利用RNAi技術(shù)研究基因PDIDSM_85260和PDIDSM_08010表達(dá)對(duì)檸檬烯轉(zhuǎn)化生成α-松油醇的影響

張璐璐，范 剛，李 曉，任婧楠，潘思軼，黃 文，何 進(jìn)

（1.河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，環(huán)境食品學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430070；3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070）

隨著人們健康意識(shí)的增強(qiáng)，天然香料的應(yīng)用日益廣泛，而通過微生物生物轉(zhuǎn)化作用生產(chǎn)的香料已經(jīng)被認(rèn)為是天然的[1]。微生物轉(zhuǎn)化能夠?qū)⑵焚|(zhì)不高的檸檬烯轉(zhuǎn)化生成α-松油醇等香氣更濃、應(yīng)用價(jià)值更高的香料[2-5]，然而目前微生物轉(zhuǎn)化檸檬烯生產(chǎn)α-松油醇過程中的關(guān)鍵酶或基因還不清楚，轉(zhuǎn)化途徑和轉(zhuǎn)化機(jī)制仍不明確，生成的產(chǎn)物成分復(fù)雜，所得到的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物產(chǎn)率仍然很低。因此，檸檬烯微生物轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制研究對(duì)香精香料的發(fā)展以及工業(yè)化生產(chǎn)有重要的推動(dòng)作用。

在本實(shí)驗(yàn)室前期研究中，以指狀青霉（Penicillium digitatum）DSM62840為研究對(duì)象，通過基因組測(cè)序，轉(zhuǎn)錄組分析以及蛋白分離純化和生物信息學(xué)分析等手段挖掘檸檬烯微生物轉(zhuǎn)化生成α-松油醇過程中的關(guān)鍵基因。其中通過基因組和轉(zhuǎn)錄組分析，篩選得到一個(gè)候選基因PDIDSM_85260，該基因在檸檬烯轉(zhuǎn)化的過程中上調(diào)了3 000多倍[6]。對(duì)該基因進(jìn)行BLAST分析，發(fā)現(xiàn)該基因被注釋為假定蛋白，含有一個(gè)GAL4-like Zn2Cys6 binuclear cluster DNA-binding domain（GAL4）和一個(gè)fungal transcription factor regulatory middle homology region（fungal_TF_MHR）。在蛋白水平上，PDIDSM_85260與卡門培爾青霉（Penicillium camemberti）FM013中的真菌轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白具有高度相似性（相似度95%）。以上結(jié)果說明基因PDIDSM_85260可能是一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子。研究表明大多數(shù)鋅指蛋白是參與碳/氮源的利用或氨基酸/次級(jí)代謝物的生物合成，比如橘青霉菌（P. citrinum）中參與美伐他汀生物合成的MlcR[7]、黃曲霉菌（Aspergillus flavus）中參與黃曲霉毒素生物合成的AflR[8]、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中參與半乳糖代謝的Gal4[9]以及構(gòu)巢曲霉菌（A. nidulans）中與硝酸鹽利用有關(guān)的NirA[10]。基因PDIDSM_85260的高表達(dá)說明它在檸檬烯生物轉(zhuǎn)化過程中可能起重要作用。此外，通過超速離心、30%～60%硫酸銨沉淀、羥基磷灰石層析和凝膠過濾層析對(duì)指狀青霉DSM62840轉(zhuǎn)化檸檬烯生成α-松油醇過程中的關(guān)鍵酶進(jìn)行分離純化，電泳結(jié)果顯示在分子質(zhì)量約為50 kDa處有一條明顯的蛋白條帶。經(jīng)過質(zhì)譜鑒定，該條帶中的蛋白可能是二氫硫辛酰胺脫氫酶（dihydrolipoyl dehydrogenase，DLD，PDIDSM_08010），推測(cè)其可能參與調(diào)控檸檬烯的微生物轉(zhuǎn)化過程（文章未發(fā)表）。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證基因PDIDSM_85260和PDIDSM_08010在檸檬烯微生物轉(zhuǎn)化過程中的功能，本研究利用RNAi技術(shù)構(gòu)建PDIDSM_85260和PDIDSM_08010的干涉載體pCAMBIA1303-TrpC-HygrogpdA-85260-TEF1和pCAMBIA1303-TrpC-Hygro-gpdA-08010-TEF1，經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化到指狀青霉DSM62840中。篩選得到陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子之后，通過實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）測(cè)定基因的表達(dá)量以獲得干涉菌株，比較干涉菌株與野生型菌株轉(zhuǎn)化檸檬烯的能力，以研究基因PDIDSM_85260和PDIDSM_08010在檸檬烯微生物轉(zhuǎn)化過程中的作用，這不僅將為指狀青霉DSM62840生物轉(zhuǎn)化檸檬烯生產(chǎn)α-松油醇的研究提供一定的參考，還為后續(xù)其他基因的研究提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種、質(zhì)粒與試劑

