葛巍 廖武 張夢婕 楊蘇琴

（江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 南昌 330006）

紅油膏是由九一丹、東丹按比例配以凡士林調(diào)和而成的礦物類中藥外用制劑，具有拔毒祛腐、斂瘡生肌之功效，臨床上多用于肛周膿腫、肛瘺、肛竇炎、乳癰及慢性皮膚潰瘍等膿腐或難愈創(chuàng)面，且療效穩(wěn)定、確切[1～2]。九一丹作為紅油膏療效的重要來源，其中升丹主要成分為氧化汞（HgO），有研究顯示超劑量、長時間用藥可能導(dǎo)致體內(nèi)汞蓄積甚至汞中毒，易造成肝腎功能損傷[3]。由于紅油膏在肛腸疾病中的應(yīng)用范圍較廣且療效確切，但對其毒副作用、用藥劑量及時間的研究鮮有報道。因此，本實驗通過大鼠外用不同劑量紅油膏1個月，并觀察其血液、尿液、肝臟及腎臟中汞含量和肝腎功能，以期為紅油膏臨床安全性提供數(shù)據(jù)參考。現(xiàn)報道如下：

1 材料

1.1 藥品與試劑 紅油膏粉（煅石膏、升丹、東丹按9:1:1.5比例混合制成），由江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科配制；醫(yī)用凡士林紗布（國械注準(zhǔn)20193141543）；水合氯醛溶液（江西省兒童醫(yī)院，批號H20120021）；75%乙醇溶液（江西健寶醫(yī)藥科技有限公司，批號20201006）；氯化鈉注射液（國藥準(zhǔn)字H10983065）；汞標(biāo)準(zhǔn)液（1 000μg/ml，中國計量科學(xué)研究院）。

1.2 儀器 3110全自動生化分析儀（日本HITACHI公司）；RA-915M賽曼原子吸收汞分析儀（北京Lumex分析儀器公司）；5430R小型臺式高速冷凍離心機（Eppendorf艾本德中國有限公司）；ME55型1/10萬電子天平（梅特勒-托利多國際貿(mào)易有限公司）。

1.3 動物 SPF級SD大鼠40只，體質(zhì)量200 g，雌雄各半，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（湘）2019-0004。置于江西中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心分籠飼養(yǎng)，恒溫恒濕，采食全價標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后開始實驗。動物實驗嚴(yán)格遵守江西中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心動物倫理委員會要求，批準(zhǔn)號：JZLLSC20210024。

2 方法

2.1 不同劑量紅油膏的制備 將煅石膏、升丹、東丹研極細(xì)粉，過80目篩，按9:1:1.5比例混合制成紅油膏粉[4]。根據(jù)九一丹人體臨床日均劑量為200 mg（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院提供）[5]，按人與大鼠體表面積換算，人體表面積約1.6 m2（體質(zhì)量60 kg），則人日均劑量為125 mg/m2；大鼠表面積約0.033 m2（體質(zhì)量0.2 kg），則大鼠日均劑量為4.125 mg[6]。因此，大鼠紅油膏粉日均劑量為4.744 mg（相當(dāng)于人體臨床日均劑量230mg）。稱取紅油膏粉4.744 mg、94.875 mg、189.750 mg均勻涂抹于3 cm×3 cm醫(yī)用凡士林紗條上，制成低劑量紅油膏紗條（相當(dāng)于正常劑量）、中劑量紅油膏紗條（相當(dāng)于正常劑量20倍）、高劑量紅油膏紗條（相當(dāng)于正常劑量40倍）。

2.2 實驗分組與給藥 將40只大鼠隨機分成4組（正常組、紅油膏低劑量組、紅油膏中劑量組、紅油膏高劑量組），每組10只。按體質(zhì)量予以10%水合氯醛（0.35 ml/100 g）腹腔注射麻醉后，大鼠背部剃毛，面積約5 cm×5 cm，用橡皮筋捆住四肢，呈腹臥位固定在大鼠固定板上，75%乙醇局部消毒手術(shù)區(qū)，選擇距肩胛骨以下2 cm，以背中部脊柱為中點制作3 cm×3 cm的全層皮膚缺損創(chuàng)面，深至深筋膜層，形成機械損傷動物模型，每隔3 d用刀片刮傷，保持新鮮、不愈合狀態(tài)。給藥前予以氯化鈉注射液清洗創(chuàng)面，正常組予以醫(yī)用凡士林紗條貼敷，給藥組分別予以紅油膏低劑量紗條、紅油膏中劑量紗條、紅油膏高劑量紗條貼敷。換藥結(jié)束后予紗布覆蓋，膠布固定，每日換藥1次，持續(xù)30 d。

