陳 燕，趙仁勇，張璐璐

河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001

指狀青霉(Penicilliumdigitatum)不僅是導(dǎo)致柑橘類水果腐敗變質(zhì)的主要病原菌之一[1]，同時也是一類應(yīng)用前景廣闊的微生物資源。指狀青霉DSM 62840能夠參與檸檬烯的微生物轉(zhuǎn)化，并且能夠?qū)幟氏┺D(zhuǎn)化生成α-松油醇[2]。α-松油醇(alpha-Terpineol)是一種具有紫丁香香氣的單環(huán)萜醇類化合物，是我國重要的出口香料品種[3]。由于α-松油醇獨特的感官特性以及抗菌、抗氧化、抗驚厥、抗炎癥、抗?jié)?、抗腹瀉、抗痙攣、抗癌等生物學(xué)活性[4-7]，其已經(jīng)在食品、化妝品、農(nóng)藥、醫(yī)學(xué)等行業(yè)中被廣泛應(yīng)用。

張璐璐等[8]發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子PDIDSM_85260可能是指狀青霉轉(zhuǎn)化檸檬烯生產(chǎn)α-松油醇過程中的一個重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。該編碼基因含有一個類似GAL4型的Zn2Cys6雙核簇DNA結(jié)合域(GAL4-like Zn2Cys6binuclear cluster DNA-binding domain, GAL4)和一個真菌轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控域(fungal transcription factor regulatory middle homology region, fungal_TF_MHR)。沉默該基因能夠影響檸檬烯的微生物轉(zhuǎn)化，降低α-松油醇的生成量。鋅指蛋白屬于指狀結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，主要負責調(diào)控基因的表達[9-10]。Zn2Cys6型轉(zhuǎn)錄因子是真菌特有的鋅指類轉(zhuǎn)錄因子，對其基礎(chǔ)代謝、次級代謝及抗藥性等具有調(diào)控功能，在真菌的生長和代謝過程中發(fā)揮著重要的作用[11-13]。當面臨不同環(huán)境脅迫的情況時，真菌能夠通過啟動轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子對菌體的生長、繁殖以及相關(guān)代謝途徑進行適應(yīng)性轉(zhuǎn)錄調(diào)控，從而對不同次級代謝產(chǎn)物的合成和分泌造成影響[14-15]。

真菌的形態(tài)分化常伴隨著代謝物的合成，因此對真菌調(diào)控基因及其表型的研究有助于后續(xù)代謝產(chǎn)物的研究。作者在前期研究的基礎(chǔ)上，比較基因PDIDSM_85260的沉默型菌株與野生型菌株在孢子萌發(fā)過程、菌絲形態(tài)、菌株生長速率、氧化脅迫、鹽脅迫等方面的差異，探究轉(zhuǎn)錄因子PDIDSM_85260在指狀青霉生長過程中的生理功能，為進一步研究PDIDSM_85260的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野生型菌株指狀青霉DSM 62840購自德國微生物菌種保藏中心?；騊DIDSM_85260沉默型菌株通過RNA干擾技術(shù)獲得[8]。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar，PDA)培養(yǎng)基：稱取4.6 g PDA粉末溶于100 mL水中。

NaCl、吐溫80：天津市大茂化學(xué)試劑廠；H2O2：洛陽昊華化學(xué)試劑有限公司；KCl、CaCl2、CuCl2、FeSO4、MgSO4：分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MB-11-2光學(xué)顯微鏡：海彼愛姆光學(xué)儀器制造有限公司；101培養(yǎng)箱：北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；YX280/15高壓蒸汽滅菌鍋：上海三申醫(yī)療器械有限公司；SP-DJ超凈工作臺：上海浦東物理光學(xué)儀器制造廠；血球計數(shù)板：上海市求精生化試劑有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 指狀青霉DSM 62840孢子懸浮液的配制

孢子懸浮液的配制參考臺亞楠[16]的方法，并稍做修改。將在PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d的指狀青霉孢子用無菌接種環(huán)輕輕刮下，并懸浮在含有0.1%吐溫80的無菌水中，輕輕搖動使菌絲分布均勻，然后對懸浮液進行過濾，除去其中的菌絲和培養(yǎng)基碎片等雜質(zhì)，最終得到孢子懸浮液。將少量懸浮液滴在血球計數(shù)板上并進行計數(shù)，配制終濃度為1.0×106spores mL-1的孢子懸浮液，待后續(xù)試驗使用。

