茯磚茶優(yōu)勢菌株分離鑒定及發(fā)酵低級綠茶分析

趙宏朋，黃斯晨，施麗娟，王奕琦，任達兵，胡永丹，易倫朝

（昆明理工大學農(nóng)業(yè)與食品學院，云南 昆明 650500）

我國盛產(chǎn)茶葉，云南以“茶葉的故鄉(xiāng)”而聞名。云南種植的大葉種茶，具有芽葉肥厚、葉質(zhì)柔軟等優(yōu)點，是制作茶產(chǎn)品的優(yōu)良原料[1-2]。由于茶葉種植規(guī)模的不斷擴大，市場上低級茶產(chǎn)品的存量持續(xù)增多[3-4]。低級茶產(chǎn)量大，品質(zhì)不佳，銷售價格低，嚴重損害了茶農(nóng)和茶產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟效益。篩選有益菌種，采用發(fā)酵的方法改善低級茶產(chǎn)品質(zhì)量，優(yōu)化茶產(chǎn)品類型，將為低級茶高值化利用起到積極作用。

茯磚茶，屬于發(fā)酵茶，是我國特有的黑茶品種，近幾年脫穎而出，產(chǎn)銷量一直占據(jù)黑茶市場首位，給茶產(chǎn)業(yè)帶來了一股“金花”風。“金花”是通過“發(fā)花”工藝長成的自然益生菌體[5]?！敖鸹ā本擒虼u茶發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌之一，對茯磚茶醇香、濃厚的風味及健康功效有重要貢獻[6-7]，其分泌的多酚氧化酶、蛋白酶、水解酶等[8-10]多種酶類，為茶葉中化學物質(zhì)的轉(zhuǎn)化提供有利條件，是一種有利于茶葉內(nèi)含物轉(zhuǎn)變的益生菌。目前，“金花”菌的發(fā)酵對象多為陜西、湖南、貴州等地生產(chǎn)的小葉種茶，研究主要集中在其發(fā)酵特性[11]、發(fā)酵工藝[12]、生物活性[13]等方面，且對原料要求較高（一芽二三葉[14]），而針對云南大葉種茶的“金花”菌發(fā)酵研究仍鮮見報道。

本研究以湖南白沙溪茯磚茶為菌種來源，在對茯磚茶中優(yōu)勢菌種進行分離、純化、鑒定的基礎(chǔ)上，采用液態(tài)發(fā)酵方法，將純化后的菌株用于云南大葉種低級綠茶浸提液的發(fā)酵，并對發(fā)酵前后發(fā)酵液中主要成分的含量變化進行分析。本研究可為云南大葉種低級綠茶發(fā)酵菌種的篩選及發(fā)酵工藝的優(yōu)化提供理論依據(jù)，為低級綠茶的高值化利用提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

湖南白沙溪茯磚茶 湖南白沙溪茶廠股份有限公司；云南大葉種低級綠茶 云南省昆明市雄達茶葉市場。

咖啡堿、茶氨酸、兒茶素、表兒茶素（epicatechin，EC）、沒食子兒茶素（gallocatechin，GC）、表沒食子兒茶素（epigallocatechin，EGC）、兒茶素沒食子酸酯（catechin-3-gallate，CG）、表兒茶素沒食子酸酯（epicatechin-3-gallate，ECG）、沒食子兒茶素沒食子酸酯（gallocatechin-3-gallate，GCG）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate，EGCG）標準品（純度均大于99%） 云南西力生物技術(shù)股份有限公司；氨基酸混合標準液 日本W(wǎng)ako公司；蘆丁標準品上海源葉生物科技有限公司；磁珠法真菌基因組提取試劑盒（NMG2411） 武漢納磁生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LCMS-8040三重四極桿液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀日本島津公司；L-8900氨基酸自動分析儀 日本日立公司；UV-6100型雙光束分光光度計 上?，斉吝_儀器有限公司；DYY-8C電泳儀 北京六一儀器廠；9700型聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國ABI公司；PHS-3G雷磁pH計 上海精密科學儀器有限公司；Ni-U光學顯微鏡 日本尼康公司；AIRTECH SW-CJ-1FD醫(yī)用型潔凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)基制備

