黃圓圓，王明慧，何麗艷，熊澤恩，陳 潔，Shaukat ALI，孟建玉，桑 文*

(1. 華南農(nóng)業(yè)大學植物保護學院 / 生物防治教育部工程研究中心，廣東廣州 510640；2. 貴州省煙草科學研究院，貴州 貴陽 550081)

斜紋夜蛾(Spodoptera litura)屬于鱗翅目夜蛾科 昆蟲，在亞洲、歐洲及非洲均有分布，在我國主要分布于長江流域、南方各省以及黃河以北少部分地區(qū)。斜紋夜蛾能取食109 科389 種植物，包括葫蘆科、薔薇科、豆科、十字花科蔬菜以及柑橘(Citrus reticulata)等果樹[1]。其初孵幼蟲常聚集于葉背啃食，3 齡后分散取食植物葉片、嫩莖，也可取食花蕾、花，嚴重時可將整株植物全食。5～6 齡幼蟲進入暴食期，其食量約占整個幼蟲期的90%以上[2]。斜紋夜蛾不但直接危害作物，其排泄物還可引起植株腐爛[3]。斜紋夜蛾重發(fā)區(qū)域的作物減產(chǎn)達80%以上，甚至絕收[4]。

目前，以氯蟲苯甲酰胺、蟲螨腈、茚蟲威、甲維鹽·茚蟲威、甲維鹽·蟲螨腈等藥劑為核心防治手段的化學防治是控制斜紋夜蛾的主要策略，但殺蟲劑的長期大量使用會帶來“3R”(病蟲抗性、農(nóng)藥殘留、病蟲再猖獗)問題[5—8]。昆蟲病原真菌是一種被廣泛使用的生物農(nóng)藥，專一性強，殺蟲效果好，是害蟲綠色防控技術(shù)的重要組成部分。綠僵菌(Metarhizium anisopliae) 用于防治澳洲疫蝗(Chortoicetes terminifera)[9]、云杉八齒小蠹(Ipstypographus)[10]和黑豆蚜蟲(Aphis craccivora)[11]，致死率均在70%以上。綠僵菌同時被證實對夜蛾科害蟲具有良好的防治效果[12]。萊氏綠僵菌(Metarhizium rileyi)對草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda) 的自然感染率達29.83%，在室內(nèi)條件下，用分離獲得的1×108個·mL-1孢子懸浮液侵染草地貪夜蛾3 齡幼蟲，7 d 后幼蟲死亡率可達100%[13]。

昆蟲病原真菌資源豐富，具有寄主范圍廣、代謝類型復雜、生態(tài)友好、不易產(chǎn)生抗性、可擴散傳播等諸多優(yōu)點，但其田間應用效果易受環(huán)境影響，難以在防控蟲害方面繼續(xù)發(fā)揮優(yōu)勢[14—17]。紫外線對微生物的殺傷主要通過使DNA 分子產(chǎn)生嘧啶二聚體，進而使遺傳物質(zhì)失活，導致微生物失去繁殖能力或死亡[18]。研究表明，紫外光直接照射會導致附著昆蟲體壁的昆蟲病原真菌孢子萌發(fā)率降低，殺蟲能力大為減弱[19—20]。

昆蟲受到真菌侵染時，體內(nèi)免疫系統(tǒng)被觸發(fā)。昆蟲主要依靠細胞免疫和體液免疫等先天免疫系統(tǒng)來抵御真菌感染[21]。細胞免疫中，昆蟲血液循環(huán)系統(tǒng)中自由移動的血細胞構(gòu)成昆蟲免疫的第一道防線[22—23]。血細胞通常會吞噬入侵血漿的微生物，并將其包裹控制[24]。美洲大蠊細胞接種綠僵菌后，血細胞通過吞噬作用形成結(jié)節(jié)使綠僵菌孢子鈍化、不能萌發(fā)，或者徹底分解孢子[25]。體液免疫的機制多樣化，如黑化反應、血淋巴凝固或抗菌肽的產(chǎn)生[23,26]。體液免疫往往依賴于特定的信號通路，比如果蠅受到真菌感染后被誘導合成抗真菌肽(Drosomycin)和碧蝽金屬肽(Metchnikowin)等[27]。除了真菌侵染會引起昆蟲的免疫反應，其他物理脅迫也會誘導昆蟲的免疫反應[28—29]。例如，紫外線-B(UV-B)脅迫誘導激活桃蚜(Myzus persicae)的抗原加工、呈遞、趨化因子信號等[30]。那么，UV-B 能否通過提前激活免疫反應間接抑制昆蟲病原真菌殺蟲效果呢？

