(jī)制[27]。lncRNA也可促進(jìn)HCC轉(zhuǎn)移，lncRNA鋅指蛋白多型2反義RNA1通過調(diào)控miR-576-3p/HIF-1α軸促進(jìn)HCC的增殖和遷移[28]。此外，lncRNA可抑制HCC的轉(zhuǎn)移，如lincRNA-p21可下調(diào)HIF-1α來降低VEGF水平，從而抑制HCC的侵襲能力[29]。因此，需要更多研究從非編碼RNA層面來闡明HIF的作用機(jī)制，挖掘非編碼RNA靶向藥物。

2.4 HIF通過介導(dǎo)免疫逃避、癌癥干細(xì)胞促進(jìn)HCC發(fā)生發(fā)展

缺氧與HIF和腫瘤細(xì)胞逃避免疫反應(yīng)有關(guān)。免疫細(xì)胞的功能受HIF1依賴性信號(hào)機(jī)制的調(diào)節(jié)，在缺氧期間，HIF誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞對CD8細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生抗性，其可能是HIF通過AMPK/CREB信號(hào)增加IL-10表達(dá)，分泌的IL-10通過STAT3信號(hào)通路抑制NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性，從而促進(jìn)HCC的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[30]。此外，缺氧可以上調(diào)產(chǎn)生腺苷的細(xì)胞外酶CD39和CD73的表達(dá)，增加其在細(xì)胞環(huán)境中的濃度。腺苷通過與其A2A受體結(jié)合，強(qiáng)烈抑制活化的T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞的抗腫瘤功能[31]。HIF還可以通過作用于TAM來抑制對腫瘤的免疫反應(yīng)。研究[32]認(rèn)為，TAM通過分泌細(xì)胞因子，如IL-10、TGFβ、IL-6、VEGF和IL-8，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移。

MDSC具有免疫抑制活性，可使癌癥逃避免疫監(jiān)視并對免疫無反應(yīng)。通過MDSC介導(dǎo)L-精氨酸的消耗，阻礙T淋巴細(xì)胞增殖，并與T淋巴細(xì)胞受體亞基CD3的下調(diào)相關(guān)，導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞受體反應(yīng)降低。肝腫瘤的MDSC水平升高，MyD88-NF-κB通路的激活刺激IL-10的分泌，從而抑制樹突狀細(xì)胞中IL-12的表達(dá)。MDSC也通過細(xì)胞表面的TGFβ和NK受體p30誘導(dǎo)NK細(xì)胞失活。此外，MDSC還通過誘導(dǎo)CD4+CD25+叉頭轉(zhuǎn)錄因子3+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞的產(chǎn)生來抑制免疫反應(yīng)從而促進(jìn)了HCC的發(fā)生發(fā)展[33]。

癌癥干細(xì)胞(CSC)在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移中也具有重要作用。HIF因子可利用各種機(jī)制影響CSC的誘導(dǎo)和發(fā)育。這些機(jī)制可能是通過誘導(dǎo)CSC標(biāo)記，CD44、ALDH，腺苷/STAT3/IL-6途徑，MAPK/ERK途徑，NOTCH和Wnt信號(hào)傳導(dǎo)或其他機(jī)制促進(jìn)CSC的繁殖[34]。缺氧可顯著增強(qiáng)HCC細(xì)胞的干細(xì)胞相關(guān)特性，這種作用可以通過敲低HIF-1α或HIF-2α來消除。此外，HIF-1α特異性干擾RNA處理，在RNA和蛋白質(zhì)水平顯著降低CSC中CD133的表達(dá)。重要的是，EMT激活可以誘CSC特征。Notch1通過與HIF-1α的直接相互作用介導(dǎo)EMT誘導(dǎo)的CSC的過程；HIF-1α上調(diào)Notch的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)可激活EMT并誘導(dǎo)HCC細(xì)胞在體外獲得CSC的特征。

迄今為止，大多數(shù)研究報(bào)道了HIF-1α和HIF-2α對腫瘤生長的積極作用。然而，另有研究[35]顯示，HIF在一些其他癌癥中表現(xiàn)出相反的影響，如缺氧可降低野生型(HIF-1α+/+)胚胎干細(xì)胞的增殖并增加細(xì)胞凋亡。因此，尚需更多研究探析HIF對HCC生長遷移的具體作用。

總結(jié)HIF在HCC中的作用機(jī)制見圖1。

圖1 HIF作用于HCC的作用機(jī)制示意圖

3 HIF在HCC中的臨床意義

3.1 HIF在HCC中的治療應(yīng)用 HIF抑制劑有望成為一種有效的HCC治療方法，抑制HIF-1α活化可能有助于阻止癌癥進(jìn)展，從而使生長的腫瘤細(xì)胞缺乏O2和所需的營養(yǎng)供應(yīng)。當(dāng)前已發(fā)現(xiàn)不同的化合物或藥物可通過不同的分子機(jī)制阻斷HIF的活性，包括減少HIF-1α的蛋白合成，代表藥物如mTOR抑制劑、強(qiáng)心苷、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑和合成寡核苷酸等；降低HIF-1α mRNA的水平，如前藥AFP-464的氨基黃酮成分藥物；增加HIF-1α的分解，如HSP90抑制劑、抗氧化劑和硒甲基硒代半胱氨酸藥物；減少HIF亞基的異二聚化，如吖啶黃藥物；減少DNA與HIF的結(jié)合，并降低轉(zhuǎn)錄活性，如蒽環(huán)類和棘霉素等[36]。研究[37-38]顯示，一些中藥方劑或中草藥提取物也具有抑制或降低HIF-1α的作用，如益氣化瘀解毒方、水飛薊的提取物——水飛薊素等。