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）：稱取去皮馬鈴薯200 g，切片，加1 L蒸餾水，煮沸20 min，8 層紗布過濾，補加蒸餾水至1 L，加入葡萄糖20 g、瓊脂20 g，121 ℃滅菌20 min。

孟加拉紅培養(yǎng)基：稱取成品孟加拉紅培養(yǎng)基36.7 g，加入1 L蒸餾水，加熱煮沸溶解，121 ℃滅菌15 min。

1.3.2 茯磚茶優(yōu)勢菌株的分離、純化

稱取白沙溪茯磚茶茶樣25 g，于225 mL 0.85%無菌生理鹽水（帶玻璃珠）中；在恒溫搖床中以28 ℃、180 r/min振蕩20 min。振蕩完成后分別稀釋至10－1、10－2、10－3、10－4、10－5、10－66 個梯度，每個梯度取200 μL稀釋液涂布于PDA平板上，倒置放入28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待菌落出現(xiàn)后，觀察其生長情況，挑取長勢較好的菌落，在PDA培養(yǎng)基上采用平板劃線法進行分離、純化。將純化后的菌落轉(zhuǎn)接至PDA斜面上培養(yǎng)5 d后保存于4 ℃冰箱中。

1.3.3 茯磚茶優(yōu)勢菌株的形態(tài)學鑒定

將4 ℃保存的純化后的菌株取出，于28 ℃活化24 h，用點植法分別于PDA和孟加拉紅培養(yǎng)基平板上28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，觀察記錄各培養(yǎng)基上菌落形態(tài)及生長情況。用乳酸酚棉藍染色液制成水浸片，于光學顯微鏡下觀察其個體形態(tài)和結(jié)構(gòu)并成像。

1.3.4 茯磚茶優(yōu)勢菌株的分子生物學鑒定

參考Weiland[15]方法，用基因組提取試劑盒提取總DNA。采用真菌18S通用引物ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3’、ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’對所選菌株進行PCR擴增。PCR擴增體系：30 μL的總反應體系中包含上下游引物各1 μL（10 pmol）、1 μL模板DNA、15 μL Super Mix，加雙蒸水補至30 μL。擴增條件：96 ℃預變性5 min，96 ℃變性20 s，56 ℃退火30 s，35 次循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，紫外成像系統(tǒng)拍照。將PCR純化產(chǎn)物送北京六合華大基因科技有限公司進行測序。測序獲得的ITS基因序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中使用BLAST進行同源序列比對。

1.3.5 低級綠茶浸提液的制備

參考GB/T 8305—2013《茶 水浸出物測定》[16]，按茶水比1∶30的比例稱取茶葉，將茶葉用粉碎機充分粉碎后，過40 目篩，在85 ℃水浴鍋中浸提30 min。茶葉浸提液經(jīng)抽濾后分裝在250 mL錐形瓶中，每瓶裝液量100 mL。121 ℃高壓滅菌20 min，冷卻后備用。

1.3.6 孢子懸浮液制備

將斜面保存的不同純化菌株于PDA平板培養(yǎng)基上活化2 次。在超凈工作臺上，用接種鏟刮取3 塊直徑20 mm的菌落于100 mL已滅菌帶有玻璃珠的無菌水內(nèi)，振搖20 min，制成均勻的孢子懸浮液，通過血球計數(shù)法得到孢子懸浮液濃度為1×108CFU/mL。

1.3.7 液態(tài)發(fā)酵

取已制備好的低級綠茶浸提液，將不同菌株的孢子懸浮液分別單獨加入其中，接種量均為低級綠茶浸提液體積的5%。以不加孢子懸浮液的低級綠茶浸提液作為空白實驗組，于28 ℃、120 r/min搖床內(nèi)培養(yǎng)，發(fā)酵7 d。每組3 個平行。

