李卓雨

摘? ? 要：隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展及人類基因工作的推進(jìn)，植物基因克隆技術(shù)研究取得了一定的成就。近年來，我國植物基因克隆技術(shù)有了新發(fā)展，玉米、小麥及水稻等均克隆了較多與植物產(chǎn)品品質(zhì)、產(chǎn)量等相關(guān)的基因。就植物基因克隆技術(shù)展開研究，以供借鑒。

關(guān)鍵詞：植物;基因;克隆技術(shù)

文章編號：1005-2690（2022）03-0010-03? ? ? ?中國圖書分類號：S336? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

植物基因克隆技術(shù)是現(xiàn)代生命科學(xué)的關(guān)鍵組成，也是現(xiàn)代生命科學(xué)技術(shù)最為關(guān)鍵的要素，基于20世紀(jì)70年代初級DNA體外重組技術(shù)的誕生，經(jīng)歷了甄別、分離特異性的基因并得到基因完整的序列，明確其在染色體上的確切位置，闡明其生化功能，以及結(jié)合生物工程方式應(yīng)用于生產(chǎn)實踐中的過程[1]。

通?；蚩寺〔呗园瑑深?，即正向遺傳學(xué)方式和反向遺傳學(xué)方式。前者主要以待克隆基因所表現(xiàn)出的功能為前提，基于對包括基因表達(dá)產(chǎn)物及其表現(xiàn)現(xiàn)狀實現(xiàn)克隆，包含了功能方面以及表觀方面等多個部分;后者更多綜合基因自有的序列或基因組之中的特殊點位進(jìn)行克隆，如定位克隆和同源序列法克隆等。隨著DNA測序和生物信息學(xué)等理念不斷完善，電子克隆等新興技術(shù)誕生[2]。

目前，包括煙草在內(nèi)的多類植株已在品質(zhì)、抗性以及性狀等多個維度實現(xiàn)了克隆。對植株基因克隆涉及的相關(guān)技術(shù)進(jìn)行分析，可以更好地了解植物基因克隆技術(shù)的發(fā)展過程，并對其未來發(fā)展趨勢進(jìn)行展望。

1 功能克隆技術(shù)

功能克隆是以蛋白質(zhì)的功能為基礎(chǔ)進(jìn)行的基因克隆，主要內(nèi)容是綜合確切的生化問題或已知與這一功能存在關(guān)聯(lián)性的蛋白質(zhì)，對純化蛋白進(jìn)行分離，測定出相關(guān)氨基酸序列，結(jié)合遺傳密碼研究明確潛在的編碼序列，開發(fā)出相關(guān)的核苷酸探針、雜交篩選基因組文庫等，基于抗原反應(yīng)鎖定特異克隆，完成測序處理，繼而獲得對應(yīng)的序列。結(jié)合該形式克隆基因的核心分離得到純蛋白，得到其部分序列以及相關(guān)抗體，隨后搭建基因組文庫，并結(jié)合文庫予以篩選[3]。相關(guān)學(xué)者結(jié)合該方式，自擬南芥中克隆到一個解毒外運載體蛋白基因AtDTX1的同時，也發(fā)現(xiàn)了一個涵蓋不少于56個編碼相關(guān)蛋白基因的基因家族。

隨著科研深入以及配套技術(shù)不斷完善，越來越多的蛋白質(zhì)得以有效純化，這勢必會為克隆技術(shù)提供更為全面與完善的環(huán)境基礎(chǔ)，不斷提升功能克隆的效用價值，并在市場上推廣[4]。

2 定位克隆技術(shù)

定位克隆技術(shù)的核心是通過目標(biāo)基因在染色體之中的點位實現(xiàn)基因克隆的方式，對于克隆編碼產(chǎn)物基因不明確的基因更為適用[5]。

定位克隆技術(shù)的原理主要為結(jié)合功能基因于基因組中較為穩(wěn)定的基因座，基于分子標(biāo)記模式對其實施精準(zhǔn)定位，選擇和目標(biāo)基因兩端聯(lián)系緊密的分子標(biāo)記篩選帶有較大片斷的基因組文庫，結(jié)合獲得的陽性克隆形成基因區(qū)，利用染色體步行，穩(wěn)步挨近候選區(qū)的方式，得到帶有目標(biāo)基因的大片段克隆，對于這一目標(biāo)基因片段實施亞克隆，或是利用這一克隆作為探針得到基因組文庫，以實現(xiàn)目標(biāo)基因精確值小片段區(qū)間內(nèi)完成序列的研究，利用遺傳轉(zhuǎn)化以及功能互補測試研究，對提取的目標(biāo)基因進(jìn)行判斷。