指狀青霉DSM62840購(gòu)自德國(guó)微生物菌種保藏中心；質(zhì)粒pCAMBIA1303-TrpC-Hygro-gpdA-GFP和pFC332淼靈質(zhì)粒平臺(tái)；Trans1-T1 phage resistant感受態(tài)細(xì)胞北京全式金生物技術(shù)有限公司；農(nóng)桿菌AGL-1 上海唯地生物技術(shù)公司。

R-(＋)-檸檬烯 東京化工有限公司；R-(＋)-α-松油醇美國(guó)Sigma公司；卡那霉素（kanamycin，Kan）、潮霉素（hygromycin，Hyg）、利福平（rifampicin，Rif）、頭孢噻肟霉素（cefotaxime，Cefo）、2-(N-嗎啡啉)乙磺酸（2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid，MES）、乙酰丁香酮（acetosyringone，AS） 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（離心柱型）、質(zhì)粒小抽提試劑盒（離心柱型） 天根生化科技有限公司；SYBR Green Premix ProTaqHS qPCR Kit、Evo M-MLV RT Kit艾科瑞生物工程有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

麥芽酵母肉湯（malt yeast brot，MYB）培養(yǎng)基：酵母提取物3 g/L，麥芽提取物20 g/L，蛋白胨10 g/L，葡萄糖10 g/L。

Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母5 g/L，NaCl 10 g/L。

強(qiáng)化分解代謝阻抑肉湯（super optimal broth with catabolite repression，SOC）培養(yǎng)基：在950 mL水中添加蛋白胨20 g、酵母提取物5 g和NaCl 0.5 g，使其完全溶解之后添加10 mL 250 mmol/L KCl溶液，調(diào)節(jié)pH 7.0，然后定容至1 L，高壓滅菌。在使用之前在添加20 mL 1 mol/L葡萄糖溶液（過濾除菌）。

基本培養(yǎng)基（minimal medium，MM）：K-buffer 10 mL，M-N buffer 20 mL，20%葡萄糖10 mL，0.01% FeSO410 mL，20% (NH4)2SO42.5 mL，1%CaCl2·2H2O 1 mL，補(bǔ)H2O至1 L，調(diào)節(jié)pH 6.7～7.0。

誘導(dǎo)培養(yǎng)基（induction medium，IM）：K-buffer 10 mL，M-N buffer 20 mL，20%葡萄糖5 mL，0.01% FeSO410 mL，20% (NH4)2SO42.5 mL，1%CaCl2·2H2O 1 mL，50%甘油10 mL，MES 7.808 g，補(bǔ)H2O至1 L，調(diào)節(jié)pH 5.6。

共培養(yǎng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基（cocultivation induction medium，Co-IM）：K-buffer 10 mL，M-N buffer 20 mL，20%葡萄糖2.5 mL，0.01% FeSO410 mL，20% (NH4)2SO42.5 mL，l% CaCl2·2H2O 1 mL，50%甘油10 mL，MES 7.808 g，瓊脂20 g，補(bǔ)H2O至1 L，調(diào)節(jié)pH 5.6。

K-buffer：109 g K2HPO4溶于500 mL水中，用磷酸調(diào)節(jié)pH 4.9，滅菌后室溫保存；M-N buffer：15 g MgSO4·7H2O和7.5 g NaCl溶于500 mL水中，滅菌后室溫保存。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-1FD單人單面凈化工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；LDZX-50KBS立式高壓蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；6890N-5975B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀美國(guó)Agilent公司；THZ-C-1全溫振蕩器 太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；HPX-9082MBE電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；ViiA7 System熒光定量PCR儀 美國(guó)ABI公司；凝膠成像系統(tǒng)、PCR儀 美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 基因PDIDSM_85260和PDIDSM_08010的生物信息學(xué)分析

