基于PI3K∕AKT通路探究柚皮素改善多囊卵巢綜合征大鼠胰島素抵抗的作用機制

徐晶，申麗媛，屈清華

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是一種生殖功能障礙與糖代謝異常并存的內(nèi)分泌紊亂性疾病［1］。PCOS發(fā)病機制復雜，近年來研究發(fā)現(xiàn)，磷脂酰肌醇3 激酶（phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K）∕蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）通路的活化可促進下游糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）失活，進而促進糖原合成，并促進胰島素受體底物-1（insulin receptor substrate-1，IRS-1）磷酸化來改善胰島素抵抗，調(diào)節(jié)糖代謝，從而參與PCOS胰島素抵抗的發(fā)生及卵巢組織的胰島素信號傳導過程［2］。以上研究提示干預PI3K∕AKT通路活化可能是防治PCOS的重要措施之一。改善糖脂代謝、調(diào)節(jié)激素分泌可改善PCOS患者代謝及排卵障礙［3］。柚皮素具有抗氧化、改善糖脂代謝、促進雌激素合成等作用［4］。研究發(fā)現(xiàn)，柚皮素能改善PCOS大鼠糖代謝及激素水平紊亂等癥狀［5］，預示其可能成為防治PCOS 的潛在藥物。本研究建立大鼠PCOS 模型，探究柚皮素通過PI3K∕AKT 通路改善PCOS胰島素抵抗的可能機制，以期為柚皮素在PCOS領(lǐng)域的開發(fā)應用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 健康SD 大鼠80 只，21 日齡，SPF 級，雌性，體質(zhì)量200～210 g，購自長春市億斯實驗動物技術(shù)有限責任公司［SCXK（吉）2020-0002］。實驗經(jīng)本院倫理委員會批準［倫理號IACUC-01（20200327）］，符合3R 原則。柚皮素（R136822，上海恒斐生物科技有限公司）；脫氫表雄酮（UE809640，北京德航五洲科技有限公司）；PI3K 抑制劑-LY294002（EY-19853，上海一研生物科技有限公司）；HE 試劑盒（AR1180-100，武漢博士德生物工程有限公司）；大鼠空腹血糖（FBG）試劑盒（FS13987，上海撫生實業(yè)有限公司）；空腹胰島素（FINS）試劑盒（YX-E21159，武漢益普生物科技有限公司）；總膽固醇（TC）酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（EK-R38996，上海酶研生物科技有限公司）；三酰甘油（TG）ELISA試劑盒（YT30046，上海韻泰信息科技有限公司）；雌二醇（E2）試劑盒（13988，上海廣銳生物科技有限公司）；黃體生成素（LH）試劑盒（YS03670P，上海雅吉生物科技有限公司）；卵泡刺激素（FSH）試劑盒（FT-D24608，上海梵態(tài)生物科技有限公司）；睪酮（T）試劑盒（SND-R595，滁州仕諾達生物科技有限公司）。一抗PI3K（ab154598）、磷酸化（p）-PI3K（ab182651），AKT（ab8805）、p-AKT（ab38449）、IRS-1（ab131509）、p-IRS-1（ab4776）、GSK-3β（ab185141）、p-GSK-3β（ab68176）、葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白因子4（GLUT4，ab33780）、人第10號染色體上磷酸酶和張力蛋白同源缺失基因（phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10，PTEN，ab297787）、內(nèi)參β-actin 等兔抗大鼠抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標記的IgG山羊抗兔抗體均購自美國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 PCOS 模型建立及分組 取SD 大鼠65 只，參照文獻［6］方法，每日于頸背部皮下注射質(zhì)量濃度為30 mg∕kg 的脫氫表雄酮油劑2 mL∕kg，連續(xù)4 周，建立PCOS 模型后正常飼養(yǎng)。于第10周取陰道涂片，觀察動情周期，并取腹主動脈血，用放射免疫法檢測血清T及ELISA法檢測FINS水平，以陰道涂片出現(xiàn)角化細胞、動情周期不完整、血清T 及FINS 水平異常升高視為造模成功。60只大鼠造模成功，另5只造模后表型不明顯，予以剔除。將造模成功的大鼠采用隨機數(shù)字表法分為模型組、柚皮素組（100 mg∕kg）、PI3K抑制劑組、柚皮素+PI3K抑制劑組，每組15只；相同時間段取SD大鼠15只，于頸背部皮下注射油劑2 mL∕kg，作為正常對照組。