1.3.8 茶多酚、總黃酮、總生物堿、茶色素、可溶性固形物和pH值含量測定

參考GB/T 21733—2008《茶飲料》[17]、QB/T 5206—2019《植物飲料 涼茶》[18]、GB/T 8312—2013《茶 咖啡堿測定》[19]和文獻[20-22]，發(fā)酵液中茶多酚、總黃酮、總生物堿含量分別采用酒石酸亞鐵比色法、硝酸鋁比色法、堿式乙酸鉛紫外分光光度法進行測定?？傸S酮含量標準曲線方程為：y=0.334 5x－0.006 5，R2=0.997 9；總生物堿含量標準曲線為：y=50.268x＋0.006 3，R2=0.999 1?？扇苄怨绦挝锖坎捎脭?shù)字折光儀進行測定；pH值使用pH計測定；茶色素采用乙酸乙酯、正丁醇萃取法[23-24]測定。

1.3.9 咖啡堿、茶氨酸和兒茶素組分檢測

取2 mL樣品于離心管中，10 000 r/min離心10 min，取上清液0.5 mL于燒杯中，加入4.5 mL色譜級甲醇稀釋。將稀釋后樣品溶液過0.22 μm濾膜，加入到棕色進樣瓶中，封口待測。

采用超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜（ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）對咖啡堿、茶氨酸和兒茶素組分進行檢測。在多反應監(jiān)測模式下，采用電噴霧電離源正離子模式掃描獲得質(zhì)譜數(shù)據(jù)，采用外標法定量。色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18ODS柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動相：A為體積分數(shù)0.1%甲酸溶液，B為乙腈，流速0.2 mL/min，柱溫35 ℃，梯度洗脫程序：0.01 min，90% A、10% B；10～11 min，85%～75% A、15%～25% B；11～15 min，75%～60% A、25%～40% B；15～15.01 min，60%～0% A、40%～100% B；15.01～20 min，0%～90% A、100%～10% B；20～30 min，90% A、10% B，進樣量1 μL。

1.3.10 氨基酸組分檢測

取1 mL樣品于15 mL水解管中，加入6 mL 6 mol/L鹽酸在110 ℃水解22 h后，倒入50 mL離心管中調(diào)節(jié)pH值至2.0～2.5。取4 mL水解液，在1 000 r/min離心10 min，過0.22 μm濾膜，加入棕色進樣瓶中。采用氨基酸全自動分析儀進行檢測，進樣量20 μL，外標法定量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

顯著性差異采用IBM SPSS Statistics 26.0進行分析，P＜0.05，差異顯著。Origin 2018軟件用于圖形繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 茯磚茶優(yōu)勢菌株的分離鑒定

2.1.1 形態(tài)學鑒定結(jié)果

依據(jù)菌株的疏密、質(zhì)地、顏色等形態(tài)特征差異，從茯磚茶茶樣中初步分離獲得4 株優(yōu)勢菌株，分別命名為J1、J2、J3、J4。如圖1所示，菌株J1在PDA培養(yǎng)基上生長緩慢，形狀不規(guī)則，邊緣呈淡黃色，中央呈橙黃色，菌落稀松，中央隆起，少量色素擴散于培養(yǎng)基中；在孟加拉紅培養(yǎng)基上生長略快，形狀不規(guī)則，淡黃色至黃褐色，大量色素擴散于培養(yǎng)基中。菌株J2在PDA培養(yǎng)基上生長快，邊緣呈白色至淡黃色，中央呈橄欖褐色，菌落致密，色素擴散于培養(yǎng)基中；在孟加拉紅培養(yǎng)基上生長較快，中央呈黑褐色，并伴隨有大量油狀液滴。菌株J3在PDA培養(yǎng)基上生長快，整體呈淡黃色，菌落致密、平伏；在孟加拉紅培養(yǎng)基上，中央呈淡黃褐色。菌株J4在PDA培養(yǎng)基上生長快，邊緣稀松呈白色至橙黃色，中央呈黃褐色，菌落致密；在孟加拉紅培養(yǎng)基上，邊緣呈白色至橙黃色，中央呈淡黃褐色，平伏帶略微隆起。