基因PDIDSM_85260和PDIDSM_08010的氨基酸序列來(lái)源于指狀青霉DSM62840基因組數(shù)據(jù)（指狀青霉DSM62840基因組數(shù)據(jù)已經(jīng)被上傳至DDBJ/ENA/GenBank，收錄號(hào)為JAAQRF000000000）。蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)分析通過在線程序Pro Param（http://web.expasy.org/protparam/）預(yù)測(cè)分析；蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)利用在線程序SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）進(jìn)行預(yù)測(cè)分析；蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)利用在線程序SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/）進(jìn)行預(yù)測(cè)分析[11]。

1.3.2 沉默載體的構(gòu)建

1.3.2.1 目的基因RNAi序列和TEF1啟動(dòng)子的擴(kuò)增

以TEF1F/R為引物、pFC332為模版，進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得pFC332上的TEF1啟動(dòng)子序列。以85260 F/R和08010 F/R為引物，指狀青霉DSM62840基因組DNA為模版[12]，進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得基因PDIDSM_85260和PDIDSM_08010的RNAi序列。引物序列見表1。PCR擴(kuò)增體系：Q5 0.5 μL，Q5 Buffer 10 μL，dNTP（10 mmol/L）2 μL，引物各2 μL，H2O 33 μL，模板（1 ng/μL 質(zhì)粒，基因組為50 ng/μL）0.5 μL。PCR擴(kuò)增程序：98 ℃預(yù)變性30 s；98 ℃變性10 s，50 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s（循環(huán)5 次）；98 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s（循環(huán)30 次）；72 ℃延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。

表1 載體構(gòu)建及real-time PCR驗(yàn)證所用引物序列Table 1 Primer sequences used for vector construction and real-time PCR verification

1.3.2.2 質(zhì)粒雙酶切處理

pCAMBIA1303-TrpC-Hygro-GPD使用50 μg/mL Kan抗性的LB培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，然后使用質(zhì)粒小抽提試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒提取。使用EcoRI和BstEII對(duì)質(zhì)粒pCAMBIA1303-TrpC-Hygro-GPD進(jìn)行雙酶切處理，37 ℃完全酶切3 h后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切結(jié)果，并對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收。酶切體系：10×Buffer 5 μL，EcoRI 1.5 μL，BstEII 1.5 μL，載體37 μL，H2O 5 μL。

1.3.2.3 重組反應(yīng)

將目的基因RNAi序列、TEF1啟動(dòng)子的PCR回收產(chǎn)物與質(zhì)粒pCAMBIA1303-TrpC-Hygro-GPD的酶切片段進(jìn)行重組反應(yīng)，重組體系：pCAMBIA1303-TrpC-Hygro-GPD酶切產(chǎn)物0.5 μL、TEF1啟動(dòng)子1 μL、85620/08010 PCR產(chǎn)物片段1 μL、Clonexpress II 1 μL、Buffer 2 μL、H2O 4.5 μL。將連接體系于37 ℃反應(yīng)30 min后立刻放置在冰上，隨后進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)。將連接產(chǎn)物熱激轉(zhuǎn)入Trans1-T1 phage resistant感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證及測(cè)序，挑選正確的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子接種于LB培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒pCAMBIA1303-TrpCHygro-gpdA-85260-TEF1和pCAMBIA1303-TrpC-HygrogpdA-08010-TEF1。

1.3.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化

將質(zhì)粒pCAMBIA1303-TrpC-Hygro-gpdA-85260-TEF1和pCAMBIA1303-TrpC-Hygro-gpdA-08010-TEF1熱激轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌AGL-1感受態(tài)細(xì)胞[13-14]，挑選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證及測(cè)序，篩選陽(yáng)性克隆。