柚皮素組參照文獻［7］給予柚皮素100 mg∕kg（以生理鹽水溶解成10 g∕L的混懸液，10 mL∕kg灌胃，1次∕d，連續(xù)7 d）灌胃；PI3K 抑制劑參照文獻［8］經(jīng)尾靜脈注射給予LY294002（10 mmoL∕L，10μL∕只，2次∕周）；柚皮素+PI3K抑制劑組灌胃給予柚皮素的同時，尾靜脈注射LY294002。各組大鼠在連續(xù)給藥7 d后進行后續(xù)實驗。

1.2.2 大鼠血糖、血脂、生殖激素相關(guān)指標檢測 大鼠于末次給藥后禁食禁水12 h，然后取其腹主動脈血3 mL，用ELISA 法檢測FBG、FINS、TC 和TG 水平。根據(jù)公式計算：胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）=FBG×FINS∕22.5；放射免疫法檢測生殖激素FSH、E2、LH、T水平。

1.2.3 HE 染色觀察卵巢形態(tài) 麻醉后處死大鼠，取左右卵巢組織，左側(cè)卵巢組織于4%多聚甲醛中固定24 h，制成厚為4μm 的石蠟切片，取同一位置石蠟切片，進行HE 染色處理后，光鏡下觀察組織形態(tài)變化。右側(cè)卵巢組織，去除表面脂肪組織后，置于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 免疫組化法檢測卵巢組織p-PI3K陽性表達 同一位置石蠟切片，脫蠟、透化處理后，4 ℃滴加1∶200的p-PI3K一抗孵育過夜，HRP 標記的IgG 二抗室溫封閉、顯色。復染后，在光學顯微鏡下觀察拍照。ImagePro plus 6.0圖像處理系統(tǒng)檢測單位面積內(nèi)陽性染色的平均光密度值。

1.2.5 Western blot法檢測卵巢組織PI3K∕AKT通路相關(guān)蛋白表達 取液氮中保存的右側(cè)卵巢組織，解凍后剪碎，加入組織裂解液，冰上研磨得勻漿液。提取蛋白并用BCA法檢測蛋白總濃度后，取50μg蛋白，電泳及轉(zhuǎn)膜反應操作后，4 ℃滴入1∶800 的PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、IRS-1、p-IRS-1、GSK-3β、p-GSK-3β、GLUT-4、PTEN 的一抗抗體，內(nèi)參β-actin（1∶1 000）孵育過夜，HRP 標記的IgG 羊抗兔二抗（1∶1 500）室溫孵育2 h后，化學發(fā)光法顯色及曝光，Alpha Ease FC軟件分析蛋白條帶相對灰度值。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 21.0 軟件分析數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差（±s）表示，2組間均數(shù)比較行t檢驗，多組間比較行單因素方差分析，組間多重比較行SNKq檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 柚皮素對大鼠血脂、血糖及胰島素抵抗的影響 與正常對照組相比，模型組大鼠血清TC、TG、FPG、FINS、HOMA-IR 均升高（P＜0.05）；與模型組相比，柚皮素組大鼠上述指標均降低（P＜0.05）；PI3K 抑制劑組大鼠上述指標均進一步升高（P＜0.05）。柚皮素+PI3K抑制劑組上述指標均較柚皮素組升高（P＜0.05），見表1。