植物方面的應(yīng)用主要包括水稻、番茄、大麥以及馬鈴薯等植株，目前均已提取了數(shù)十個關(guān)鍵的基因，其中抗病基因的克隆較多，典型的包括馬鈴薯的Gpa2基因以及水稻的Xa1基因等。近年來，中國科學(xué)院等多個團(tuán)隊結(jié)合定位克隆技術(shù)先后提取并改良了水稻遺傳技術(shù)，對水稻株高、抽穗期以及水稻的秈粳不育等核心基因進(jìn)行了調(diào)控，同時實現(xiàn)了對花期及關(guān)聯(lián)生長情況的RID1基因等實施可靠管控，在水稻功能基因領(lǐng)域積累了諸多經(jīng)驗。

3 抑制性消減雜交技術(shù)

抑制性消減雜交技術(shù)以DNA消減雜交方式及抑制聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）為基礎(chǔ)，并以此獲得高品質(zhì)及快捷的分離基因。其中，PCR是一種能夠?qū)μ囟―NA片段擴(kuò)增放大的分子生物技術(shù)，通?？梢园哑湟暈樯锿怏w所具有的特殊DNA復(fù)制，其最大的特征是能夠大幅增加微量的DNA。

抑制性消減雜交模式綜合了抑制PCR的高效動力學(xué)和消減雜交策略。后者以雜交二級動力學(xué)原理為基礎(chǔ)。前者則主要圍繞鏈內(nèi)退火好于鏈間退火的特性，推動不是目標(biāo)序列的兩側(cè)實現(xiàn)反向重復(fù)，繼而退火過程中誘發(fā)諸如“發(fā)卡”的結(jié)構(gòu)模式，無法當(dāng)作模板以及引物匹配，繼而選擇性地抑制非目標(biāo)的基因片段發(fā)展。由此不僅有效應(yīng)用了差減雜交技術(shù)的消減富集，也很好地涉及了PCR技術(shù)開展高效能的動力學(xué)富集[6]。

抑制性消減雜交技術(shù)的優(yōu)勢如下。

第一，較高的特異性，樣品通過兩次消減雜交，使差異基因富集，又經(jīng)抑制PCR增加了差異基因，致使特異性提升，同時假陽性率顯著降低。

第二，有較高的靈敏性，對于分離體量不高的基因有突出優(yōu)勢?；谑褂镁然脑O(shè)計方式，促使含量不一的單鏈DNA分子含量趨同，有利于低含量單鏈DNA分子的甄選。

第三，能夠開展大面域的基因篩選，該技術(shù)1次可同時分隔得到數(shù)百個差異基因。

第四，操作方式較為便捷，有助于掌握，該技術(shù)只要求開展兩次雜交、兩次PCR，無須移出雜交復(fù)合體，接頭的設(shè)計也相對簡便，無須頻繁更換和移出接頭。

第五，篩選周期不長，結(jié)合SSH（安全外殼協(xié)議）通常僅3～4 d即可得到差異基因。

此外，抑制性消減雜交技術(shù)也存在一定的不足，比如訴求的起始mRNA（信使核糖核酸，由DNA的其中一條鏈作為模板轉(zhuǎn)錄而來，并攜帶有遺傳信息，繼而指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成的一類單鏈核酸）過大。如若mRNA的量不足，兩次差減之后有部分關(guān)鍵、低豐度表達(dá)差異cDNA（互補脫氧核糖核酸，和mRNA鏈具有互補的單鏈DNA，并以mRNA為模板）片段或許無法檢測得到，其次單次抑制性消減雜交反應(yīng)只可以對比兩個mRNA池，不適宜分析多個原料以及處理彼此間的不同。

現(xiàn)階段，該技術(shù)在植物方面的使用主要包含兩個層面。一是植株生長發(fā)育和組織特異性方面的分析，包括辣椒素的生物合成有關(guān)基因的分割、甜菜根表達(dá)基因的分割以及甄別;水稻幼穗發(fā)育初期特異性表達(dá)基因的分割、胡蘿卜色體細(xì)胞培根發(fā)育有關(guān)基因的分割;二是生物和非生物逆境和植株關(guān)聯(lián)性以及引發(fā)基因差異性表達(dá)研究，例如鋁離子脅迫優(yōu)勢甘蔗基因的差異性表達(dá)等。