1.3.2 基因PDIDSM_85260對指狀青霉孢子萌發(fā)過程的影響

配制0.5% PDA培養(yǎng)基，將其置于已滅菌的載玻片上并等待凝固。接種5 μL濃度為1.0×106spores mL-1的野生型菌株和沉默型菌株的孢子懸浮液于培養(yǎng)基上，并將其放在滅菌的培養(yǎng)皿中，每個載玻片接種3處。置于25 ℃的條件下分別培養(yǎng)8 h和12 h，觀察孢子的萌發(fā)情況。孢子長度大于直徑的1/2則為萌發(fā)的孢子。

孢子萌發(fā)率的計算公式如下：

1.3.3 基因PDIDSM_85260對指狀青霉菌絲形態(tài)的影響

將200 μL濃度為1.0×106spores mL-1的野生型菌株和沉默型菌株的孢子懸浮液接種在PDA培養(yǎng)基上，均勻涂布后斜插入蓋玻片于培養(yǎng)基中。25 ℃的條件下培養(yǎng)72 h，待菌絲爬上蓋玻片，將其取出，并在顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)。

1.3.4 基因PDIDSM_85260對指狀青霉生長的影響

將200 μL濃度為1.0×106spores mL-1的野生型菌株和沉默型菌株的孢子懸浮液均勻涂布在PDA培養(yǎng)基上，培養(yǎng)至平板剛長出菌絲且無分生孢子出現(xiàn)即可。在PDA平板上用直徑8 mm的打孔器均勻地打出多個小菌餅，用無菌鑷子將小菌餅反貼至PDA培養(yǎng)基中。在25 ℃的條件下培養(yǎng)8 d，每日定時觀察并采用十字交叉法測量菌餅直徑。試驗重復(fù)3次。

1.3.5 基因PDIDSM_85260對不同離子脅迫環(huán)境下指狀青霉生長特性的影響

將200 μL濃度為1.0×106spores mL-1的野生型菌株和沉默型菌株的孢子懸浮液均勻涂布在PDA培養(yǎng)基上，培養(yǎng)至平板剛長出菌絲且無分生孢子出現(xiàn)即可。在PDA平板上用直徑8 mm的打孔器均勻地打出多個小菌餅，并將小菌餅反貼至含有不同濃度的FeSO4、MgSO4、NaCl、KCl、CuCl2和CaCl2的PDA培養(yǎng)基中。在25 ℃的條件下培養(yǎng)8 d，每日定時觀察并采用十字交叉法測量菌餅直徑。試驗重復(fù)3次。以正常PDA培養(yǎng)條件下野生型菌株和沉默型菌株的菌餅直徑作為空白對照，計算離子脅迫條件下各菌株的相對抑制率。

相對抑制率=(PDA中各菌株菌餅直徑-脅迫條件下各菌株菌餅直徑)/PDA中各菌株菌餅直徑×100%。

1.3.6 基因PDIDSM_85260對活性氧脅迫環(huán)境下指狀青霉生長特性的影響

將200 μL濃度為1.0×106spores mL-1的野生型菌株和沉默型菌株的孢子懸浮液均勻涂布在PDA培養(yǎng)基上，培養(yǎng)至平板剛長出菌絲且無分生孢子出現(xiàn)即可。在PDA平板上用直徑8 mm的打孔器均勻地打出多個小菌餅，并將小菌餅反貼至含有不同濃度的H2O2的PDA培養(yǎng)基中。在25 ℃的條件下培養(yǎng)8 d，每日定時觀察并采用十字交叉法測量菌餅直徑。試驗重復(fù)3次。以正常PDA培養(yǎng)條件下野生型菌株和沉默型菌株的菌餅直徑作為空白對照，計算活性氧脅迫條件下各菌株的相對抑制率。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Excel和GraphPad Prism 5軟件處理數(shù)據(jù)和作圖，采用SPSS 24.0軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，并應(yīng)用鄧肯法對其進行顯著性分析(P<0.05，P<0.01)。所有數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)試驗所得。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因PDIDSM_85260對指狀青霉孢子萌發(fā)過程的影響

孢子萌發(fā)率是表明孢子活性的一個重要指標。為了研究基因PDIDSM_85260對指狀青霉孢子萌發(fā)過程的影響，本試驗對指狀青霉野生型菌株和PDIDSM_85260沉默型菌株進行了孢子萌發(fā)情況的測定。如圖1所示，在孢子萌發(fā)試驗中，萌發(fā)8 h時，野生型菌株的孢子萌發(fā)率為77%，沉默型菌株的孢子萌發(fā)率為78%，無顯著差異；萌發(fā)12 h時，野生型菌株和沉默型菌株的孢子萌發(fā)率分別為92%和93%。結(jié)果表明，基因PDIDSM_85260對指狀青霉孢子萌發(fā)過程的影響較小。

