大白豬TLR5 基因新變異位點檢測及其與部分免疫指標的關聯分析

杜小妹，盛思思，喬蘇濰，陳曉蕾，董理月，吳正常

（揚州大學動物科學與技術學院，江蘇 揚州 225009）

Toll 樣受體（Toll-like receptor，TLRs）是動物天然免疫體系的重要成分之一，可識別病原微生物具有的保守結構分子，可檢測微生物感染并觸發(fā)抗菌宿主的防御反應，參與構成防御感染性疾病的第一條防線。Toll樣受體5（Toll-like receptor 5，TLR5）是TLRs家族中的一個成員，TLR5可以被細菌鞭毛蛋白激活，構成機體反抗病原菌的第一線防御機構，并且對機體內部的免疫穩(wěn)態(tài)影響明顯，在脊椎動物中高度保守。哺乳動物TLR5受體可以識別和認證革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌中鞭毛蛋白，并且在激活核因子NF-kappaB之后刺激腫瘤壞死因子的產生。Dai等人研究發(fā)現，TLR5基因下調表達降低仔豬小腸上皮細胞與大腸桿菌F18黏附水平，進而提高機體對大腸桿菌F18感染的抗性。因此，在豬抵抗外源病原菌感染過程中，TLR5基因發(fā)揮重要的免疫應答作用。

由單獨一個核苷酸的變異所引起的基因組水平上DNA序列的多態(tài)性稱為單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）。到目前為止，關于基因編碼區(qū)SNP的研究大多集中在外顯子區(qū)這一方面。Albayda等研究發(fā)現，TLR5啟動子的遺傳變異可能改變該基因的表達，并可能作為分子標記用于確定豬的病原菌敏感性或抗性模式；Muneta等通過對幾個豬品種的等位基因特異性引物聚合酶鏈反應進行研究發(fā)現，TLR5特異性SNP對配體識別有一定程度的影響，并且通過消除或選擇豬TLR5的這種特異性SNP，可以增強豬對沙門氏菌腸道血清型霍亂沙門氏菌感染的抵抗力。Yang等對TLR5多個外顯子區(qū)SNP進行研究，發(fā)現SNPs c.1246A＞T和c.1269G＞A顯著性影響白細胞介素IL-2表達水平，而SNPs c.834T＞G和c.1398C＞T顯著性影響IL-10的表達水平，這些突變可能與鞭毛蛋白識別有關。然而，目前關于TLR5內含子區(qū)SNP的研究鮮有報道，本研究以大白豬為試驗對象，用PCR-SSCP方法測定TLR5基因內含子G2152A位點多態(tài)性分布，并分析其對IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、TGF-β和TGF-α等重要細胞因子水平的影響，旨在尋覓和大白豬免疫應答有關的遺傳標記，為今后大白豬的抗病育種和分子選育提供一定的理論指導依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

61頭大白豬來自揚州創(chuàng)日畜牧科技有限公司，分別采集每頭大白豬約1.0 g耳組織樣，然后投入1.5 mL的離心管內，置于放有冰的保溫盒中帶回實驗室，為提取基因組DNA做好準備工作。

1.2 基因組DNA 的提取

用常規(guī)酚-氯仿抽提法取耳組織基因組DNA，然后用NanoDrop ND-1000核酸/蛋白濃度測定儀測定DNA濃度和純度，取10μL的DNA樣本，根據原始濃度水平向其加入相應量的雙蒸水溶液，稀釋至100 ng/μL的濃度水平后，保存于4℃的冰箱備用。

1.3 引物設計

按照GenBank上公布的豬TLR5基因組序列（GenBank登錄號為NC_010452.4），用Primer Premier 5.0軟件設計特異性好、擴增效率高的引物。引物制備主要由上海生工生物工程技術服務有限公司完成，相關引物序列見表1。

表1 引物信息

1.4 PCR 擴增

PCR擴增反應系統(tǒng)（20 μL）的制備方法：100 ng/μL模板DNA 1μL，PCR Master-Mix 10 uL，10 pmol/L上、下游引物各1 μL，加滅菌水補足反應系統(tǒng)至20 μL。將上邊所說的體系配比完成，進行完全且足量的振蕩使其混勻，離心片刻，將其轉移至PCR儀中進行擴增。PCR擴增反應條件要求為：在95℃條件下進行5 min預變性；在95℃條件下進行30 s變性，在58.5℃條件下退火30 s，然后在72℃條件下延伸30 s，總共經歷35個循環(huán)；隨后在72℃條件下再延伸10 min；最后4 ℃保存。分別在各反應系統(tǒng)中取3 μL PCR產物，然后采用2%瓊脂糖凝膠電泳最后驗證。