挑取驗(yàn)證成功的農(nóng)桿菌單菌落于1 mL LB（含有50 μg/mL Kan和20 μg/mL Rif）培養(yǎng)液中，200 r/min、28 ℃培養(yǎng)24 h。然后將農(nóng)桿菌菌液加入到100 mL MM（含有50 μg/mL Kan）液體培養(yǎng)基中，200 r/min、28 ℃培養(yǎng)48 h。收集菌液，5 000×g、4 ℃離心10 min，去上清液后，用等體積IM培養(yǎng)液重懸，并用IM稀釋至OD600nm為0.4，添加AS至終濃度為200 μmol/L，于200 r/min、28 ℃培養(yǎng)至OD600nm為0.8。

指狀青霉菌絲在PDA固體培養(yǎng)基上活化后，用打孔器打取直徑相同的菌塊，浸入上述IM農(nóng)桿菌菌液孵育20 min，每隔10 min輕輕搖勻一次。之后，將菌塊用滅菌濾紙稍微吸干菌液后，轉(zhuǎn)入含有200 μmol/L AS的Co-IM固體培養(yǎng)基中，28 ℃正置培養(yǎng)。2 d后，將菌絲塊從共培養(yǎng)基上挑取下來(lái)，浸入含有400 μg/mL Cefo無(wú)菌水中孵育20 min，每隔10 min輕輕搖勻一次。菌塊用滅菌濾紙稍微吸干水分后，轉(zhuǎn)移至含有100 μg/mL Hyg和400 μg/mL Cefo的PDA固體培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)7 d，觀察菌絲生長(zhǎng)情況。

將上步獲得的新生菌絲用2 mg/mL纖維素酶消化2 h，然后再接種于新的含有100 μg/mL Hyg和400 μg/mL Cefo的PDA固體培養(yǎng)基上，進(jìn)行第2次篩選。5～7 d后，得到的再生菌絲即為轉(zhuǎn)化子。

1.3.4 干涉轉(zhuǎn)化子的驗(yàn)證

提取轉(zhuǎn)化子的RNA，以野生型菌株為對(duì)照，進(jìn)行real-time PCR驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。使用Trizol法提取RNA[15]，cDNA的合成以及real-time PCR實(shí)驗(yàn)參照Z(yǔ)hang Lulu等[6]的方法。每個(gè)基因均設(shè)置3 個(gè)技術(shù)重復(fù)和3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。β-actin作為內(nèi)參基因。real-time PCR引物見表1。

1.3.5 干涉菌株的微生物轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)

用1～2 周的野生型菌株指狀青霉DSM62840和基因PDIDSM_85260和PDIDSM_08010干涉菌株的斜面培養(yǎng)物制取孢子懸浮液，調(diào)整孢子懸浮液的濃度為1.5×107spores/mL。取1 mL孢子懸浮液接種于100 mL MYB培養(yǎng)基中，24 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)48 h。之后加入840 mg/L檸檬烯（0.22 μm過濾除菌）進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)[16]。轉(zhuǎn)化12 h之后，采用固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜（solid phase microextraction-gas chromatographymass spectrometry，SPME-GC-MS）聯(lián)用測(cè)定產(chǎn)物α-松油醇的含量[17]。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。以野生型菌株的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物α-松油醇含量為100%計(jì)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 基因PDIDSM_85260和PDIDSM_08010的生物信息學(xué)分析

根據(jù)指狀青霉DSM62840基因組測(cè)序所得到的基因PDIDSM_85260和PDIDSM_08010氨基酸序列，對(duì)其理化性質(zhì)及蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，PDIDSM_85260編碼732 個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量約為80 kDa，pI約為6.56。對(duì)其二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示含有40.44%的α-螺旋、4.92%的延伸鏈、1.91%的β-轉(zhuǎn)角、52.73%的無(wú)規(guī)卷曲。圖1A是PDIDSM_85260編碼氨基酸的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖，可以看出該蛋白含有大量的α-螺旋和無(wú)規(guī)卷曲。

PDIDSM_08010編碼512 個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量約為54 kDa，pI約為8.10。其二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示含有33.98%的α-螺旋、21.68%的延伸鏈、9.77%的β-轉(zhuǎn)角、34.57%的無(wú)規(guī)卷曲。PDIDSM_08010編碼氨基酸的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖顯示該蛋白含有大量的α-螺旋、無(wú)規(guī)卷曲和延伸鏈結(jié)構(gòu)，含有較少的β-轉(zhuǎn)角（圖1B）。