圖1 茯磚茶中分離得到優(yōu)勢菌在不同培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)特征Fig. 1 Colonial characteristics of the dominant fungi isolated from Fuzhuan tea cultured in different media

菌株通過染色在光學顯微鏡下的特征形態(tài)如圖2所示，菌株J2、J3、J4均發(fā)現(xiàn)有性結(jié)構(gòu)子囊果，子囊果呈球形或近球形，子囊果容易破裂釋放出子囊孢子；菌絲均帶有隔膜。菌株J1同樣發(fā)現(xiàn)有隔菌絲，帶有頂囊、分生孢子梗、足細胞等結(jié)構(gòu)。根據(jù)文獻[25-26]等的描述，分離得到的優(yōu)勢菌株J1初步鑒定為曲霉屬真菌，J2、J3、J4初步鑒定為散囊菌屬真菌。

圖2 茯磚茶中分離得到優(yōu)勢菌株的細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)Fig. 2 Microscopic examination of cellular morphology of isolated strains

2.1.2ITS序列比對結(jié)果

如圖3所示，4 株菌的ITS序列大小約500～750 bp，且均呈現(xiàn)單一、明亮的條帶，表明分離得到的4 株菌DNA純度較高、無污染。經(jīng)過雙向基因測序、拼接，最終獲得菌株J1、J2、J3、J4的ITS序列。將4 株菌序列分別在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行同源序列搜索比對，結(jié)果表明：菌株J1序列與數(shù)據(jù)庫中謝瓦曲霉（Aspergillus chevalieri）KU20018.17（序列ID：MT487831.1）的相似度為100%；菌株J2序列與數(shù)據(jù)庫中冠突曲霉（A. cristatus）HNYYWX.21（序列ID：MN759629.1）的相似度為100%；菌株J3序列與數(shù)據(jù)庫中冠突曲霉DUCC5705（序列ID：MT582745.1）的相似度為100%；菌株J4序列與數(shù)據(jù)庫中冠突曲霉B-TF（序列ID：MK346334.1）的相似度為100%。

圖3 4 株優(yōu)勢菌株ITS PCR擴增產(chǎn)物電泳分析圖Fig. 3 PCR amplification of fungal ITS from Fuzhuan tea

依據(jù)最新國際命名法規(guī)，散囊菌屬已歸入曲霉屬曲霉組，是1 個單系的類群[27]。因此，結(jié)合形態(tài)學鑒定結(jié)果，綜合鑒定菌株J1為謝瓦曲霉；菌株J2、J3、J4均為冠突曲霉。

2.2 低級綠茶浸提液發(fā)酵前后成分變化

2.2.1 茶多酚類總含量變化

圖4 發(fā)酵前后茶葉浸提液中茶多酚、總黃酮、總生物堿、可溶性固形物含量和pH值變化Fig. 4 Changes in contents of tea polyphenols, total flavonoids, total alkaloids, soluble solids and pH before and after fermentation

如圖4所示，經(jīng)4 株優(yōu)勢菌單一液態(tài)發(fā)酵后，茶多酚含量顯著降低（P＜0.05）。與空白對照組相比，謝瓦曲霉J1發(fā)酵液中茶多酚含量降低了78.94%，冠突曲霉J2、J3、J4發(fā)酵液中茶多酚含量分別降低了75.06%、77.06%、74.61%。結(jié)果表明，謝瓦曲霉和冠突曲霉發(fā)酵均能讓云南大葉種茶中多酚類物質(zhì)發(fā)生明顯轉(zhuǎn)化，且謝瓦曲霉的轉(zhuǎn)化能力略強于冠突曲霉。茶多酚的轉(zhuǎn)化可能與菌種發(fā)酵過程中分泌產(chǎn)生的胞外酶催化氧化、縮合以及聚合等系列反應有關(guān)[28-30]。