本研究通過篩選出對斜紋夜蛾幼蟲具有較高致病力的綠僵菌株系，測定UV-B 照射對斜紋夜蛾幼蟲抵抗綠僵菌致病力的影響，隨后利用異硫氰酸熒光素(FITC)對綠僵菌進行熒光標記，分析紫外線脅迫下斜紋夜蛾血細胞數(shù)量、血細胞吞噬作用、血漿抗真菌活性變化，明確紫外輻射對昆蟲抵御病原真菌侵染的間接效應，為綠僵菌田間應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 昆蟲飼養(yǎng)

斜紋夜蛾從華南農(nóng)業(yè)大學試驗田的棉花上采集。按照David 等[31]方法連續(xù)多代飼養(yǎng)于華南農(nóng)業(yè)大學教育部生物防治工程研究中心。飼養(yǎng)溫度(25±2)℃，相對濕度(80±5)%，光周期(L/D) 16 h/8 h。

1.2 蟲生真菌培養(yǎng)和孢子懸液配制

金龜子綠僵菌(Metarhizium anisopliae)分離株SCHX46、SM036 和ZB16 來自華南農(nóng)業(yè)大學教育部生物防治工程研究中心蟲生真菌種質(zhì)資源庫。將綠僵菌接種于PDA 平板上，在(26±2) ℃下培養(yǎng)10 d[32]。待菌株充分產(chǎn)孢后，用0.01% Tween-80 去離子水溶液洗脫平板上的真菌分生孢子，用濾紙(Whatman No. 2)篩選后裝入無菌小瓶。用顯微鏡計數(shù)，配制1×109分生孢子·mL-1綠僵菌孢子懸浮液，以此為原液，用含0.01% Tween-80 去離子水連續(xù)稀釋，制備較低濃度(1×105、1×106、1×107和1×108分生孢子·mL-1)分生孢子懸浮液[17]。

1.3 斜紋夜蛾幼蟲的綠僵菌處理

用飼喂法比較不同株系、不同濃度綠僵菌分生孢子懸浮液處理對斜紋夜蛾4 齡幼蟲死亡率的影響。在未凝固人工飼料中添加5 種濃度(1×105、1×106、1×107、1×108和1×109分生孢子·mL-1)的各個綠僵菌分離株。以不添加真菌孢子為對照。將制備好的飼料冷卻，置于4 ℃?zhèn)溆?。將剛蛻皮的斜紋夜蛾4 齡幼蟲饑餓3 h 后移入直徑4 cm 小塑料杯，分別投喂飼料1 g。每處理設置5 個生物學重復，每重復30 頭幼蟲，每天更換新鮮飼料。統(tǒng)計處理7 d后幼蟲死亡率，選擇致死率最好的綠僵菌分離株。利用所選的綠僵菌菌株孢子懸液注射法檢測斜紋夜蛾4 齡幼蟲死亡率。按照1.2 制備綠僵菌菌株分生孢子懸液(1×103、1×104和1×105分生孢子·mL-1)。將4 齡斜紋夜蛾幼蟲靜置于冰上5 min 使其休眠，然后用75%乙醇擦拭蟲體滅菌。對幼蟲腹部進行注射孢子懸液以感染斜紋夜蛾。對照組注射等量的DPBS 溶液。