4 同源序列法

與傳統(tǒng)克隆方式不同，同源序列法的基因克隆主要針對的是與待克隆基因同源的已知序列，且具備較大的優(yōu)越性。當(dāng)前，很多植株基因序列已經(jīng)掌握，在對類似基因進(jìn)行克隆時，需從對應(yīng)的庫內(nèi)檢索得到關(guān)聯(lián)基因序列，設(shè)計出特異引物;模板設(shè)定為植物基因組DNA或cDNA，利用PCR等方式完成基因的擴(kuò)增操作，之后引入純化工藝，與契合的載體連接，開展序列研究，對比論證以及明確目標(biāo)基因克隆。這是在PCR技術(shù)出現(xiàn)以來而研發(fā)出的一種相對快捷、簡易的克隆植物基因的辦法，RGAs也屬于該技術(shù)范疇。

雖然抗病基因病原物種類型存在差異性，但此類抗病基因產(chǎn)物有著極為相似的結(jié)構(gòu)域，包括NBS（N-溴代琥珀酰亞胺）、LRR（氨基酸序列）、STK（種抑癌基因，編碼一種絲蘇氨酸蛋白激酶）等。結(jié)合此類保守結(jié)構(gòu)域特點，設(shè)計特有異性的簡并引物，基于植物總DNA以及cDNA為模板開展PCR擴(kuò)增，由此獲得抗病基因候選片段，結(jié)合分析檢驗，確定目的基因克隆[7]。

5 基因芯片技術(shù)

基因芯片即DNA芯片，為常規(guī)的生物芯片之一。基因芯片技術(shù)是以探針技術(shù)雜交測序技術(shù)為基礎(chǔ)形成的一類更具高效性的便捷核算研究模式。多個探針片段按照特定的秩序固化于支持物表面的形式，組成DNA探針陣列，之后和標(biāo)記的試樣雜交，結(jié)合檢測雜交參量完成對于目標(biāo)物高效、并行的檢測。與其他克隆技術(shù)形式對比，該技術(shù)的核心特質(zhì)是微型化。芯片每1 cm2固定安置了10 000個DNA序列，即上萬個基因，僅利用1次分析過程就可以清晰地獲得上萬個表達(dá)數(shù)據(jù)。微型化的另外一個特質(zhì)是對樣品及試劑使用情況進(jìn)行微量化管控，選擇納克等級的mRNA以及相關(guān)雜交液等即可研究大批量的基因數(shù)據(jù)，這是其他表達(dá)技術(shù)無可比擬的。在芯片的研發(fā)生產(chǎn)等方面均支持自動化形式，雜交、洗片等流程均可完成自動化，工作效能全面提升。

基因芯片技術(shù)在植物基因克隆方面的應(yīng)用較為普遍，比如在研究生物體對于逆境的反應(yīng)方面，通過芯片技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)更為便捷、有效地分析基因的差異性表達(dá)。

趙寶存及其團(tuán)隊結(jié)合基因芯片分析了小麥于各個鹽脅迫環(huán)境下的根位置基因的應(yīng)答表現(xiàn)，共得到了61 215個小麥基因差異性表達(dá)圖譜，并完成了不同鹽脅迫情況下根部基因表達(dá)的明顯變化。和對照組對比，鹽脅迫1 h的試樣內(nèi)，5.6個百分點的基因上調(diào)表達(dá)，12.4個百分點的基因下調(diào)表達(dá)，80.9個百分點未有變化;鹽脅迫6 h試樣內(nèi)，上調(diào)表達(dá)、下調(diào)表達(dá)以及未有變化的基因分別占比6.8個百分點、9.6個百分點以及82.7個百分點。

基因芯片技術(shù)在基因表達(dá)水平領(lǐng)域也得到了一定的普及。將已然明確了的基因置入芯片內(nèi)，對其mRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄處理，得到cDNA，對應(yīng)性地開展熒光標(biāo)記處理，之后與芯片實施雜交，通過雜交信號等強度情況來明確具體的表達(dá)豐度指標(biāo)數(shù)據(jù)，結(jié)合基因芯片對表達(dá)水平進(jìn)行分析，通過自主、高效分析得到數(shù)萬個基因的表達(dá)情況。

