MAPK信號通路
——肝棘球蚴病治療新靶點

董琳琳，蘆永良，鄂維建，張 翔，趙玲莉

1 青海大學 臨床醫(yī)學院，西寧 810000；2 青海大學附屬醫(yī)院 檢驗科，西寧 810000

肝棘球蚴病是棘球蚴絳蟲幼蟲寄生于人體和某些動物體內(nèi)，侵犯其肝臟所致的一種嚴重肝臟疾病[1]。由細粒棘球蚴絳蟲幼蟲引起的肝細粒棘球蚴病，又稱肝囊型包蟲??；由多房棘球蚴絳蟲幼蟲引起的肝多房棘球蚴病，又稱肝泡性型包蟲病。肝棘球蚴病廣泛分布于地中海地區(qū)、美國西南部、亞洲和非洲等農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)常見地區(qū)，在我國主要分布于西北地區(qū)，如內(nèi)蒙古、新疆、西藏和青海等[2]。當宿主感染棘球蚴時，棘球蚴可通過某些信號通路進行自身與宿主間的信息傳遞，調(diào)控自身生長發(fā)育與宿主的免疫系統(tǒng)。在棘球蚴感染過程中，絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路發(fā)揮著重要作用。現(xiàn)就MAPK信號通路在肝棘球蚴病中涉及的相關(guān)免疫調(diào)節(jié)情況作一綜述。

1 MAPK信號通路與相關(guān)肝臟疾病的研究概述

MAPK信號通路是介導細胞氧化應激、增殖與凋亡等生命活動的重要信號傳導系統(tǒng)，其可將細胞外的相關(guān)生物信號進行逐級放大，傳導到細胞內(nèi)部，從而刺激細胞中的效應分子來完成細胞的各項生命活動。

目前至少存在3種不同的MAPK信號通路，并且3種途徑之間具有相互交叉、影響的關(guān)系，包括ERK激酶家族通路、JNK激酶家族通路和p38激酶家族通路[3]。ERK激酶家族由ERK1、2組成，JNK激酶家族由JNK1～3組成，p38激酶家族分為p38α、β、γ和δ。ERK信號的激活主要與生長因子的啟動密切相關(guān)，JNK和p38信號由多種因素激活，如細胞因子、生長因子、環(huán)境應激和其他刺激[4]。激活的信號通路以三級激酶級聯(lián)反應方式進行，其關(guān)鍵酶為MAPKKK、MAPKK、MAPK 3個絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，進行方向為MAPKKK-MAPKK-MAPK[5](圖1)。ERK激酶家族通路是MAPK信號通路的經(jīng)典通路，其MAPKKK-MAPKK-MAPK三級激酶級聯(lián)反應為Ras-Raf-MEK-ERK通路。細胞外的相關(guān)信號通過逐級活化激活ERK信號通路，磷酸化的ERK進入細胞核，激活多種轉(zhuǎn)錄因子，如Elk-1、ATF、NF-κB、Ap-1、c-fos和c-Jun等,這些轉(zhuǎn)錄因子進一步調(diào)節(jié)各蛋白的表達，參與細胞增殖與分化、細胞形態(tài)維持等多種生物學反應。而活化的JNK調(diào)節(jié)細胞分化、凋亡和癌基因轉(zhuǎn)化等多種生命過程[6]，P38可調(diào)控氧化應激條件下炎癥相關(guān)因子的表達、細胞骨架重構(gòu)、能量代謝和增殖凋亡等[7]。

圖1 MAPK信號通路示意圖

作為一種廣泛存在真核生物中且高度保守的經(jīng)典信號通路，MAPK通路在肝臟疾病中的作用逐漸被人們認識。其可在轉(zhuǎn)錄前、轉(zhuǎn)錄后及翻譯等過程中調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達，與肝臟相關(guān)炎癥反應、肝纖維化、肝癌等病理活動密切相關(guān)[8]。如馬佳敏等[9]研究證實MAPK途徑在非酒精性脂肪性肝炎進展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。次旦旺久等[10]研究證實MAPK信號通路在肝癌的發(fā)生發(fā)展及治療中發(fā)揮重要作用，是肝癌治療及預后評價的潛在分子靶點。