2.2 柚皮素對大鼠生殖激素水平的影響 與正常對照組相比，模型組大鼠血清LH、T水平升高，F(xiàn)SH、E2 水平降低（P＜0.05）；與模型組相比，柚皮素組大鼠血清LH、T 水平降低，F(xiàn)SH、E2 水平升高（P＜0.05）；PI3K 抑制劑組血清LH、T 水平進一步升高，F(xiàn)SH、E2 水平進一步降低（P＜0.05）。柚皮素+PI3K抑制劑組血清LH、T 水平較柚皮素組升高，F(xiàn)SH、E2水平較柚皮素組降低（P＜0.05），見表2。

2.3 柚皮素對大鼠卵巢組織病理形態(tài)的影響 HE染色可見，正常對照組大鼠卵巢組織有8~12層顆粒細胞，卵母細胞形態(tài)正常，黃體有2~3個。模型組卵巢組織可見卵泡囊性擴張、內(nèi)無卵母細胞、黃體數(shù)量及顆粒細胞層減少、閉鎖卵泡增多等病理損傷。柚皮素組囊狀卵泡數(shù)量減少，卵泡顆粒細胞層增厚，黃體增多，有卵丘的成熟卵泡增多。PI3K抑制劑組大鼠囊狀擴張的卵泡增多，卵巢顆粒細胞層數(shù)減少且排列疏松，黃體及成熟卵泡減少甚至消失。柚皮素+PI3K抑制劑組上述病理損傷較柚皮素組嚴重。見圖1。

Tab.1 Comparison of the serum TC,TG,FPG,FINS and HOMA-IR levels between the five groups表1 各組大鼠血清TC、TG、FPG、FINS及HOMA-IR水平比較 （n=15，±s）

Tab.1 Comparison of the serum TC,TG,FPG,FINS and HOMA-IR levels between the five groups表1 各組大鼠血清TC、TG、FPG、FINS及HOMA-IR水平比較 （n=15，±s）

＊＊P＜0.01；a與正常對照組比較，b與模型組比較，c與柚皮素組比較，d與PI3K抑制劑組比較，P＜0.05。

組別正常對照組模型組柚皮素組PI3K抑制劑組柚皮素+PI3K抑制劑組F TC（mmol∕L）3.30±0.12 6.08±0.20a 3.98±0.15ab 7.69±0.36abc 6.09±0.21acd 943.118＊＊TG（mmol∕L）1.66±0.14 3.90±0.32a 1.96±0.10ab 4.78±0.40abc 3.94±0.30acd 364.775＊＊FPG（mmol∕L）5.52±0.30 7.34±0.50a 6.01±0.45b 8.28±0.71abc 7.53±0.70acd 63.268＊＊組別正常對照組模型組柚皮素組PI3K抑制劑組柚皮素+PI3K抑制劑組F FINS（mIU∕L）65.25±7.71 122.33±6.20a 82.82±8.66ab 190.32±9.84abc 125.01±7.29acd 540.962＊＊HOMA-IR 16.08±1.18 39.91±3.04a 22.12±2.33ab 70.08±7.06abc 41.46±4.08acd 403.692＊＊

Tab.2 Comparison of serum LH,T,FSH and E2 levels between the five groups of rats表2 各組大鼠血清LH、T、FSH、E2水平比較（n=15，±s）

Tab.2 Comparison of serum LH,T,FSH and E2 levels between the five groups of rats表2 各組大鼠血清LH、T、FSH、E2水平比較（n=15，±s）

＊＊P＜0.01；a與正常對照組比較，b與模型組比較，c與柚皮素組比較，d與PI3K抑制劑組比較，P＜0.05。

組別正常對照組模型組柚皮素組PI3K抑制劑組柚皮素+PI3K抑制劑組F LH（U∕L）3.18±0.32 8.45±0.70a 4.76±0.51ab 9.90±0.90abc 8.42±0.73acd 274.341＊＊T（μg∕L）1.10±0.10 1.73±0.19a 1.29±0.11ab 2.18±0.19abc 1.70±0.18acd 104.982＊＊FSH（U∕L）1.48±0.11 0.80±0.08a 1.09±0.10ab 0.48±0.05abc 0.79±0.08acd 284.298＊＊E2（ng∕L）89.85±8.46 65.96±6.58a 80.77±8.02ab 46.89±4.67abc 66.89±6.57acd 82.173＊＊

