任雪珠，張樹森，蔡志剛△，李海濤，許曉嵐，齊天杰，李宏林

肺癌嚴(yán)重威脅人類的健康，其發(fā)病率及病死率均居惡性腫瘤的首位［1］。由于大氣污染、人口老齡化等原因，我國肺癌發(fā)病率、病死率呈逐年上升趨勢［2］，迫切需要尋找更快速、準(zhǔn)確的檢測方法以提高診斷準(zhǔn)確率［3-4］。基因甲基化是常見的表觀遺傳機(jī)制，參與調(diào)控肺癌的發(fā)生、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移［5-6］。RAS 相關(guān)區(qū)域家族1A（ras association domain family 1A，RASSF1A）是重要的抑癌基因，通過與細(xì)胞結(jié)合來介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其啟動(dòng)子CpG島高甲基化是RASSF1A基因失活的重要機(jī)制之一［7-8］。多項(xiàng)研究提示，RASSF1A 甲基化是包括肺癌在內(nèi)的多種腫瘤診斷及預(yù)后的標(biāo)志物［9-10］。矮小同源盒基因2（short stature homeobox 2，SHOX2）在骨骼、心臟和神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育以及胚胎的形態(tài)發(fā)生中發(fā)揮重要作用［11］。當(dāng)病理細(xì)胞學(xué)不能確診時(shí)，SHOX2甲基化檢測可作為肺癌診斷的有效補(bǔ)充［12-13］?？焖佻F(xiàn)場細(xì)胞學(xué)評價(jià)（cytological rapid on-site evalutation，C-ROSE）是指通過經(jīng)氣管鏡肺活檢（transbronchial lung biopsy，TBLB）、經(jīng)支氣管鏡針吸活檢術(shù)（transbronchial needle aspiration，TBNA）、經(jīng)皮穿刺肺活檢等介入方式指導(dǎo)取材技術(shù)［14］，進(jìn)行快速標(biāo)本質(zhì)控并提高肺癌的診斷率［15］。本研究將RASSF1A 和SHOX2 甲基化檢測同C-ROSE 聯(lián)合分析，評估其在肺癌輔助診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選擇2018 年12 月—2019 年11 月在河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院診治并行甲基化檢測的疑似肺癌患者179例，術(shù)后有明確組織和（或）細(xì)胞病理結(jié)果。其中，病理明確診斷為肺癌58例，包括腺癌27例，鱗癌13例，小細(xì)胞癌5例，類癌2例，腺樣囊性癌1例，肉瘤樣癌1例，未定型9例。甲基化檢測標(biāo)本分別為肺穿刺活檢9例，胸水11例，痰液1例，肺泡灌洗液158例。179例中共有114例（肺癌45例，肺良性病變69例）完成了C-ROSE檢查。所有標(biāo)本的使用均通過本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號：2019-R287），患者本人均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑 RASSF1A及SHOX2甲基化檢測試劑盒購自上海透景生物科技有限公司。DNA 提取試劑盒購自天根生化公司；亞硫酸鹽修飾試劑盒購自ZYMO RESEARCH生物公司。ABI7500 全自動(dòng)熒光PCR 儀購自美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司。迪夫快速細(xì)胞染色試劑盒購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司，正置生物顯微鏡CX31購自日本奧林巴斯公司。

1.3 研究方法

1.3.1 不同標(biāo)本RASSF1A 及SHOX2 基因甲基化檢測 （1）肺泡灌洗液。由有經(jīng)驗(yàn)的支氣管鏡操作醫(yī)師完成，操作符合成人診斷性可彎曲支氣管鏡檢查術(shù)應(yīng)用指南（2019 年版）規(guī)范。于病變肺段注入37 ℃生理鹽水20 mL，盡快充分回收灌洗液，重復(fù)2~5次，以回收率＞40%為合格標(biāo)本。（2）經(jīng)皮肺穿刺活檢標(biāo)本。CT引導(dǎo)下經(jīng)穿刺槍獲取組織標(biāo)本，待C-ROSE檢查樣本合格后，留取組織標(biāo)本置于10 mL無菌生理鹽水待檢。（3）胸水標(biāo)本。于第1次胸腔穿刺時(shí)留取。（4）痰液標(biāo)本。于住院次日清晨留取。標(biāo)本采集后嚴(yán)格按說明書步驟執(zhí)行DNA 提取及亞硫酸鹽修飾，DNA 修飾完成后，按甲基化檢測試劑盒步驟及判讀方法完成實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測，SHOX2 和RASSF1A甲基化檢測結(jié)果任意1項(xiàng)陽性即判讀為陽性。