而在肝棘球蚴病中，通過對感染細粒棘球蚴與多房棘球蚴的小鼠進行研究發(fā)現(xiàn)，其miRNA與正常小鼠的miRNA存在差異性表達，且差異性表達的miRNA主要集中在Wnt、MAPK、IL-17和TNF等信號通路中[11-12]。目前已在棘球絳蟲體內(nèi)成功鑒定出MAPK的幾個組成部分[13]，表明MAPK信號通路是一種棘球蚴和人體共有的信號傳導系統(tǒng)，可作為連接棘球蚴與宿主的橋梁，影響棘球蚴的發(fā)育存活以及人體肝臟病變的病理過程，是打開肝棘球蚴病疾病密碼的重要研究方向。研究棘球蚴病中與MAPK信號通路相關(guān)的基因、蛋白質(zhì)的表達和功能鑒定等，有助于從細胞分子水平上了解疾病的進展過程，揭示棘球蚴和人體在各類病理性過程中的關(guān)系，為肝棘球蚴病的防治、預后等方面提供相關(guān)科學依據(jù)[14-16]。以下將重點介紹MAPK通路在肝棘球蚴病相關(guān)研究中的進展。

2 棘球蚴感染宿主肝臟中的MAPK信號通路

在棘球蚴感染宿主的過程中，肝臟是最易受到其侵襲和累及的器官。而MAPK信號通路可接收多種細胞外刺激，參與多種信號傳導，調(diào)節(jié)著幾乎所有肝細胞的生理過程，包括基因表達、周期調(diào)控、細胞存活與死亡等[17]。研究MAPK信號通路的各個途徑在肝細胞代謝過程中起到的作用，對肝棘球蚴病的進展過程尤為重要。

當受氧化應激、生長因子、細胞因子等刺激時，MAPK信號通路被激活，引起相應的級聯(lián)反應，造成相應的生物學改變[18]。在MAPK信號通路中，ERK通路可調(diào)控細胞的發(fā)育、活化、凋亡等，是細胞內(nèi)多種信號交匯點，ERK的激活更是導致細胞有絲分裂的早期關(guān)鍵因素。研究[19]顯示，肝星狀細胞分泌膠原以及肝細胞外基質(zhì)的產(chǎn)生和降解等均受到了ERK途徑的調(diào)控，而JNK可在一定程度上參與上述活動，并與ERK通路共同促進了肝纖維化。有證據(jù)[20]表明，ERK抑制劑PD98059和JNK抑制劑SP600125能夠逆轉(zhuǎn)TGF-β1誘導的肝星狀細胞的自噬和纖維化。與正常生理狀態(tài)相比，P38通路在肝臟疾病中存在差異表達，可參與到多種肝臟病理生理過程中，P38阻斷劑SB203580可使肝星形細胞活化程度顯著降低，表明在肝星狀細胞的增殖與凋亡中，甚至在膠原、胞外基質(zhì)的合成與降解等過程中，P38通路均發(fā)揮了重要作用[21]。

在肝多房棘球蚴病中，多房棘球絳蟲原頭蚴能夠激活大鼠肝細胞ERK激酶，并且對JNK激酶和P38激酶也有不同程度的激活作用，同時多房棘球絳蟲原頭蚴也能夠激活肝癌細胞的ERK激酶，表明多房棘球絳蟲原頭蚴自身分泌的一些細胞因子，如EmIns、EmBMP1/2等，可與宿主表面受體結(jié)合，從而激活宿主肝細胞的MAPK信號通路[22]。采用大鼠肝星狀細胞株HSC-T6與不同蛋白濃度的多房棘球絳蟲囊液進行共培養(yǎng)，結(jié)果顯示，泡球蚴囊液對大鼠肝星狀細胞ERK1/2、JNK1/2和P38的mRNA水平存在顯著影響[19]。在肝細粒棘球蚴病中，Lin等[23]通過蛋白質(zhì)印跡和免疫熒光測定表明，細粒棘球絳蟲囊液可通過脂多糖刺激小鼠巨噬細胞中的P38和ERK1/2信號通路。Liu等[24]用細粒棘球絳蟲囊液刺激小鼠腹腔巨噬細胞后，磷酸化的細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶、磷酸化的P38絲裂原活化蛋白激酶、磷酸化的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶表達水平均有所升高。

由此可見，利用多房棘球絳蟲原頭蚴、囊液及細粒棘球絳蟲囊液刺激相關(guān)動物模型后，實驗動物體內(nèi)的MAPK信號通路均有不同程度的激活，激活后的MAPK信號通路將進一步調(diào)控機體內(nèi)相關(guān)蛋白的表達，推動病情的進展，尤其在肝臟病理進展過程中發(fā)揮重要作用。而宿主肝細胞中MAPK信號通路對于棘球蚴絳蟲刺激表現(xiàn)的高敏感性，或許為棘球蚴病常見的受累器官為什么是肝臟提供了相關(guān)合理解釋。