1.4 UV-B 處理斜紋夜蛾幼蟲

將4 齡斜紋夜蛾幼蟲置于UV-B 熒光燈(光源波長的峰值在303 nm，TL 20W/12 RS，東莞智臣電子有限公司，中國)下照射0.5 h，以未照射UV-B 的斜紋夜蛾幼蟲作為對照。每天記錄幼蟲死亡率。每處理設置3 個生物學重復，每重復20 頭幼蟲。

1.5 斜紋夜蛾幼蟲血淋巴吞噬能力測定

采用異硫氰酸熒光素(FITC)對綠僵菌進行標記[34]。將4 齡幼蟲分為2 組，每組20 頭幼蟲。紫外線處理幼蟲0.5 h，對照組幼蟲置于實驗室條件下。幼蟲孵育后先用75%乙醇擦拭蟲體滅菌，再用顯微注射器從幼蟲腹部氣門處注射FITC 標記的孢子懸液(1×107分生孢子·mL-1) 20 μL。注射后對幼蟲進行取血，并立即向血淋巴中加入抗凝劑。在暗視野顯微鏡下觀察不同時間點血淋巴中血細胞的吞噬情況，確定吞噬一個或多個分生孢子的血細胞百分比，測定其吞噬率。每樣本觀察200 個以上血細胞，每處理3 次重復。

1.6 斜紋夜蛾幼蟲血漿抗真菌活性測定

用含有100 μg·μL-1氨芐西林的馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(PDB)稀釋綠僵菌分生孢子懸浮液至4×104分生孢子·mL-1。分別在紫外脅迫處理0 h、4 h、8 h及24 h 時將紫外線照射0.5 h 的斜紋夜蛾4 齡幼蟲置于冰上5 min，然后解剖并收集血淋巴，以相同時間點未作UV-B 處理的斜紋夜蛾4 齡幼蟲為對照。將收集的血淋巴加入DPBS，1/5 稀釋，然后測定每毫升血淋巴細胞數(shù)。剩余樣品離心提取血漿，將血漿置于-80 ℃冰箱保存。

取稀釋的綠僵菌孢子懸浮液100 μL分別與不同處理幼蟲的100 μL 血漿混合，置于96 孔組織培養(yǎng)板培養(yǎng)24 h 后，混合培養(yǎng)板內(nèi)溶液，從每個孔中取出50 μL 溶液，用PDB 稀釋至100 μL。將溶液涂抹在馬鈴薯葡萄糖固體培養(yǎng)基(PDA)平板上，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，10 d 后測定孢子數(shù)。每處理3 次重復。

1.7 數(shù)據(jù)分析

用SPSS 19.0 進行單因素方差分析(one way ANOVA)和多重比較，通過Tukey’s HSD 檢驗差異顯著性(P＜0.05)。采用GrapgPad Prism 8 軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼喂法篩選綠僵菌毒力菌株

為保證對照組和實驗組用金龜子綠僵菌處理的斜紋夜蛾幼蟲死亡率有顯著差異，先篩選出毒力最強的菌株。用含有不同濃度分生孢子的人工飼料飼喂斜紋夜蛾4 齡幼蟲，幼蟲死亡率隨飼料中孢子濃度升高而升高。比較相同濃度(1×109分生孢子·mL-1)菌株處理斜紋夜蛾5 d 后的死亡率，ZB16、SM036和SCHX46 處理后的死亡率分別為82.22%、73.00%和71.00% (圖1)。三種綠僵菌菌株中，ZB16 毒力最強，其次為SM036 和SCHX46。此外，ZB16 菌株的致死速度也較快。因此，后續(xù)采用金龜子綠僵菌菌株ZB16 實驗。

圖1 三種綠僵菌菌株不同濃度孢子懸浮液對斜紋夜蛾幼蟲的致死率比較Fig. 1 Concentration-mortality response of Spodoptera litura to topical application of three different isolates of Metarhizium anisopliae

2.2 不同濃度綠僵菌ZB16 孢子懸浮液對斜紋夜蛾幼蟲死亡率的影響

斜紋夜蛾4 齡幼蟲的死亡率與綠僵菌分生孢子濃度成正比(圖2)。注射1×105分生孢子·mL-1懸浮液7 d 后，幼蟲死亡率最高(72.22%)，而注射1×103分生孢子·mL-1懸浮液的幼蟲死亡率最低(30.00%)。注射1×104分生孢子·mL-1懸浮液的幼蟲死亡率為50%，該劑量用于后續(xù)實驗。