2.4 柚皮素對大鼠卵巢組織p-PI3K 陽性表達的影響 免疫組化染色顯示，p-PI3K在正常對照組大鼠成熟卵泡及顆粒細胞層中呈強陽性表達。模型組大鼠卵巢組織中p-PI3K呈弱陽性表達，p-PI3K陽性表達（0.49±0.03）弱于正常對照組（1.06±0.03）；與模型組相比，柚皮素組大鼠p-PI3K陽性表達（0.89±0.08）升高；PI3K 抑制劑組大鼠p-PI3K 陽性表達（0.19±0.01）進一步降低；柚皮素+PI3K抑制劑組p-PI3K陽性表達（0.46±0.04）低于柚皮素組（n=15，F(xiàn)=935.379，P＜0.01），見圖2。

2.5 柚皮素對大鼠PI3K∕AKT 通路及其上游調(diào)節(jié)因子IRS-1 蛋白表達的影響 與正常對照組相比，模型組大鼠p-PI3K∕PI3K、p-AKT∕AKT、p-IRS-1∕IRS-1 蛋白表達降低（P＜0.05）。與模型組相比，柚皮素組大鼠3 種蛋白表達升高；PI3K 抑制劑組大鼠3 種蛋白表達進一步降低（P＜0.05）。柚皮素+PI3K 抑制劑組大鼠3 種蛋白表達低于柚皮素組（P＜0.05），見圖3、表3。

Fig.1 HE staining image of ovarian tissue in the five groups(×200)圖1 各組大鼠卵巢組織HE染色結(jié)果（×200）

Fig.2 p-PI3K immunohistochemical staining of ovarian tissue in rats(×200)圖2 大鼠卵巢組織p-PI3K免疫組化染色圖（×200）

Fig.3 Western blot assay of p-PI3K,PI3K,p-AKT,AKT,p-IRS-1 and IRS-1 protein expression in rat ovarian tissue圖3 大鼠卵巢組織p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、p-IRS-1、IRS-1蛋白表達免疫印跡圖

2.6 柚皮素對大鼠PI3K∕AKT 通路下游調(diào)節(jié)因子相關(guān)蛋白表達的影響 與正常對照組相比，模型組大鼠p-GSK-3β∕GSK-3β、GLUT-4 蛋 白 表 達 降 低，PTEN 蛋白表達升高（P＜0.05）。與模型組相比，柚皮素組大鼠p-GSK-3β∕GSK-3β、GLUT-4 蛋白表達升高，PTEN蛋白表達降低（P＜0.05）；PI3K抑制劑組大鼠p-GSK-3β∕GSK-3β、GLUT-4 蛋白表達進一步降低，PTEN 蛋白表達進一步升高（P＜0.05）。柚皮素+PI3K 抑制劑組大鼠p-GSK-3β∕GSK-3β、GLUT-4蛋白表達低于柚皮素組，PTEN 蛋白表達高于柚皮素組（P＜0.05），見圖4、表4。

Tab.3 Comparison of protein expression of PI3K/AKT pathway and its upstream regulator IRS-1 in rat ovarian tissue between the five groups表3 各組大鼠卵巢組織PI3K/AKT通路及其上游調(diào)節(jié)因子IRS-1蛋白表達水平比較 （n=15，±s）

Tab.3 Comparison of protein expression of PI3K/AKT pathway and its upstream regulator IRS-1 in rat ovarian tissue between the five groups表3 各組大鼠卵巢組織PI3K/AKT通路及其上游調(diào)節(jié)因子IRS-1蛋白表達水平比較 （n=15，±s）