2.2.2 總黃酮含量變化

黃酮類化合物具有柔和的澀感，是茶葉品質(zhì)的一個重要影響因子，其含量的高低與茶湯的色澤、滋味密切相關(guān)[31]。黃酮類物質(zhì)的減少有助于茶湯滋味的醇化和改善茶湯色澤[32]。如圖4所示，經(jīng)過不同菌株發(fā)酵，與空白對照組相比，總黃酮含量分別降低了13.4%（J1）、30.6%（J2）、38.0%（J3）、33.9%（J4）（P＜0.05）。發(fā)酵液湯色由原來的暗綠淡黃逐漸變得橙黃明亮。

2.2.3 總生物堿含量變化

生物堿是茶葉中的主要活性成分之一[33]，不僅決定著茶葉的品質(zhì)，還存在一定的有益作用。如圖4所示，與空白對照組相比，謝瓦曲霉J1發(fā)酵液總生物堿含量略微增加，冠突曲霉J2、J3、J4發(fā)酵液降低（P＜0.05）。冠突曲霉能有效減低總生物堿含量，這與前人研究結(jié)果[34]基本一致。

2.2.4 pH值和可溶性固形物含量的變化

pH值是茶葉發(fā)酵過程穩(wěn)定的一項重要參數(shù)[35]。冠突曲霉J2、J3、J4發(fā)酵液pH值與空白組接近，而謝瓦曲霉J1發(fā)酵液pH值顯著降低（P＜0.05）?？扇苄怨绦挝镌诓枞~浸提液中的含量越高，對浸提液的純度以及透明度的影響越大[36]。如圖4所示，與空白對照組相比，通過4 株優(yōu)勢菌株發(fā)酵后，茶葉浸提液中可溶性固形物含量均顯著降低（P＜0.05），且不同菌株之間對可溶性固形物的利用差異較小。

2.2.5 咖啡堿、茶氨酸和兒茶素含量的變化

表1 發(fā)酵前后茶葉浸提液中咖啡堿、茶氨酸和兒茶素組分含量變化Table 1 Changes in contents of caffeine, theanine and catechin in tea infusion

咖啡堿、茶氨酸和兒茶素組分是茶葉的重要呈味物質(zhì)。由表1可知，與空白對照組相比，在不同菌株作用下，在茶葉浸提液中咖啡堿、茶氨酸和兒茶素含量均顯著變化（P＜0.05）。咖啡堿與總生物堿的含量變化趨勢一致；茶氨酸含量在冠突曲霉J2發(fā)酵液中顯著減少。作為茶多酚主體成分的兒茶素，又分為酯型兒茶素與非酯型兒茶素。其中，起苦澀味作用的酯型兒茶素[37]含量均顯著下降，而EC、GC、EGC 3 種具有先苦后甜滋味特征的非酯型兒茶素[37]含量均顯著增加。其原因可能是在微生物作用下酯型兒茶素分解形成非酯型兒茶素[38-39]。

2.2.6 氨基酸含量的變化

氨基酸與茶湯滋味密切相關(guān)，是評價茶葉品質(zhì)的重要指標[40]。由表2可知，云南大葉種低級綠茶中氨基酸組分含量在不同菌株作用下與空白對照組相比有顯著變化（P＜0.05）。牛磺酸含量通過謝瓦曲霉J1發(fā)酵后顯著增加，纈氨酸含量在冠突曲霉J2、J4作用下顯著增加；酪氨酸在冠突曲霉J4發(fā)酵液中未檢測到。在冠突曲霉J2、J4發(fā)酵液中還未檢測到胱氨酸、苯丙氨酸，這可能由于冠突曲霉J2、J4分泌苯丙氨酸解氨酶所導致[41]。對于γ-氨基丁酸，冠突曲霉J2對其影響較小，其原因可能是該菌株在發(fā)酵過程中產(chǎn)生谷氨酸脫羧酶，而谷氨酸脫羧酶為γ-氨基丁酸的合成酶，導致其含量變化不大[42]。