圖2 綠僵菌ZB16 不同孢子濃度懸浮液處理的斜紋夜蛾幼蟲死亡率Fig. 2 Concentration-mortality response of Spodoptera litura to injection of Metarhizium anisopliae isolate ZB16

2.3 UV-B 脅迫對斜紋夜蛾幼蟲抗真菌能力的影響

UV-B 照射斜紋夜蛾幼蟲0.5 h，然后注射不同濃度綠僵菌分生孢子懸浮液。結(jié)果表明，未經(jīng)UV-B照射的斜紋夜蛾幼蟲注射綠僵菌懸浮液(1×104分生孢子·mL-1) 7 d 后存活率為49.67%，而UV-B 照射0.5 h 后再注射綠僵菌懸浮液的斜紋夜蛾幼蟲7 d 后存活率為65.56%(圖3)。多重比較表明，相同時間內(nèi)不同處理間幼蟲死亡率有顯著差異(圖3)。

圖3 UV-B 脅迫下注射綠僵菌孢子懸浮液的斜紋夜蛾死亡率(%)Fig. 3 Effect of UV-B stress on mortality (%) of Spodoptera litura injected with Metarhizium anisopliae

2.4 UV-B 脅迫對斜紋夜蛾幼蟲血淋巴中血細胞數(shù)量的影響

UV-B 照射0.5 h 再用綠僵菌處理的斜紋夜蛾4齡幼蟲與未照射UV-B 只用綠僵菌處理的幼蟲相比，其在不同時間測得血細胞數(shù)量均有顯著差異。UV-B處理0.5 h 后的4 h、8 h 以及24 h，用綠僵菌處理的斜紋夜蛾幼蟲血細胞數(shù)量與對照組(未照射UV-B)相比顯著增加(表1)。

表1 UV-B 脅迫對幼蟲血細胞數(shù)量的影響Table 1 Effect of UV-B exposure on the amount of hemocyte of Spodoptera litura larvae

2.5 UV-B 脅迫對斜紋夜蛾幼蟲血細胞吞噬功能的影響

UV-B 照射0.5 h 后用綠僵菌處理的斜紋夜蛾4齡幼蟲與未照射UV-B 的幼蟲相比，兩者在不同時間測得的血細胞吞噬率均有顯著差異。UV-B 照射組的斜紋夜蛾幼蟲血細胞吞噬率在處理4 h 后最高，達30.2%，隨后逐漸降低(表2)。

表2 UV-B 照射對斜紋夜蛾幼蟲血淋巴中血細胞吞噬活性的影響Table 2 Effect of UV-B exposure on phagocytic activity of Spodoptera litura haemocyte in haemolymph

2.6 UV-B 脅迫對斜紋夜蛾幼蟲血漿抗真菌活性的影響

金龜子綠僵菌孢子懸浮液分別與不同時間實驗室條件下飼養(yǎng)幼蟲的血漿以及UV-B 照射0.5 h 處理后幼蟲的血漿混合培養(yǎng)。培養(yǎng)10 d 后，UV-B 處理后4 h 與8 h 的幼蟲與實驗室條件下飼養(yǎng)的相同時間點的幼蟲相比，其血漿與真菌孢子懸浮液混合物中真菌孢子數(shù)顯著降低。說明紫外脅迫能夠增加斜紋夜蛾幼蟲血漿的抗真菌活性(表3)。

表3 UV-B 照射對斜紋夜蛾血漿抗真菌活性的影響Table 3 Effect of UV-B exposure on anti-fungal activity in Spodoptera litura plasma