1.5 PCR-SSCP 分析

PCR擴增后得到的產物通過2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，在微型PCR管中加入5 μL PCR擴增產物與5 μL變性劑，充分振蕩混勻，瞬時離心，置PCR儀98℃變性15 min，然后迅速轉入冰箱-2 0 ℃中靜置10 min，隨后使用12%非變性聚丙烯酰胺凝膠點樣，配置比例為Acr∶ Bis=39∶1，在130 V條件下進行12 h電泳，電泳結束后進行對其銀染分析。按照SSCP基因型檢測的結果，分別選擇5個不同帶型個體的PCR產物，送至公司檢測，并按照測序的結果對產物進行基因型統(tǒng)計分析。

1.6 部分免疫指標的測定

生豬宰殺之前，先對生豬進行前腔靜脈采血，并采用常規(guī)分離血清的方法得到新鮮血清，隨后用豬多細胞因子檢測試劑盒（ProcartaPlex Porcine Basic Kit，ThermoFisher）對樣本血清進行處理，通過酶標儀（Tecan，南京科麟得科學儀器有限公司）檢測出樣本對應的熒光值，最后按照標準曲線測定血清中白細胞介素（IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10）、轉化生長因子（TGF-α、TGF-β）的濃度。

1.7 統(tǒng)計分析

將基因型數據進行整理后使用卡方分析計算遺傳平衡定律；隨后用SPSS 25.0軟件的一般線性模型（General linear model，GLM）計算大白豬不同基因型的免疫指標差異；通過 PopGene 32軟件及PIC軟件進行遺傳多態(tài)性分析。

2 結果與分析

2.1 基因組DNA 的提取

參考GenBank數據庫上公布的豬TLR5基因序列信息，PCR擴增得到1條長度為174 bpTLR5基因片段，如圖1所示，PCR產物通過2%瓊脂糖檢測驗證其長度與預期的擴增片段大小相同。

圖1 TLR5 基因G2152A 位點PCR 產物電泳圖

2.2 PCR-SSCP 結果

在擴增區(qū)，找到了7個突變基因位點以及1對等位基因，并且檢測到了3種基因型，它們分別為AA、AG和GG（圖2所示）。經PCR擴增后得到的產物經過12%非變性聚丙烯酰胺凝膠，在130 V條件下進行電泳，銀染分析結果如圖3。

圖2 AA、AG 和GG 基因型在G2152A位點A/G 突變測序峰圖

圖3 TLR5 基因G2152A 位點3 種基因型的非變性聚丙烯酰胺凝膠圖

2.3 TLR5 等位基因及不同基因型頻率在大白豬中的分布

按照實驗中電泳圖譜的結效果，對大白豬TLR5基因G2152A位點的基因型進行判斷。根據表2分析顯示，在該位點處發(fā)現3種基因型：AA、AG和GG，其中GG基因型為優(yōu)勢基因型，且G為優(yōu)勢等位基因。經卡方適合性檢驗，發(fā)現在大白豬中TLR5基因G2152A位點恰好達到了Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P＞0.05）。如表3所示，TLR5的PIC為0.252，高于0.25，為中度多態(tài)性。

表2 大白豬TLR5 基因G2152A 位點的基因型頻率和基因頻率

表3 大白豬TLR5 基因G2152A 位點的遺傳特性

2.4 大白豬TLR5 基因G2152A 位點多態(tài)性與部分免疫指標關聯分析

大白豬T L R 5基因內含子G2152A位點多態(tài)性與部分免疫指標關聯分析，結果如表4所示，對細胞因子IL-4水平進行剖析，基因型為AG的個體該細胞因子的水平明顯超過GG和AA基因型（P＜0.05）；另有基因型為AG的個體其細胞因子IL-8和TGF-β水平都極顯著高于AA和GG基因型的個體（P＜0.01）。