＊＊P＜0.01；a與正常對照組比較，b與模型組比較，c與柚皮素組比較，d與PI3K抑制劑組比較，P＜0.05。

組別正常對照組模型組柚皮素組PI3K抑制劑組柚皮素+PI3K抑制劑組F p-PI3K∕PI3K 1.02±0.08 0.46±0.04a 0.79±0.09ab 0.19±0.01abc 0.45±0.05acd 422.206＊＊p-AKT∕AKT 1.16±0.09 0.58±0.05a 0.98±0.08ab 0.21±0.02abc 0.55±0.05acd 534.158＊＊p-IRS-1∕IRS-1 1.09±0.07 0.36±0.03a 0.82±0.08ab 0.11±0.01abc 0.39±0.03acd 880.284＊＊

Fig.4 Western blot results of p-GSK-3β,GSK-3β,GLUT-4 and PTEN protein expression in rat ovarian tissue圖4 大鼠卵巢組織p-GSK-3β、GSK-3β、GLUT-4、PTEN蛋白表達免疫印跡圖

Tab.4 Comparison of related proteins of downstream regulators of PI3K/AKT pathway in rat ovary tissues between the five groups表4 各組大鼠卵巢組織PI3K/AKT通路下游調(diào)節(jié)因子相關(guān)蛋白表達水平比較 （n=15，±s）

Tab.4 Comparison of related proteins of downstream regulators of PI3K/AKT pathway in rat ovary tissues between the five groups表4 各組大鼠卵巢組織PI3K/AKT通路下游調(diào)節(jié)因子相關(guān)蛋白表達水平比較 （n=15，±s）

＊＊P＜0.01；a與正常對照組比較，b與模型組比較，c與柚皮素組比較，d與PI3K抑制劑組比較，P＜0.05。

組別正常對照組模型組柚皮素組PI3K抑制劑組柚皮素+PI3K抑制劑組F p-GSK-3β∕GSK-3β 1.07±0.07 0.44±0.04a 0.71±0.07ab 0.11±0.01abc 0.42±0.04acd 742.271＊＊GLUT-4 1.06±0.08 0.50±0.05a 0.90±0.09b 0.17±0.01abc 0.53±0.05acd 474.758＊＊PTEN 1.04±0.09 1.88±0.18a 1.23±0.12b 2.28±0.21abc 1.80±0.18acd 145.651＊＊

3 討論

3.1 PCOS的胰島素抵抗及高雄激素血癥的病理特征 PCOS 多發(fā)于育齡期女性，我國PCOS 發(fā)病率達5.6%［9］。PCOS較為典型的臨床表現(xiàn)為多毛、月經(jīng)異常、高雄激素血癥、胰島素抵抗及多囊卵巢性改變等［10］。研究發(fā)現(xiàn)，卵巢內(nèi)含有介導胰島素生成和代謝的相關(guān)酶，高胰島素及胰島素抵抗會干擾肝臟合成性激素結(jié)合球蛋白，而導致PCOS患者雄激素合成增多［11］。而高雄激素環(huán)境可抑制卵泡的發(fā)育及成熟，導致卵泡閉鎖，生殖激素E2 水平降低、LH 分泌過多、FSH分泌過少［12］，且低水平的FSH及高水平的雄激素均可促進顆粒細胞迅速黃素化、小竇卵泡發(fā)育停止［13］，從而引起PCOS 患者卵泡成熟及排卵功能異常，并導致卵巢呈多囊樣改變，故越來越多的研究認為胰島素抵抗及高雄激素血癥是PCOS 的病理基礎。脫氫表雄酮可提高女性T 水平，進而營造高雄激素環(huán)境，且脫氫表雄酮法復制動物PCOS是國際較為公認的理想造模方法［14］。本研究用上述方法建立大鼠PCOS模型后發(fā)現(xiàn)，大鼠血糖、胰島素、胰島素抵抗指數(shù)、血脂（TC、TG）水平升高，E2、FSH 降低，LH 及T 水平升高，光鏡下可見卵泡呈囊性擴張、閉鎖卵泡增多，黃體及顆粒層細胞減少等多囊卵巢性改變現(xiàn)象，提示造模成功。