1.3.2 C-ROSE 檢測 經(jīng)支氣管黏膜活檢、TBNA、TBLB、超聲支氣管鏡針吸活檢術(shù)（EBUS-TBNA）、CT 引導(dǎo)下經(jīng)皮肺穿刺活檢獲取的組織進(jìn)行涂片，每例患者至少檢測2張涂片。將獲取的玻片置于迪夫A染液，浸泡20 s，取出并使用磷酸鹽緩沖液漂洗，甩干后置于迪夫B 染液，浸泡20 s，再次使用生理鹽水漂洗，吸水紙吸除殘留水分，于顯微鏡下（×100）觀察并拍照。由經(jīng)驗(yàn)豐富的細(xì)胞學(xué)醫(yī)師判讀，以發(fā)現(xiàn)核異質(zhì)細(xì)胞為陽性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，Kappa值評價(jià)甲基化和（或）C-ROSE 檢測與病理診斷的一致性，列聯(lián)系數(shù)評價(jià)甲基化檢測、C-ROSE與肺癌診斷的關(guān)聯(lián)程度。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SHOX2 和RASSF1A 甲基化檢測對肺癌的診斷效能分析 179例患者標(biāo)本中甲基化檢測的敏感度為77.59%（45∕58），特異度為80.17%（97∕121），Kappa值=0.550，見表1。

2.2 不同樣本中SHOX2和RASSF1A甲基化檢測與病理診斷一致性分析 肺穿刺活檢標(biāo)本準(zhǔn)確率為88.89%（8∕9），肺泡灌洗液標(biāo)本為79.75%（126∕158），胸水標(biāo)本為63.64%（7∕11），痰液標(biāo)本僅1例，兩種方法檢測一致。肺穿刺活檢及肺泡灌洗液中甲基化檢測與病理診斷具有較好的一致性。

Tab.1 Comparison of SHOX2 and RASSF1A methylation results with pathological diagnosis in 179 cases表1 179例SHOX2和RASSF1A甲基化檢測結(jié)果與病理診斷結(jié)果對比

2.3 不同肺癌亞型中SHOX2和RASSF1A甲基化檢測診斷效能分析 鱗癌及小細(xì)胞肺癌甲基化檢測準(zhǔn)確率分別為92.31%（12∕13）、100%（5∕5），肺腺癌甲基化檢測準(zhǔn)確率為66.67%（18∕27）。

2.4 C-ROSE 檢測對肺癌的診斷效能分析 114例患者標(biāo)本中，C-ROSE 檢測的敏感度為75.56%（34∕45），特異度為95.65%（66∕69），兩者診斷一致性尚可（Kappa值=0.753），見表2。不同介入方式、不同標(biāo)本類型中C-ROSE脫落細(xì)胞制片均可判定是否為正常氣道上皮或者異形細(xì)胞，見圖1。

Tab.2 Comparison of C-ROSE results and pathological diagnosis in 114 patients表2 114例C-ROSE檢測結(jié)果與與病理診斷結(jié)果對比

Fig.1 ROSE images based on different ways of intervention operation(Diff staining,×1 000)圖1 不同介入取材方式的C-ROSE圖像（迪夫染色，×1 000）

2.5 SHOX2 和RASSF1A 甲基化聯(lián)合C-ROSE 檢測對肺癌的診斷效能分析 114例患者標(biāo)本中兩者聯(lián)合檢 測的 敏感 度 為86.96%（39∕45），特 異度 為86.67%（60∕69），Kappa值=0.728，見表3。

2.6 SHOX2 和RASSF1A 甲基化及C-ROSE 與肺癌診斷的相關(guān)性 以列聯(lián)系數(shù)評價(jià)患者性別、年齡、甲基化檢測、C-ROSE與肺癌診斷的關(guān)聯(lián)程度，可見甲基化及C-ROSE 與肺癌診斷具有顯著相關(guān)性（P＜0.01），見表4。

Tab.4 Correlation between methylation test,C-ROSE and lung cancer diagnosis表4 甲基化檢測及C-ROSE與肺癌診斷的相關(guān)性（例）

3 討論

甲基化是迄今為止研究較深入的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制，真核生物中的甲基化僅發(fā)生于胞嘧啶，即在甲基化轉(zhuǎn)移酶（DNMTs）的作用下使CpG二核苷酸5'-端的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)榧谆奏ぃ?6］。研究表明，DNA高甲基化是肺癌的標(biāo)志之一，也是癌變的早期表現(xiàn)［17］。另外，甲基化也被認(rèn)為是肺癌的治療靶點(diǎn)，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑（DNMTi）如氮雜胞苷和地西他濱等藥物已在進(jìn)行藥物實(shí)驗(yàn)及臨床研究［18-19］。目前，有多種基因的甲基化改變被推薦為不同腫瘤的生物標(biāo)志物，如谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶P1（glutathione s-transferase P1，GSTP1），結(jié)腸腺瘤樣息肉蛋白（adenomatosis polyposis coli gene，APC）、RASSF1等［20］。