表4 大白豬TLR5 基因G2152A 位點與免疫相關指標統(tǒng)計表

3 討論

大量研究顯示，TLR5可以對鞭毛蛋白進行特異性識別，誘發(fā)機體的免疫反應和炎癥反應。有研究表明，TLR5已允許哺乳動物專門檢測鞭毛狀細菌病原體。關于鞭毛蛋白的免疫刺激作用，新的研究發(fā)現，fliC基因的靶向基因修飾產生一種生物活性免疫刺激鞭毛蛋白，該鞭毛蛋白上調TLR5下游基因以及flFliC基因。有研究發(fā)現，CD11c固有層細胞通過TLR5檢測腸道內的致病菌，并被腸道內的致病菌所利用。該發(fā)現可以為腸道致病菌的檢測提供一定的參考。定位于內含子的SNP也有可能通過影響選擇性剪接和mRNA穩(wěn)定性來調節(jié)基因表達。本研究TLR5基因內含子G2152A突變在大白豬群體中存在多態(tài)性分布，且該位點優(yōu)勢等位基因為A，反映出群體多態(tài)性分布恰好達到了Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P＞0.05），這說明TLR5基因的保守性很強，長期的自然選擇和人工選擇沒有對大白豬TLR5基因造成影響。關于TLR5基因SNP的相關研究已有報道，楊秀芹等以民豬和長白豬為實驗對象，發(fā)現編碼區(qū)834T＞G點突變時，長白豬和民豬優(yōu)勢等位基因分別為T和G，且長白豬中沒有檢測出基因型GG，由此，我們推測這種基因型分布差異可能與民豬的抗病力/抗逆性強有關。與國外豬種相比，中國本地豬種的TLR5基因具有較高的遺傳多樣性和較多的單倍型。雖然人們?yōu)榱烁纳萍倚筮M行了密集的育種，但在不同的豬品種中，TLR基因的異質性得到了保留。推測TLR基因可能有利于提高豬種群的生存可能性。Muneta等通過研究首次證明TLR識別的損害會影響豬體內對疾病的易感性，具有豬TLR5（C1205T）的T等位基因的仔豬對鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium，ST）感染的抗性受損。此外，長白豬中在該位點T等位基因的敲除將導致其對ST感染的抗性增強。

此外，一些重要細胞因子如白細胞介素、腫瘤壞死因子等可以衡量動物機體一般免疫抗病能力。本實驗中，發(fā)現白細胞介素（IL-4和IL-8）、轉化生長因子TGF-β水平在大白豬不同基因型個體間存在顯著差異。研究顯示，轉化生長因子β（TGF-β）在細胞生長、增殖分化以及免疫應答等過程中發(fā)揮重要的角色，高小平等利用II型豬鏈球菌進行小鼠攻毒試驗，發(fā)現TGF-β介導炎癥反應來影響豬鏈球菌易感性。豬腎細胞（PK-15）被豬細小病毒（Porcine Parvovirus，PPV）感染后，TGF-β1通過抑制細胞免疫力進而引起PPV相關疾病的發(fā)生。本試驗中，發(fā)現細胞因子TGF-β含量在大白豬AG基因型個體中顯著較高，表明AG基因型個體可能具有較強的抗炎能力。此外，許多研究表明白細胞介素4（IL-4）在部分免疫細胞（巨噬細胞、B細胞、T細胞等）中均有一定的免疫調控作用，特別是過敏性炎癥中尤為重要。IL-8作為中性粒細胞趨化因子，除了參與炎癥反應外，其表達水平可以顯著影響豬血管內皮細胞的增殖、遷移以及對造血干細胞的分化作用。本研究發(fā)現在大白豬中，基因型為AG的個體中IL-4和IL-8兩種細胞因子的水平顯著高于其他基因型個體，由此推測AG基因型個體的大白豬可能具有更強的抗炎能力、抗過敏以及血管再生能力。

4 結論

綜合分析表明，TLR5基因在大白豬群體中存在G2152A突變，并且AG基因型個體在抗炎、抗過敏以及血管再生等自身免疫力方面可能優(yōu)于其他基因型個體，這提示今后有必要將TLR5基因G2152A位點作為大白豬抗病育種的潛在遺傳標記開展進一步研究。