3 棘球蚴體內(nèi)的MAPK信號通路

3.1 MAPK信號通路相關(guān)基因的鑒定和克隆 在肝多房棘球蚴病中，Spiliotis等[25]在體外培養(yǎng)中間宿主感染期間，在幼蟲期囊蚴和原頭蚴的裂解物中檢測到EmRaf與EmRas基因的表達，并證實EmRas與編碼Raf-1的人類基因共享4個高度保守的外顯子-內(nèi)含子邊界。使用酵母雙雜交系統(tǒng)表明EmRaf與EmRas相互作用，但不與EmRal相互作用。其團隊后又成功分離了多房棘球蚴EmMPK1基因，并對其進行了全序列測定，結(jié)果顯示該序列與已知物種的MAP激酶基因有顯著的同源性，并在體外培養(yǎng)和感染中間宿主的幼蟲階段檢測了EmMPK1及其磷酸化形式[26]。Gelmedin等[27]采用兼并PCR方法鑒定和成功克隆了多房棘球蚴的EmMKK1和EmMKK1基因。在結(jié)構(gòu)上，EmMKK1和EmMKK2與來自其他物種的MKK3/6-和MEK1/2-MAPKK亞家族成員也表現(xiàn)出顯著同源性。在酵母雙雜交分析中，EmMKK2不僅與EmRaf相互作用，與EmMPK1也存在相互作用。而對EmMKK1來說，其與EmRaf也有著強烈相互作用，但與EmMPK1或EmMPK2不存在相互作用。Gelmedin等[28]發(fā)現(xiàn)，多房棘球絳蟲P38 MAPK 家族中的EmMPK2 與其他種族的 P38 MAPK 具有相當大的同源性，但也存在幾個明顯的差異，如與人類P38-alpha 相比，EmMPK2 顯示出顯著的自身磷酸化活性和對 MAPK 底物強烈升高的基礎(chǔ)活性。

在肝細粒棘球蚴病中，呂國棟等[29]應用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應法從新疆株細粒棘球絳蟲原頭蚴和成蟲中克隆出EgRas基因,其與多房棘球絳蟲基因EmRas以及線蟲、人類等物種來源的Ras基因都表現(xiàn)出了較高的同源性。雖然EgRas的具體功能有待進一步研究，但推測其可能參與了細粒棘球絳蟲向成囊與成蟲兩種不同發(fā)育模式的轉(zhuǎn)變過程。其團隊后又從細粒棘球絳蟲原頭蚴cDNA中克隆出Ral基因，檢測到其與EmRal的同源性高達99%，但與線蟲、人類等物種來源的Ral基因同源性則較低[30]。細粒棘球絳蟲和多房棘球絳蟲在不同的發(fā)育時期具有較相似的形態(tài)結(jié)構(gòu)，但二者在中間宿主體內(nèi)生長發(fā)育模式和致病過程卻表現(xiàn)出了較大的差異，推測Ral基因可能在這2種寄生蟲不同的發(fā)育過程中發(fā)揮一定作用。對新疆株細粒棘球蚴EgERK1基因進行相關(guān)測定發(fā)現(xiàn)，EgERK1與多房棘球絳蟲ERK基因EmMPK1同源性為95.45%，與線蟲、人類等ERK基因的同源性為43.04%～61.88%。功能分析預測EgERK1具有ERK類激酶T-X-Y結(jié)構(gòu)保守區(qū)和酶激活功能域。Western印跡顯示，原核誘導表達的EgERK1重組蛋白能與抗人ERK1/2抗體發(fā)生特異性免疫反應[31]。Zhang等[32]檢出細粒棘球絳蟲EgMKK1和EgMKK2均在幼蟲階段表達。酵母雙雜交和共免疫沉淀分析所示，EgMKK1與先前鑒定的 EgP38蛋白相互作用，但不與EgERK相互作用。另一方面，EgMKK2與EgERK相互作用。此外，EgMKK1和EgMKK2顯示出針對底物髓鞘堿性蛋白的激酶活性。Lv等[33]在細粒棘球蚴中鑒定了一個1107 bp的cDNA，該cDNA編碼了368個氨基酸的組成的EgP38蛋白。EgP38具有P38樣激酶的2個顯著特征：高度保守的TXY基序和激活環(huán)片段。結(jié)構(gòu)同源性建模表明EgP38、EmMPK2和智人P38α之間存在保守結(jié)構(gòu)，EgP38的活性形式在囊泡和原頭蚴中表達，但不在伴隨的囊液中表達(表1)。