圖1 基因PDIDSM_85260對指狀青霉DSM 62840孢子萌發(fā)過程的影響Fig.1 Effect of PDIDSM_85260 on spore germination of Penicillium digitatum DSM 62840

2.2 基因PDIDSM_85260對指狀青霉菌絲形態(tài)的影響

為了研究基因PDIDSM_85260對指狀青霉菌絲形態(tài)的影響，本試驗利用顯微鏡觀察了指狀青霉野生型菌株和PDIDSM_85260沉默型菌株的菌絲形態(tài)。由圖2可知，在野生型菌株和沉默型菌株中，均觀察到菌絲生長形態(tài)似掃帚狀且枝較大，孢子梗頂端形成多個分支，菌株的分生孢子多為串生，形狀似橢圓，與其他研究人員所觀察到指狀青霉的菌絲形態(tài)結(jié)果一致[17-19]。結(jié)果表明基因PDIDSM_85260對指狀青霉菌絲形態(tài)的影響較小。

圖2 基因PDIDSM_85260對指狀青霉DSM 62840菌絲生長形態(tài)的影響Fig.2 Effect of PDIDSM_85260 on the mycelial morphology of Penicillium digitatum DSM 62840

2.3 基因PDIDSM_85260對指狀青霉生長的影響

菌落形態(tài)的觀察可以發(fā)現(xiàn)菌落是否正常生長，菌餅直徑是菌絲生長量的直觀反映。為了研究基因PDIDSM_85260對指狀青霉生長的影響，本試驗將指狀青霉野生型菌株和PDIDSM_85260沉默型菌株的菌餅分別反貼于PDA培養(yǎng)基中，觀察其生長情況，結(jié)果如圖3所示。由圖3a可知，沉默型菌株的菌餅直徑明顯大于野生型菌株，但菌落形態(tài)無顯著差別。進一步測定菌絲體的生長曲線(圖3b)發(fā)現(xiàn)，沉默型菌株的菌落直徑在整個培養(yǎng)期間均大于野生型菌株。結(jié)果表明基因PDIDSM_85260會影響指狀青霉的生長，基因PDIDSM_85260沉默會導(dǎo)致指狀青霉生長速率增加，產(chǎn)孢量增加，但菌落形態(tài)無明顯差別。

注：*表示存在顯著性差異(P<0.05)，**表示存在極顯著性差異(P<0.01)。圖4、圖5同。圖3 基因PDIDSM_85260對指狀青霉DSM 62840生長的影響Fig.3 Effect of PDIDSM_85260 on the growth of Penicillium digitatum DSM 62840

2.4 基因PDIDSM_85260對不同離子脅迫環(huán)境下指狀青霉生長特性的影響

為了研究基因PDIDSM_85260對不同離子脅迫環(huán)境下指狀青霉生長特性的影響，本試驗測定了指狀青霉野生型菌株和沉默型菌株在Na+、K+、Mg2+、Cu2+、Fe2+、Ca2+6種金屬離子脅迫環(huán)境下的相對抑制率，結(jié)果如圖4所示。

指狀青霉Na+和K+脅迫試驗的結(jié)果(圖4a和4b)顯示，隨著Na+和K+濃度(0～1.5 mol·L-1)的增加，野生型菌株和沉默型菌株均出現(xiàn)生長抑制的現(xiàn)象，在1.5 mol·L-1的Na+和K+脅迫環(huán)境下，野生型菌株的相對抑制率分別是84.66%和71.16%，沉默型菌株的相對抑制率分別是87.80%和73.04%。此外，在Na+的脅迫下，沉默型菌株的相對抑制率顯著高于野生型菌株，基因PDIDSM_85260沉默增加了指狀青霉對Na+的敏感性，表明基因PDIDSM_85260參與了指狀青霉Na+脅迫的應(yīng)答反應(yīng)。在K+的脅迫下，沉默型菌株在低濃度(0.5 mol·L-1)下的相對抑制率顯著低于野生型菌株(P<0.05)，在高濃度(1.0、1.5 mol·L-1)下不顯著。

指狀青霉Ca2+和Mg2+脅迫試驗的結(jié)果(圖4a和4b)顯示，隨著Ca2+濃度的增加，野生型菌株和沉默型菌株均出現(xiàn)生長抑制的現(xiàn)象，野生型菌株在低濃度(0.5、0.7 mol·L-1)下的相對抑制率顯著低于沉默型菌株(P<0.05)，在高濃度(1.0 mol·L-1)下不顯著。隨著Mg2+濃度的增加，野生型菌株和沉默型菌株在不同濃度下均抑制生長，但相對抑制率沒有顯著差別。