圖1 PDIDSM_85260（A）和PDIDSM_08010（B）編碼蛋白的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig. 1 Three-dimensional structure prediction of PDIDSM_85260 (A) and PDIDSM_08010 (B)

2.2 沉默載體的構(gòu)建

2.2.1 目的基因RNAi序列和TEF1啟動(dòng)子的擴(kuò)增

使用TEF1F/R為引物，以模板pFC332為模版，進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得pFC332上的TEF1啟動(dòng)子。使用85260F/R和08010F/R為引物，以指狀青霉DSM62840基因組DNA為模版，進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得基因PDIDSM_85260和PDIDSM_08010的RNAi序列。其中TEF1啟動(dòng)子大小為890 bp，PDIDSM_85260和PDIDSM_08010的RNAi序列的大小分別為283 bp和306 bp。PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖2。擴(kuò)增得到的條帶均為單一條帶，TEF1啟動(dòng)子的條帶在750～1 000 bp之間，PDIDSM_85260和PDIDSM_08010的RNAi序列的條帶在250～500 bp之間，靠近250 bp，與預(yù)期結(jié)果符合。

2.2.2 pCAMBIA1303-TrpC-Hygro-GPD質(zhì)粒雙酶切

以EcoRI和BstEII對(duì)質(zhì)粒pCAMBIA1303-TrpC-Hygro-GPD進(jìn)行雙酶切處理，37 ℃完全酶切3 h之后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切結(jié)果，結(jié)果如圖3所示。質(zhì)粒酶切之后條帶清晰，說明酶切徹底，并且大小符合預(yù)期結(jié)果。

圖3 pCAMBIA1303-TrpC-Hygro-GPD酶切產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig. 3 Agarose gel electrophoresis of enzyme-digested products of pCAMBIA1303-TrpC-Hygro-GPD

2.2.3 沉默載體的構(gòu)建

將pCAMBIA1303-TrpC-Hygro-GPD酶切骨架、TEF1啟動(dòng)子以及PDIDSM_85620/08010的RNAi片段進(jìn)行重組反應(yīng)，并轉(zhuǎn)化至Trans1-T1 Phage Resistant感受態(tài)細(xì)胞中構(gòu)建沉默載體pCAMBIA1303-TrpC-Hygro-gpdA-85260-TEF1和pCAMBIA1303-TrpC-Hygro-gpdA-08010-TEF1（圖4）。然后挑選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證。

以85260 F/08010 F、TEF1F為引物進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。PCR擴(kuò)增所得到的條帶均為單一條帶，大小約為1 200 bp，與預(yù)期符合。說明雙啟動(dòng)子沉默載體pCAMBIA1303-TrpC-Hygro-gpdA-85260-TEF1和pCAMBIA1303-TrpC-Hygro-gpdA-08010-TEF1構(gòu)建成功。挑選多個(gè)陽(yáng)性克隆測(cè)序，對(duì)比測(cè)序結(jié)果，挑選不存在堿基突變和缺失的陽(yáng)性克隆用于后續(xù)研究。

圖4 pCAMBIA1303-TrpC-Hygro-gpdA-85260-TEF1（A）和pCAMBIA1303-TrpC-Hygro-gpdA-08010-TEF1（B）載體構(gòu)建圖Fig. 4 Construction of vectors pCAMBIA1303-TrpC-Hygro-gpdA-85260-TEF1 (A) and pCAMBIA1303-TrpC-Hygro-gpdA-08010-TEF1 (B)

圖5 菌落PCR瓊脂糖凝膠電泳圖Fig. 5 Agarose gel electrophoresis of colony PCR products

2.3 沉默菌株的篩選與鑒定

選取在含Hyg平板上可以穩(wěn)定生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化子，并以野生型菌株指狀青霉DSM62840作為對(duì)照，進(jìn)行基因PDIDSM_85260和PDIDSM_08010的real-time PCR驗(yàn)證。如圖6所示，對(duì)于基因PDIDSM_85260，與野生型菌株相比，篩選得到的轉(zhuǎn)化子的表達(dá)量均有一定程度的下調(diào)，其中轉(zhuǎn)化子85260i-4、85260i-8、85260i-10的表達(dá)量分別下調(diào)了42.2%、42.1%、48%，因此，選擇這3 個(gè)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行進(jìn)一步研究。