3.2 MAPK信號通路的抑制劑與相關(guān)治療效果 在ERK途徑中，人EGF介導的EGFR/ERK信號促進了多房棘球蚴生發(fā)細胞的增殖，使用EGFR抑制劑CI-1033和BIBW2992、MEK/ERK抑制劑U0126，抑制信號傳導會損害生發(fā)細胞增殖和幼蟲生長[32,36-37]。Raf抑制劑甲苯磺酸索拉非尼(25 μmol/L)、MEK選擇性抑制劑PD184352(100 μmol/L)、MEK抑制劑U0126-EtOH(100 μmol/L)可誘導細粒棘球蚴中EgMKK和EgERK去磷酸化，引起形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)的改變，包括生發(fā)層中的細胞死亡、部分起皺和分離，同時降低原頭蚴活力。且甲苯磺酸索拉非尼比PD184352和U0126更可有效地降低原頭蚴活力[32]。ERK途徑中Tau蛋白的阻滯劑TRx0237(LMTX)mesylate可以抑制棘球蚴原頭蚴活性，阻礙生發(fā)層細胞與多房棘球蚴包囊的增殖。ERK蛋白的阻滯劑GDC-0994可以達到抑制原頭蚴活性與抑制多房棘球蚴包囊增殖的作用，但與多房棘球蚴生發(fā)層細胞的增殖關(guān)系不密切[8]。

在P38途徑與JNK途徑中，EmMPK2活性被抑制劑ML3403和SB202190有效抑制。當將SB202190尤其是ML3403添加到體外培養(yǎng)的多房棘球蚴囊泡時，會導致寄生蟲中EmMPK2的去磷酸化，損害棘球蚴細胞生發(fā)細胞增殖和幼蟲生長，并在不影響培養(yǎng)的哺乳動物細胞的濃度下有效殺死寄生蟲囊泡[28,32]。用P38抑制劑ML3403處理細粒棘球蚴體外培養(yǎng)的原頭蚴可有效抑制EgP38活性，并在5 d內(nèi)導致顯著的原頭蚴死亡[33]。而P38途徑中靶點蛋白ASK1阻滯劑Selonsertib在體內(nèi)及體外均無明顯的抗多房棘球蚴作用[38]。ERK抑制劑PD98059、JNK抑制劑SP600125、P38抑制劑SB202190均對細粒棘球蚴原頭蚴的生長有不同程度的抑制作用,且抑制P38及JNK信號通路對HO-1酶活性影響更大[39]。

在其他相關(guān)途徑中，P53蛋白的阻滯劑Pifithrin-β hydrobromide在小鼠體內(nèi)抗多房棘球蚴效果較好，而在體外實驗中，對原頭蚴及生發(fā)層細胞均無明顯抑制作用，推測其可能在棘球蚴與宿主之間的交互作用中發(fā)揮了重要生物效應[8]。BMP抑制劑LDN-193189能夠?qū)MP分子誘導的Smad、P38、AKT、ERK等信號通路產(chǎn)生抑制作用，阻礙寄生蟲獲取能量，并破壞其蟲體結(jié)構(gòu)。在體外培養(yǎng)體系中，予以不同濃度LDN-193189，阻斷其信號轉(zhuǎn)導，會使原頭蚴生存能力顯著減弱，且隨著濃度的增大和作用時間的延長，這種效果更為顯著[40]。

4 小結(jié)和展望

綜上所述，棘球蚴絳蟲的生長和發(fā)育依賴于人體分子信號，而人體肝臟內(nèi)一系列病理過程的變化和棘球蚴的分子信號也有千絲萬縷的聯(lián)系。近年來，以肝棘球蚴病信號轉(zhuǎn)導通路中的關(guān)鍵激酶為藥物的篩選靶點，探索具有高特異性且毒副作用小的新型靶向藥物已成為當前肝棘球蚴病研究的熱點。而MAPK信號通路在肝棘球蚴病中存在蟲體與宿主的雙重激活，參與肝棘球蚴病發(fā)生、發(fā)展的各個方面，對進一步研發(fā)更有效的治療方案有著重要意義。未來，以MAPK信號通路為靶點的藥物治療有望成為肝棘球蚴病治療新的選擇。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：董琳琳負責課題設(shè)計，資料分析，撰寫論文；蘆永良、鄂維建、張翔參與收集資料，修改論文；趙玲莉負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。