表2 發(fā)酵前后茶葉浸提液中氨基酸成分含量變化Table 2 Changes in amino acid contents before and after fermentation

2.2.7 茶色素

茶色素包括茶黃素[43]、茶紅素[44]、茶褐素[45]。茯磚茶中的茶色素主要是由微生物在發(fā)酵過程中分泌的微生物酶催化產(chǎn)生。兒茶素在微生物胞外酶的催化下進一步氧化聚合，使茶黃素、茶紅素、茶褐素積累[46]。茶多酚，主要是兒茶素，首先被氧化成醌類。醌類進一步氧化、聚合為茶黃素和茶紅素，最后與其他物質(zhì)（如多糖、蛋白質(zhì)和咖啡堿）氧化聚合形成茶褐素[47]。茶色素的形成主要通過多酚氧化酶、過氧化物酶和漆酶三者協(xié)同作用[48]。茶色素與茶湯顏色、滋味等有密切關(guān)聯(lián)，茶黃素與茶湯亮度相關(guān)[49]，而茶紅素和茶褐素直接反映茶湯的口感和茶湯顏色[50]。由圖5可知，與空白對照組相比，在謝瓦曲霉J1及冠突曲霉J2、J3作用下茶黃素含量顯著降低，而在冠突曲霉J4作用下茶黃素含量呈顯著增加。這可能由于冠突曲霉J4利用兒茶素氧化聚合形成茶黃素的速率遠大于茶黃素進一步轉(zhuǎn)化的速率[43]，促使茶黃素的積累。不同菌株發(fā)酵液中茶褐素含量均顯著增加，茶褐素含量分別是發(fā)酵前的1.7、2.0、1.9、2.2 倍，具有顯著差異（P＜0.05）。

圖5 發(fā)酵前后茶葉浸提液中茶色素含量變化Fig. 5 Changes in contents of tea pigments before and after fermentation

3 結(jié) 論

對湖南白沙溪茯磚茶中的優(yōu)勢菌株進行分離和鑒定，分別得到謝瓦曲霉J1、冠突曲霉J2、J3和J4 4 種菌株。以云南大葉種低級綠茶為原料進行單一菌株發(fā)酵分析，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過4 株菌發(fā)酵后茶葉浸提液中茶多酚含量較空白對照組分別降低了78.94%、75.06%、77.06%、74.61%，總黃酮總量分別減少13.4%、30.6%、38.0%、33.9%，均顯著降低；與未發(fā)酵相比，總生物堿在謝瓦曲霉J1作用下顯著增加，在冠突曲霉J2、J3、J4作用下顯著降低；各菌株發(fā)酵液中咖啡堿含量與總生物堿含量變化趨勢相同，茶氨酸顯著降低，兒茶素各組分的含量變化差異較大，其中酯型兒茶素均呈顯著下降趨勢，而EC、GC、EGC 3 種非酯型兒茶素均顯著增加；氨基酸組分經(jīng)過菌株發(fā)酵有顯著變化，在謝瓦曲霉J1發(fā)酵后?；撬岷匡@著增加，纈氨酸含量在冠突曲霉J2、J4作用下顯著增加；J2、J4組中未檢測到酪氨酸、胱氨酸、苯丙氨酸等氨基酸的具體原因有待進一步深入研究；茶黃素在謝瓦曲霉J1和冠突曲霉J2、J3作用下顯著減少，冠突曲霉J4則顯著增加；茶褐素含量均顯著增加。本研究對茯磚茶優(yōu)勢菌株發(fā)酵云南大葉種低級綠茶后成分含量的變化進行了細致分析，可為云南大葉種低級綠茶的品質(zhì)改善、茶產(chǎn)品類型的優(yōu)化提供理論和技術(shù)依據(jù)。