對(duì)于基因PDIDSM_08010，與野生型菌株相比，篩選得到的轉(zhuǎn)化子的表達(dá)量均有一定程度的下調(diào)，其中轉(zhuǎn)化子08010i-1、08010i-9、08010i-10、08010i-14的表達(dá)量分別下調(diào)了41.4%、58.3%、51%、49.7%，因此，選擇這4 個(gè)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行進(jìn)一步研究。

圖6 干涉轉(zhuǎn)化子中基因相對(duì)表達(dá)量的分析Fig. 6 Relative expression levels of genes in RNAi transformants

2.4 干涉菌株的微生物轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)

為進(jìn)一步研究基因PDIDSM_85260和PDIDSM_08010的功能，以野生型菌株為對(duì)照，進(jìn)行干涉菌株的微生物轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖7所示。對(duì)于基因PDIDSM_85260，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與野生型菌株相比，轉(zhuǎn)化子85260i-4、85260i-8、85260i-10經(jīng)過微生物轉(zhuǎn)化得到的α-松油醇含量均有不同程度的下降，分別下降了17.44%、16.35%、47.27%，說明基因PDIDSM_85260可能參與調(diào)控檸檬烯的微生物轉(zhuǎn)化過程。

對(duì)于基因PDIDSM_08010，與野生型菌株相比，轉(zhuǎn)化子08010i-1、08010i-9、08010i-10、08010i-14通過微生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的α-松油醇的含量減少，尤其是08010i-9，含量下降了22.52%，說明基因PDIDSM_08010也可能參與調(diào)控檸檬烯的生物轉(zhuǎn)化過程。

3 討 論

目前，對(duì)于基因功能的研究主要有兩種方法，即增強(qiáng)基因的表達(dá)量和減弱或終止基因的表達(dá)。其中RNAi是最常用的降低基因表達(dá)量的技術(shù)。RNAi技術(shù)可以作為組學(xué)測(cè)序等技術(shù)篩選功能基因的工具，為真菌基因功能的研究提供新的見解[18-19]。對(duì)于絲狀真菌，使其自身產(chǎn)生dsRNA從而導(dǎo)致基因沉默的策略主要有兩種：發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA（hairpin RNA，hpRNA）表達(dá)系統(tǒng)和雙向啟動(dòng)子系統(tǒng)[20]。目前，已經(jīng)有大量的研究使用RNAi技術(shù)誘導(dǎo)基因沉默，從而研究基因的功能[21-22]。Isabelle等[23]利用hpRNA表達(dá)系統(tǒng)對(duì)煙曲霉（Aspergillus fumigatus）中的ALB1和FKS1基因進(jìn)行了沉默，與野生型菌株相比，ALB1和FKS1基因的表達(dá)量下降了4倍。Wang Lei等[24]也利用hpRNA表達(dá)系統(tǒng)對(duì)里氏木霉（Trichoderma reesei）中的pyr4基因進(jìn)行了沉默。Nguyen等[25]利用gpd和TrpC啟動(dòng)子在稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）中構(gòu)建雙啟動(dòng)子系統(tǒng)，在這個(gè)系統(tǒng)中有37 個(gè)基因是被靶向，從而引起不同程度的沉默。并且在該系統(tǒng)中引入了綠色熒光蛋白eGFP，可以通過熒光信號(hào)檢測(cè)菌株的沉默效率。本研究使用雙啟動(dòng)子系統(tǒng)構(gòu)建沉默載體，以指狀青霉DSM62840的基因組為模板擴(kuò)增目的基因的RNAi序列，以質(zhì)粒pFC332為模板擴(kuò)增TEF1啟動(dòng)子，然后對(duì)載體pCAMBIA1303-TrpC-Hygro-gpdA-GFP進(jìn)行酶切處理，在gpdA啟動(dòng)子后連接RNAi序列片段和TEF1啟動(dòng)子片段，構(gòu)建雙啟動(dòng)子沉默載體pCAMBIA1303-TrpC-Hygro-gpdA-85260-TEF1和pCAMBIA1303-TrpC-Hygro-gpdA-08010-TEF1，用以研究基因PDIDSM_85260和PDIDSM_08010在檸檬烯轉(zhuǎn)化過程中的作用。