3 討論

綠僵菌是一種寄主范圍較廣的昆蟲病原真菌，被應用于多種害蟲防治[15]。然而，諸多因素可能抑制綠僵菌活性，其防治效果一定程度上取決于自身對這些環(huán)境因素的耐受性。太陽輻射中的紫外線成分(UV-A 和UV-B)對生物有機體，包括真菌有破壞作用[36]。UV-B 照射可抑制真菌分生孢子的活性[37—38]。此外，亞致死劑量的紫外線照射不僅降低綠僵菌的萌發(fā)率還能降低其毒力[39—40]。綠僵菌這種易受環(huán)境干擾的不穩(wěn)定性是對其應用于田間防治害蟲的一種嚴重阻礙[41—42]。然而，紫外線作為自然環(huán)境中廣泛存在的物理脅迫因子，不僅對綠僵菌產(chǎn)生直接影響，同時可能通過影響昆蟲免疫，如上調(diào)昆蟲中熱激蛋白基因的表達來影響綠僵菌防治效果[43]。因此明確UV-B 對綠僵菌侵染昆蟲的影響，有助于提高蟲生真菌類生物農(nóng)藥在害蟲防治中的應用效果。

本研究發(fā)現(xiàn)UV-B 脅迫能使被綠僵菌侵染的斜紋夜蛾死亡率降低。實驗中為了排除幼蟲死亡是由UV-B 對真菌孢子的直接影響造成的，皆對斜紋夜蛾幼蟲先進行UV-B 脅迫，后用綠僵菌處理。有類似的研究表明，物理脅迫能減少蟲生真菌對昆蟲的侵染。自然感染球孢白僵菌(Beauveria bassiana)的大蠟螟(Galleria mellonella)幼蟲，分別在43 ℃和28 ℃飼養(yǎng)15 min。43 ℃下飼養(yǎng)的幼蟲存活時間顯著更長，且大蠟螟幼蟲先受到熱脅迫后再注射球孢白僵菌，也有類似表現(xiàn)，說明大蠟螟幼蟲存活率增加并非熱脅迫對真菌的不利影響造成的[44]。Mowlds 等[45]研究表明，大蠟螟幼蟲被白色念珠菌(Monilia albican)感染前在4 ℃或37 ℃下預孵育24 h，與在30 ℃下預孵育24 h 相比，對白色念珠菌的抗性增強。Richards 等[44]的研究表明，熱脅迫24～48 h 能在一定程度上減少甘藍夜蛾(Mamestra brassicae)幼蟲受綠僵菌和白僵菌的感染。溫和的物理刺激(搖晃)幼蟲也可以減少白色念珠菌和煙曲霉(Aspergillus fumigatus)對大蠟螟幼蟲的感染[46—47]。

物理脅迫可以誘導昆蟲的免疫反應，進而影響真菌的致病潛力[43—44,48]。甘藍夜蛾受熱脅迫(伴隨著真菌感染)后，其血細胞數(shù)量增多、血細胞吞噬功能增強，且幼蟲血淋巴中某些抗微生物肽的水平增加[44]。有研究表明，血細胞可以吞噬真菌分生孢子，并通過傷口愈合和血凝固保護昆蟲免受真菌感染[34,49]。本研究中，紫外脅迫能提高斜紋夜蛾幼蟲血細胞數(shù)量、血細胞吞噬功能和血淋巴抗真菌活性，并且受紫外脅迫后斜紋夜蛾幼蟲的真菌抗性顯著提高。說明在綠僵菌侵染昆蟲時，UV-B 脅迫下的斜紋夜蛾幼蟲免疫反應被激活，從而抵御真菌侵染。

4 結(jié)論

本文從對斜紋夜蛾幼蟲具有較高致病力的金龜子綠僵菌3 種株系中篩選出毒力最高的菌株ZB16，研究表明紫外脅迫降低了受綠僵菌侵染的斜紋夜蛾4 齡幼蟲的死亡率。進一步利用異硫氰酸熒光素(FITC)對綠僵菌進行熒光標記，證實紫外線脅迫下斜紋夜蛾血細胞數(shù)量、細胞吞噬活性以及血漿抗真菌活性均上升，說明紫外線脅迫下的昆蟲免疫反應發(fā)生變化，對綠僵菌的抗性增強。