3.2 柚皮素可改善PCOS的胰島素抵抗并糾正生殖激素紊亂 西藥常用炔雌醇環(huán)丙孕酮片來降低PCOS 患者雄激素水平、修復月經(jīng)異常，但該藥并不能改善PCOS 患者糖代謝異常，無法從根本上治療PCOS［15］。研究證實，改善PCOS 患者胰島素抵抗和糖脂代謝紊亂可糾正生殖激素紊亂，改善卵巢形態(tài)，達到助孕目的［16］。柚皮素具有降糖及降血脂等作用，也是合成雌激素的天然替代物之一。已有研究發(fā)現(xiàn)柚皮素可改善內(nèi)分泌激素，如E2、FSH、LH的分泌紊亂，緩解卵泡囊腫及顆粒細胞層減少等病理損傷［17］，預示柚皮素可能作為防治PCOS 的潛在藥物。本研究發(fā)現(xiàn)，PCOS大鼠經(jīng)一定劑量的柚皮素干預治療后，血糖、血脂及胰島素抵抗等降低，E2、FSH水平升高，LH及T水平降低，卵巢囊性改變緩解，證實柚皮素在防治PCOS 方面有潛在應用價值。本研究繼續(xù)對其防治PCOS的機制進行探究。

3.3 柚皮素防治PCOS 的機制與促進PI3K∕AKT 活化有關(guān) IRS-1磷酸化活化在導致二聚體構(gòu)象改變的同時，會激活PI3K，并引起AKT磷酸化活化，導致GSK-3β磷酸化升高來抑制GSK-3β自身活性（抑制糖原合成活性）而調(diào)節(jié)糖脂代謝及胰島素信號傳導，且PI3K∕AKT 通路活性及GSK-3β 磷酸化升高可反過來促進IRS-1 絲氨酸磷酸化活化，增強胰島素信號傳導，改善PCOS胰島素抵抗［18］。另外，PI3K∕AKT通路活化也可激活能促進葡萄糖轉(zhuǎn)運的GLUT-4表達，來改善PCOS 脂質(zhì)及糖原代謝紊亂［19］，并能通過負性調(diào)控PTEN 活性來促進顆粒細胞增殖，改善PCOS卵巢排卵功能［20］。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠卵巢組織中PI3K∕AKT 處于磷酸化失活狀態(tài)，其下游GLUT-4、p-GSK-3β 蛋白表達降低，具有抑制卵巢顆粒細胞增殖作用的PTEN 表達升高，用PI3K 抑制劑LY294002 進一步阻斷PI3K∕AKT 活性后，大鼠血糖、血脂、胰島素抵抗進一步升高，生殖激素分泌紊亂最嚴重，卵巢多囊改變更加明顯，證實PI3K∕AKT通路失活可能是參與PCOS血糖及血脂代謝紊亂、胰島素抵抗升高、性激素分泌紊亂、卵巢多囊改變的關(guān)鍵機制之一。柚皮素組大鼠卵巢中PI3K∕AKT 通路蛋白磷酸化活化，GLUT-4、p-GSK-3β 表達升高，PTEN 降低最明顯，提示柚皮素可能通過促進PI3K∕AKT通路活化來發(fā)揮防治PCOS的作用。PI3K抑制劑LY294002可削弱柚皮素促進PI3K∕AKT活化及防治PCOS的作用。

綜上所述，柚皮素可通過促進PI3K∕AKT通路活化來抑制血糖、血脂升高，減輕胰島素抵抗，改善PCOS 大鼠性激素紊亂及卵巢多囊性改變。但由于目前缺少柚皮素的臨床研究，其具體作用機制及防治PCOS的其他機制還有待進一步探討。