微生物細(xì)胞中的物質(zhì)轉(zhuǎn)化過程錯(cuò)綜復(fù)雜，在轉(zhuǎn)化過程中可能會(huì)受各種外界因素的影響。當(dāng)微生物受到外界環(huán)境的刺激時(shí)，可以通過基因調(diào)控表達(dá)相關(guān)基因改變自身的生長(zhǎng)和代謝方式，從而減少外界因素對(duì)自身的不利影響[26]。在這個(gè)基因調(diào)控的過程中，轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮著不可或缺的作用。在真菌中最常見的轉(zhuǎn)錄因子是Zn2Cys6類鋅指蛋白，鋅指蛋白是一個(gè)龐大的轉(zhuǎn)錄因子家族，該家族含有手指狀結(jié)構(gòu)域，主要功能是調(diào)控基因的表達(dá)。研究表明Zn2Cys6類鋅指蛋白能夠參與調(diào)控真菌的基礎(chǔ)代謝、次級(jí)代謝以及藥物抗性等過程，在真菌的生長(zhǎng)和代謝過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[27-28]。在本研究中，PDIDSM_85260作為一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，其干涉菌株轉(zhuǎn)化檸檬烯得到α-松油醇的含量，與野生型菌株相比有明顯下降，說明該基因可能參與調(diào)控檸檬烯的生物轉(zhuǎn)化過程。轉(zhuǎn)錄因子PDIDSM_85260可能通過結(jié)合檸檬烯轉(zhuǎn)化生成α-松油醇過程中的重要基因的啟動(dòng)子區(qū)域調(diào)控這些基因的表達(dá)，從而直接或間接影響檸檬烯的微生物轉(zhuǎn)化過程。未來(lái)需要對(duì)PDIDSM_85260的靶標(biāo)基因、其他潛在的基因功能以及可能存在的調(diào)控通路進(jìn)行進(jìn)一步的探索。

PDIDSM_08010，即DLD是一種NAD＋依賴的氧化還原酶，參與三羧酸循環(huán)。在受到外界因素的刺激下，DLD能夠影響活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）的生成和清除以及三羧酸循環(huán)[29]。Jaewang等[30]研究發(fā)現(xiàn)DLD能夠誘導(dǎo)ROS、脂質(zhì)過氧化和亞鐵的積累。研究指出DLD能夠通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)ATP的生成、第二信使分子cAMP的生成以及ROS的生成和清除調(diào)控細(xì)胞內(nèi)類固醇激素的合成[31]。研究發(fā)現(xiàn)與野生型菌株相比，PDIDSM_08010的干涉菌株轉(zhuǎn)化檸檬烯得到α-松油醇的含量顯著下降，這說明該基因可能參與調(diào)控檸檬烯的生物轉(zhuǎn)化過程。推測(cè)DLD可能通過調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的ATP含量、ROS等調(diào)節(jié)檸檬烯的微生物轉(zhuǎn)化過程。

4 結(jié) 論

利用RNAi技術(shù)構(gòu)建了PDIDSM_85260和PDIDSM_08010的干涉載體pCAMBIA1303-TrpC-HygrogpdA-85260-TEF1和pCAMBIA1303-TrpC-Hygro-gpdA-08010-TEF1，經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化到指狀青霉DSM62840中。通過Hyg抗性篩選得到陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，real-time PCR結(jié)果顯示與野生型菌株相比，基因PDIDSM_85260和PDIDSM_08010干涉轉(zhuǎn)化子的表達(dá)量均有所下降，說明干涉菌株構(gòu)建成功。此外，干涉菌株的微生物轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與野生型菌株相比，干涉菌株轉(zhuǎn)化檸檬烯得到α-松油醇含量均有不同程度的下降，說明基因PDIDSM_85260和PDIDSM_08010可能參與調(diào)控檸檬烯生物轉(zhuǎn)化生成α-松油醇的過程。