指狀青霉Fe2+和Cu2+脅迫試驗的結(jié)果(圖4a和4b)顯示，隨著Fe2+濃度(0～5 mmol·L-1)的增加，野生型菌株和沉默型菌株均出現(xiàn)生長抑制

圖4 基因PDIDSM_85260對指狀青霉DSM 62840離子脅迫環(huán)境適應(yīng)性的影響Fig.4 Effect of PDIDSM_85260 on environmental adaptability of Penicillium digitatum DSM 62840 to ion stress

的現(xiàn)象，在5 mmol·L-1的Fe2+脅迫環(huán)境下，野生型菌株和沉默型菌株的相對抑制率分別是72.62%和82.95%。此外，在Fe2+的脅迫下，沉默型菌株的相對抑制率均顯著高于野生型(P<0.05)，基因PDIDSM_85260沉默增加了指狀青霉對Fe2+的敏感性，表明基因PDIDSM_85260參與了指狀青霉Fe2+脅迫的應(yīng)答反應(yīng)。隨著Cu2+濃度(0～0.5 mmol·L-1)的增加，沉默型菌株均出現(xiàn)生長抑制的現(xiàn)象，在0.5 mmol·L-1的Cu2+脅迫環(huán)境下，沉默型菌株的相對抑制率是21.05%。值得注意的是，當Cu2+濃度為0.1、0.5 mmol·L-1時，野生型菌株抑制生長，但Cu2+濃度為0.3 mmol·L-1時，野生型菌株出現(xiàn)促進生長的現(xiàn)象，這可能是由于Cu2+作為生物體中某些酶的輔酶或激活因子參與反應(yīng)，在Cu2+脅迫環(huán)境下，真菌可以調(diào)節(jié)體內(nèi)Cu2+穩(wěn)態(tài)從而維持生長[20-21]。

2.5 基因PDIDSM_85260對活性氧脅迫環(huán)境下指狀青霉生長特性的影響

指狀青霉氧化脅迫敏感性試驗結(jié)果(圖5)表明：隨著H2O2濃度的增加，野生型菌株與沉默型菌株均出現(xiàn)低濃度(10 mmol·L-1)促進生長現(xiàn)象，增長率分別為0.03%和4.94%；高濃度(20、40 mmol·L-1)抑制生長，且沉默型菌株的相對抑制率均高于野生型菌株。在40 mmol·L-1的H2O2脅迫環(huán)境下，野生型菌株的相對抑制率為24.41%，沉默型菌株的相對抑制率為32.78%，以上結(jié)果表明，基因PDIDSM_85260參與了指狀青霉氧脅迫的應(yīng)答反應(yīng)。

圖5 基因PDIDSM_85260對指狀青霉DSM 62840在H2O2脅迫環(huán)境下的影響Fig.5 Effect of PDIDSM_85260 on environmental adaptability of Penicillium digitatum DSM 62840 to H2O2 stress

3 討論與結(jié)論

轉(zhuǎn)錄因子能夠與特定目的基因的5′端上游序列特異性結(jié)合，使目的基因在一定的空間和時間內(nèi)按照特定的強度進行表達，調(diào)控生物體的生長發(fā)育和脅迫應(yīng)答。Zn2Cys6型轉(zhuǎn)錄因子是真菌生長發(fā)育過程中重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，參與調(diào)節(jié)絲狀真菌的初級代謝、次級代謝過程以及外界脅迫應(yīng)答反應(yīng)，影響菌體的耐受性、生長形態(tài)以及次級代謝產(chǎn)物的合成和分泌[22]。有研究表明缺失Zn2Cys6型轉(zhuǎn)錄因子PdMut3會影響指狀青霉的致病力、菌株的生長、分生孢子發(fā)育、菌絲形態(tài)以及細胞壁的完整性[23]。含有Zn2Cys6結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子TP05746能夠通過調(diào)控相關(guān)基因的表達來調(diào)節(jié)褐紅籃狀菌菌絲的生長及分生孢子的形成[24]。Son等[25]的研究表明Zn2Cys6型轉(zhuǎn)錄因子ZcfA基因能夠影響擬曲霉和黃曲霉菌絲的生長以及分生孢子萌發(fā)，過表達ZcfA基因能夠提高菌株的產(chǎn)孢量和菌餅直徑，而缺失該基因則會導(dǎo)致菌株的菌餅直徑和產(chǎn)孢量小于野生型菌株。而在Wang等[26]的研究中，缺失Zn2Cys6型轉(zhuǎn)錄因子MoIRR基因并不影響稻瘟病菌菌絲的生長、分生孢子產(chǎn)生以及孢子萌發(fā)。在本研究中，基因PDIDSM_85260沉默型菌株的孢子萌發(fā)率和菌絲形態(tài)與野生型菌株相比沒有顯著差異，說明轉(zhuǎn)錄因子PDIDSM_85260對指狀青霉孢子萌發(fā)過程和菌絲形態(tài)的影響較小。然而，基因PDIDSM_85260能夠影響指狀青霉的生長，基因PDIDSM_85260沉默會導(dǎo)致指狀青霉生長速率增加、產(chǎn)孢量增加，但菌落形態(tài)無明顯差別。