HIF也可能參與了HCC化療藥物耐藥性的發(fā)展。索拉非尼是一種具有抗增殖、抗血管生成和促凋亡特性的多激酶抑制劑，但由于產(chǎn)生耐藥細(xì)胞，其療效不佳，可能是長期索拉非尼治療后導(dǎo)致補(bǔ)償性生長途徑的激活，或者缺氧誘導(dǎo)的自噬，從而使HIF介導(dǎo)的細(xì)胞反應(yīng)觸發(fā)對缺氧微環(huán)境的適應(yīng)性機(jī)制。因此，HIF抑制劑可以與現(xiàn)有療法聯(lián)合使用，以增強(qiáng)常規(guī)療法的敏感性和效果[39]。例如，辛伐他汀可通過抑制HIF-1α/PPAR-γ/PKM2軸，使HCC細(xì)胞重新對索拉非尼敏感[40]。此外，有研究[41]顯示，HIF-1α可通過促進(jìn)HCC干細(xì)胞特性，促進(jìn)其對表阿霉素化療藥物的耐藥。

然而，開展相關(guān)臨床研究時(shí)必須謹(jǐn)慎。例如，由于HIF抑制劑可能加劇胰島素抵抗損傷，并抑制肝再生。因此，對于因行肝臟手術(shù)的HCC患者，應(yīng)停止HIF抑制劑治療[42]。

3.2 HIF在HCC預(yù)后評(píng)估中的應(yīng)用 HIF可通過多種途徑影響HCC的發(fā)生發(fā)展，也因此被納入HCC預(yù)后評(píng)估的相關(guān)研究中。有研究[43]顯示，HIF-1α相關(guān)基因的過度表達(dá)與轉(zhuǎn)移和病死率有關(guān)，HIF-1α陽性表達(dá)與HCC合并肝硬化患者血管浸潤、TNM分期、HBV感染、腫瘤大小、門靜脈腫瘤血栓顯著相關(guān)。如上所述，HIF通過不同方式影響了HCC的發(fā)病和進(jìn)展。因此，HIF相關(guān)指標(biāo)水平的測定有望為HCC預(yù)后評(píng)估提供價(jià)值。

KIAA1199是一種與癌癥轉(zhuǎn)移相關(guān)的蛋白質(zhì)，其與HIF-1α在許多人類癌癥中上調(diào)，機(jī)制上與血管浸潤、腫瘤TNM分期、HBV感染、腫瘤大小和肝硬化顯著相關(guān)，提示KIAA1199聯(lián)合HIF-1α檢測對評(píng)估HCC患者的存活時(shí)間、預(yù)后情況有潛在價(jià)值[44]。其他如YTHDF1、DAAM2、H3K9me2、H3K9me3、Rpn10等作為HCC預(yù)后標(biāo)志物也被相關(guān)研究[45-48]初步證實(shí)了臨床價(jià)值，這些標(biāo)志物聯(lián)合HIF-1α檢測或許能夠作為評(píng)估HCC預(yù)后的新方法。

4 討論與展望

總結(jié)現(xiàn)有研究，HIF在HCC中的主要作用是通過促進(jìn)糖酵解、血管生成、侵襲轉(zhuǎn)移、免疫逃避、癌癥干細(xì)胞等方式，影響HCC的發(fā)生發(fā)展以及對治療耐藥，也由此引出了通過HIF靶向治療HCC和評(píng)估HCC預(yù)后的新設(shè)想。然而，HIF在HCC中的相關(guān)研究仍有諸多值得深入探究的問題：(1)既往研究主要著眼于HIF-1，HIF-2次之，而HIF-3的相關(guān)研究甚少。已有證據(jù)[49]顯示，HIF3 AmRNA被差異剪接以產(chǎn)生多種HIF-3α變體，這些變體促進(jìn)或抑制其他HIF復(fù)合物的活性，不同的HIF-3變體具有不同甚至相反的功能。(2)已有研究提供了關(guān)于HIF-2α在HCC生長和進(jìn)展中的穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)錄活性和作用的信息，但在HCC中的確切作用尚存爭議。有研究[50]認(rèn)為HIF-2α在腫瘤中可能具有某些積極作用。(3)HIF檢測評(píng)估預(yù)后也存在爭議，且尚不完全清楚HIF-1、HIF-2、HIF-3三者在HCC中存在哪些相互作用。相關(guān)研究[51]發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)敲除HIF-1α或HIF-2α未能顯著減小腫瘤體積(HIF-1α敲除后HIF-2α的表達(dá)增加，HIF-2α敲除后HIF-1α的表達(dá)增加)，而同時(shí)敲除HIF-1α和HIF-2α之后效果可見腫瘤體積顯著縮小。因此，HIF-1、HIF-2、HIF-3之間是否存在一些相互調(diào)控作用及其具體機(jī)制？如果存在相互調(diào)控作用，靶向HIF-1α治療和HIF-1α評(píng)估預(yù)后的同時(shí)，是否要考慮HIF-2和HIF-3的影響？這些問題有待更多研究探明，以提升相關(guān)藥物研發(fā)的成功率及HIF應(yīng)用于臨床的可靠性。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：李宏一負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)、資料分析及撰寫論文；羅筱凡、吳笛、秦黃冠負(fù)責(zé)文獻(xiàn)檢索及資料整理；藍(lán)紹航、呂挺參與收集數(shù)據(jù)及修改論文；龐宇舟、羅業(yè)浩負(fù)責(zé)選題、擬定寫作思路，并最后定稿。