Bevan通過擬南芥基因組內(nèi)的45個cDNA，分析得到了該植物根、葉等位置的基因表達(dá)信息，對不同熒光劑的標(biāo)記逆轉(zhuǎn)錄研究分析后實現(xiàn)同該陣列的有效雜交研究，在激光共聚顯微鏡技術(shù)的支持下，了解并掌握了植株的根部位置及其他位置等存在的26個基因表達(dá)特點及不同之處，參與葉綠素合成的CAB1基因在葉組織比根組織表達(dá)高出500倍。

高志勇及其團(tuán)隊基于基因芯片分析了水稻孕穗期不同器官基因表現(xiàn)，最終得到了主控花的形態(tài)組成MADS2box基因家族中的相關(guān)基因，于水稻的孕穗期階段在葉和根中得到強烈表達(dá)。該基因在葉位置進(jìn)行表達(dá)，也反映了NAC（乙酰半胱氨酸）之中的Zinc（鋅）和EST（鉀）等都出現(xiàn)了在幼穗之中的可靠基因表達(dá)情況，這證明了水稻花類似的基因已遠(yuǎn)優(yōu)于花發(fā)育ABC（向前葉片概念）機制下的MADS2box基因。此類發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步擴(kuò)展了對Zinc及EST等基因在植株內(nèi)生長發(fā)育效用的認(rèn)知，也為該領(lǐng)域后期全面性研究工作的開展打下了重要基礎(chǔ)。

此外，基因芯片技術(shù)在轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢驗領(lǐng)域有較好的效用。搜集關(guān)于轉(zhuǎn)基因技術(shù)的啟動子、目的基因以及標(biāo)記基因的多個基因序列信息，得到基因芯片，可對轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品展開研究。Suzuki及其團(tuán)隊選擇寡聚核苷酸序列展開研究，綜合芯片技術(shù)確定了353個VP1/ABA控制基因。此類基因分布在73%的植株組織內(nèi)，且VP1以及ABA存在聯(lián)系，由此反映了ABA信號傳達(dá)以及VP1功用彼此的聯(lián)系。周萍萍等（2008）[8]參照大豆中的外緣基因，篩選得到了有關(guān)啟動子，綜合其內(nèi)源基因當(dāng)作內(nèi)參照基因得到了目標(biāo)引物和對應(yīng)的探針，利用多重PCR技術(shù)完成了樣品核酸擴(kuò)展以及配套的熒光標(biāo)記管理，將PCR產(chǎn)物和對應(yīng)的基因芯片雜交，研究轉(zhuǎn)基因含量不同情況下的RRS標(biāo)準(zhǔn)參照物，其靈敏性指標(biāo)可達(dá)到0.45%。

6 電子克隆技術(shù)

電子克隆技術(shù)即計算機雜交技術(shù)，主要以數(shù)學(xué)算法為核心，強調(diào)計算機、互聯(lián)網(wǎng)等方式對已有的基因序列、EST等生物學(xué)測試編碼和功能驗證的基因手段。電子克隆技術(shù)的主要流程如下。

第一步，綜合目標(biāo)基因和同源基因EST當(dāng)作是搜索序列，確定BLASTN（序列比對分析），搜索對應(yīng)的EST庫未有研究或是得到起始檢索的片段有著同源性和部分重合的序列，長度大于100 bp。

第二步，分析得到的序列組裝成重疊群，綜合這一重疊群作為檢測序列，反復(fù)開展BLAST檢索，并確保序列充足，進(jìn)一步擴(kuò)展重疊群，循環(huán)這一流程，直到不出現(xiàn)新的EST序列，最終獲得cDNA。

第三步，將該cDNA和相關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行相似度對比分析，假設(shè)不存在精準(zhǔn)匹配基因情況，將這一序列數(shù)據(jù)通過EST序列6類閱讀框轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)形式，隨后和蛋白質(zhì)序信息庫對比。