RASSF1A 啟動(dòng)子甲基化現(xiàn)象已在包括肺癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤中被發(fā)現(xiàn)［21-22］。魏慧君等［23］認(rèn)為，非小細(xì)胞肺癌患者肺組織RASSF1A基因啟動(dòng)子甲基化率明顯高于對照組（41.50%vs.5.58%），其中對照組包括正常組織、血清、支氣管灌洗液等。Zhao等［24］通過Meta分析發(fā)現(xiàn)，淋巴結(jié)、支氣管抽吸物、胸腔積液、血漿和腫瘤組織中的SHOX2甲基化檢測結(jié)果診斷肺癌的總體敏感度為70%，特異度為96%。Shi等［25］對251例肺癌組織標(biāo)本進(jìn)行臨床表現(xiàn)評價(jià)，其中SHOX2 和RASSF1A 的甲基化檢測特異度為90.4%，敏感度為89.8%；同時(shí)定量分析表明，SHOX2甲基化程度與肺癌分期相關(guān)，但RASSF1A甲基化程度與肺癌分期無關(guān)，認(rèn)為SHOX2 和RASSF1A 的甲基化可能在癌癥進(jìn)展中發(fā)揮不同的作用。目前，RASSF1A 和SHOX2 聯(lián)合檢測是一種較好的肺癌篩查和監(jiān)測方法，具有較高的敏感度和特異度，尤其在疾病早期階段［26］。在本研究中，RASSF1A 聯(lián)合SHOX2 甲基化檢測診斷肺癌的總體敏感度為77.59%，特異度為80.17%。不同標(biāo)本的亞組分析中，肺穿刺活檢及肺泡灌洗液標(biāo)本中甲基化與病理診斷一致率較好，而胸水的一致率稍差，提示肺穿刺活檢及肺泡灌洗液更適于作為甲基化檢測的標(biāo)本。在肺癌類型亞組分析中，小細(xì)胞肺癌和鱗癌中甲基化檢測準(zhǔn)確率明顯高于肺腺癌。但現(xiàn)有文獻(xiàn)只是針對腫瘤組織及正常組織的甲基化率進(jìn)行對比分析，尚未明確指出不同類型的標(biāo)本的肺癌亞型分析。筆者在臨床工作中確有發(fā)現(xiàn)，肺小細(xì)胞及鱗癌的甲基化檢測準(zhǔn)確率高于腺癌，后續(xù)研究將繼續(xù)擴(kuò)大樣本量，以深入探討甲基化檢測在不同肺癌亞型之中的準(zhǔn)確性。

隨著呼吸介入技術(shù)的發(fā)展，TBNA、EBUSTBNA、支氣管超聲下經(jīng)引導(dǎo)鞘管肺活檢術(shù)（EBUSGS-TBLB）技術(shù)得到更大范圍普及，C-ROSE 技術(shù)逐漸被認(rèn)可［27］。C-ROSE 不但可以減少活檢次數(shù)，而且可以提高標(biāo)本合格率及診斷準(zhǔn)確率，在標(biāo)本獲取的操作中越來越重要［28］。C-ROSE涂片不干擾原組織標(biāo)本量，可迅速對標(biāo)本進(jìn)行質(zhì)量控制，掌握標(biāo)本分流的方向。本研究進(jìn)一步將甲基化檢測與C-ROSE相結(jié)合，發(fā)現(xiàn)兩者結(jié)合診斷肺癌的敏感度和特異度較單獨(dú)甲基化檢測明顯提升，對比C-ROSE 敏感度亦有較大提升，具有良好的診斷效能。

組織病理的結(jié)果取決于取材組織的準(zhǔn)確和足量，所以呼吸介入技術(shù)的熟練程度和方式的選擇至關(guān)重要。C-ROSE的價(jià)值在于呼吸介入技術(shù)操作過程中迅速指導(dǎo)取材的準(zhǔn)確性，在對一些外壓型和外周肺結(jié)節(jié)病變?nèi)〔臅r(shí)，C-ROSE 未必能得到陽性結(jié)果，組織病理的陽性回報(bào)更少。所以需要考慮更換取材方式，如通過TBNA、EBUS-TBNA、EBUS-GSTBLB 等來獲取更高質(zhì)量、更充足的標(biāo)本，這對術(shù)者的呼吸介入技術(shù)要求較高。目前國內(nèi)能開展比較全面的呼吸介入技術(shù)的醫(yī)院有限，加之C-ROSE 只是將組織的脫落細(xì)胞涂于玻片上，在閱片時(shí)僅可見到單個(gè)獨(dú)立的細(xì)胞，無法像組織切片或冰凍切片等觀察組織立體結(jié)構(gòu)，所以在結(jié)果的預(yù)判上具有一定的局限性。甲基化檢測的大部分標(biāo)本容易獲取，降低了對基層醫(yī)院的呼吸介入技術(shù)的要求，從而提高了診斷準(zhǔn)確率。

綜上，RASSF1A 和SHOX2 甲基化檢測及CROSE 均具有較高的敏感度和特異度。兩者結(jié)合將成為病理學(xué)診斷的有效補(bǔ)充，有助于進(jìn)一步提高肺癌的診斷效能。