Zn2Cys6型轉(zhuǎn)錄因子能夠參與調(diào)節(jié)真核生物的離子穩(wěn)態(tài)。在本研究中，除Cu2+以外，在其他金屬離子脅迫環(huán)境下，野生型菌株和基因PDIDSM_85260的沉默型菌株均表現(xiàn)出生長抑制的現(xiàn)象，這可能是由于高鹽環(huán)境破壞了真菌細胞的滲透壓，造成細胞質(zhì)壁分離，抑制真菌的生長[27-28]。此外，基因PDIDSM_85260沉默型菌株對胞外高濃度的K+、Na+、Fe2+和Ca2+的敏感性較高，推測是由于沉默型菌株維持離子穩(wěn)態(tài)的功能存在缺陷導(dǎo)致其對金屬離子的敏感性增加，表明轉(zhuǎn)錄因子PDIDSM_85260在維持細胞離子穩(wěn)態(tài)方面起重要的作用。Ma等[29]的研究發(fā)現(xiàn)Na+、Ca2+和Mg2+能夠抑制指狀青霉菌株的生長，并且PdMpkB基因缺失會增加對鹽脅迫的敏感性，說明PdMpkB基因參與指狀青霉鹽脅迫的應(yīng)答反應(yīng)。李執(zhí)[30]研究也發(fā)現(xiàn)，缺失全局調(diào)控因子McrA會導(dǎo)致黑曲霉對Na+環(huán)境的敏感性升高，但對K+、Cu2+和Zn2+環(huán)境的敏感性降低，并且低濃度的Cu2+環(huán)境有益于黑曲霉菌株的生長，表明McrA對黑曲霉表型的調(diào)控可能受環(huán)境的影響。

Zn2Cys6型轉(zhuǎn)錄因子在維持真核生物氧化應(yīng)激方面也發(fā)揮著一定作用。H2O2被認為是活性氧的主要化合物之一，可能抑制絲狀真菌的生長[31]。添加H2O2會增加菌株胞內(nèi)的活性氧(reactive oxygen species, ROS)含量，當細胞內(nèi)的H2O2達到一定濃度時，能夠?qū)е录毎撕途€粒體等生物體迅速氧化，致使細胞死亡[32]。Chen等[33]研究表明Zn2Cys6型轉(zhuǎn)錄因子Bbcmr1能夠參與絲狀真菌球孢白僵菌分生孢子的成熟過程，調(diào)節(jié)細胞壁結(jié)構(gòu)和細胞壁相關(guān)蛋白的表達以及海藻糖的合成。在H2O2脅迫環(huán)境下，與野生型菌株相比，缺失Bbcmr1會導(dǎo)致分生孢子萌發(fā)率降低23%，表明Bbcmr1對球孢白僵菌的調(diào)控受氧脅迫的影響。李國旗[34]研究發(fā)現(xiàn)缺失PdCaMK1基因增加了指狀青霉對H2O2的耐受性，表明PdCaMK1參與了指狀青霉氧化脅迫的應(yīng)答反應(yīng)。王地廣等[35]也發(fā)現(xiàn)Zn2Cys6型轉(zhuǎn)錄因子CsGcc1參與調(diào)控暹羅炭疽菌對H2O2的敏感性，CsGcc1的缺失會造成敲除菌株對H2O2更加敏感。在本研究中，高濃度的H2O2能夠抑制指狀青霉菌株的生長，并且基因PDIDSM_85260沉默使得指狀青霉對H2O2脅迫的敏感性增加，表明轉(zhuǎn)錄因子PDIDSM_85260在維持活性氧水平和氧化應(yīng)激方面起重要的作用。

綜上所述，轉(zhuǎn)錄因子PDIDSM_85260在指狀青霉的生長、離子穩(wěn)態(tài)系統(tǒng)的維持、活性氧水平和氧化應(yīng)激方面發(fā)揮著重要作用。本研究為進一步了解轉(zhuǎn)錄因子PDIDSM_85260的功能奠定了一定基礎(chǔ)。