基因研究結(jié)果為3類，一是已知基因為人類已然甄別以及掌握的基因;二是位置基因，此類基因彼此并無同種以及異種基因匹配，之前未有鑒定新基因;三是新基因以及未知基因予以生物學(xué)的分析，由此綜合獲得基因序列得到引物，引入PCR模式獲得基因組的序列數(shù)據(jù)，隨后深入開展功能分析，于電子克隆的前提下，結(jié)合IMAGE協(xié)議得到對應(yīng)的免費克隆，有效避免了篩選全長基因的制約，加強基因功能方面的研究。

電子克隆的應(yīng)用獲取明確的數(shù)據(jù)資源，結(jié)合ESTs序列，利用同源篩查得到基因系列及全長的cDNA序列，大大削減了搭建及篩選cDNA文庫等頻繁的試驗活動，進(jìn)一步加快基因克隆。和以往的實驗室方式對比，電子克隆技術(shù)更為快捷、高效、成本更低?；诙囝惸Ｊ缴锘驕y序工作，和各個生物EST數(shù)據(jù)庫構(gòu)建以及完善，電子克隆勢必會對基因克隆起到重要作用，也必定加速新基因等發(fā)展及克隆技術(shù)發(fā)展。

7 植物克隆技術(shù)發(fā)展趨勢

生物基因猶如汪洋，在基因克隆方面人類已然邁出了堅定的步伐，但要想切實掌握該技術(shù)，基因克隆工作任重道遠(yuǎn)。展望未來，基因克隆技術(shù)將會朝著以下方向發(fā)展。

第一，高通量、高效能及更經(jīng)濟(jì)性的方向，SSH（安全外殼協(xié)議）技術(shù)以及基因芯片技術(shù)等為未來發(fā)展主流方向之一。

第二，全基因組測序的方向，擬南芥以及水稻等基因測序已然完成，勢必會對更多植株進(jìn)行全基因組測序，比如玉米以及柑橘等。

第三，分析更多功能基因彼此的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。高速發(fā)展及持續(xù)完善的高通量基因克隆技術(shù)，包括芯片技術(shù)等在短期內(nèi)實現(xiàn)對諸多基因團(tuán)的表達(dá)分析，可以對植株功能整體層面的基團(tuán)作用機理進(jìn)行深層次剖析，繼而把對基因調(diào)控效用的認(rèn)知從單個基因提升到多基因網(wǎng)絡(luò)層面上。對有關(guān)分析數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合統(tǒng)籌，從而系統(tǒng)性地認(rèn)識功能基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，有利于從更多層面利用功能基因開展植物基因工程改良。

8 結(jié)束語

一直以來，生命科學(xué)研究人員創(chuàng)造了多類植物基因克隆方式，各種方式有著不同的特色，也存在不同的問題。未來，隨著技術(shù)的發(fā)展以及社會關(guān)注的不斷提升，生命科學(xué)研究必將迎來新的廣闊空間，實現(xiàn)更好的發(fā)展。

參考文獻(xiàn)：

[1]任宏偉，孟寒寒，徐瑤，等.藥用植物珊瑚菜GlAT基因的克隆和生物信息學(xué)分析[J].世界中醫(yī)藥，2020，15（5）：683-688.

[2]付亞娟，侯薈玲，喬潔，等.大花杓蘭鈣依賴蛋白激酶基因克隆及植物表達(dá)載體構(gòu)建[J].植物遺傳資源學(xué)報，2019，20（6）：1613-1620.

[3]姚娜，劉建雨，田媛媛，等.紅花bHLH轉(zhuǎn)錄因子基因的克隆、表達(dá)分析及植物表達(dá)載體構(gòu)建[J].中國中藥雜志，2019，44（2）：278-282.

[4]張超，付三雄，周小嬰，等.甘藍(lán)型油菜GPDH基因克隆，表達(dá)分析及植物過表達(dá)載體構(gòu)建[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報，2019，50（7）：1399-1407.

[5]雷欣，居利香，趙成志，等.黃燈籠辣椒CcCAD1基因的克隆與植物表達(dá)載體的構(gòu)建[J].分子植物育種，2020，18（16）：5373-5379.

[6]董敏，杜立嘯，袁洪振，等.懸鈴木方翅網(wǎng)蝽非典型氣味受體基因CcilOrco的克隆與序列分析[J].植物保護(hù)，2018，44（4）：53-59.

[7]趙春麗，王曉，潘君飛，等.莧菜AtGAI基因克隆及表達(dá)分析[J].西北植物學(xué)報，2019，39（2）：199-209.