2.3 體內(nèi)汞蓄積測定 持續(xù)給藥30 d，第30天收集各組大鼠24 h尿液。給藥結(jié)束次日，大鼠麻醉后腹主動脈取全血置于抗凝管，靜置1 h，4℃、3 500 r/min離心10 min，取血清置于EP管；同時摘取肝臟和腎臟制備組織勻漿，4℃、3 500 r/min離心15 min，分離上清液置于EP管。用賽曼原子吸收汞分析儀檢測大鼠尿液、血液、肝臟及腎臟中的汞含量。

2.4 肝腎功能檢測同上述方法制成血清，用全自動生化儀測定大鼠血清中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、尿素氮（BUN）、肌酐（CREA）的含量。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法數(shù)據(jù)處理采用SPSS22.0統(tǒng)計學(xué)軟件，計數(shù)資料以%表示，采用χ2檢驗，計量資料以（±s）表示，采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 紅油膏對大鼠血液、尿液、肝臟及腎臟中汞含量的影響持續(xù)30 d給藥后，相比正常組，紅油膏低、中、高劑量組的血液和尿液中汞含量均明顯升高（P＜0.05，P＜0.01），且紅油膏中、高劑量組的肝臟、腎臟中汞含量均明顯升高（P＜0.01）。相比紅油膏低劑量組，紅油膏中、高劑量組尿液、肝臟、腎臟中汞含量均明顯升高（P＜0.01）。相比紅油膏中劑量組，紅油膏高劑量組尿液、腎臟中汞含量均明顯升高（P＜0.01）。見表1。

表1 紅油膏對大鼠血液、尿液、肝臟及腎臟中汞含量的影響（x±s）

3.2 紅油膏對大鼠肝腎功能的影響 持續(xù)給藥30 d后，在肝功能方面，紅油膏高劑量組中AST含量較正常組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），其余各給藥組中ALT、AST的含量與正常組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。在腎功能方面，相比于正常組，紅油膏中、高劑量組中BUN與CREA含量均明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 紅油膏對大鼠肝腎功能的影響（x±s）

4 討論

中醫(yī)丹藥應(yīng)用起源于春秋戰(zhàn)國，至明清達到鼎盛時期，尤其在中醫(yī)外科領(lǐng)域收獲奇效[7]。但其中不乏含有鉛、汞、砷等有毒成分，長期應(yīng)用時應(yīng)時刻警惕這些有毒成分蓄積及靶器官毒性反應(yīng)[8]。除了口服途徑以外，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)含汞礦物類中藥外用也是造成汞蓄積及慢性肝腎損傷的重要原因，且主要與用藥劑量及時間有關(guān)[9]。因此，亟待開展紅油膏外用安全性及毒性研究的動物實驗。

在體內(nèi)汞蓄積方面，大鼠持續(xù)紅油膏給藥30 d后，汞在血液和尿液中存在不同程度的蓄積，隨著用藥劑量的逐漸加大，肝腎臟出現(xiàn)明顯汞蓄積，其中尿液和腎臟的汞蓄積呈一定劑量依賴性。特別注意的是肝臟、腎臟在正常臨床日均用量下汞蓄積量未見明顯差異。上述結(jié)果提示正常臨床日均用量下外用紅油膏30 d對肝臟、腎臟汞蓄積影響較小，而過量使用紅油膏是導(dǎo)致肝腎汞蓄積的主要因素。汞在體內(nèi)代謝周期長，易產(chǎn)生體內(nèi)蓄積及靶器官毒性反應(yīng)，有研究顯示小鼠連續(xù)2周灌胃朱砂可發(fā)現(xiàn)小鼠的肝臟、腎臟、血液均有明顯汞蓄積[10]。體內(nèi)汞蓄積實驗表明長期給藥的汞蓄積量為腎臟＞腦＞肝臟＞血液，而單次給藥的汞蓄積量為肝臟最多[11]。腎臟作為汞的主要排泄器官，汞蓄積可引發(fā)腎臟中半胱氨酸-汞-半胱氨酸耦合物形成、脂質(zhì)過氧化損傷以及有機陰離子轉(zhuǎn)運體Oat1和Oat受到抑制，進而導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞腫脹壞死、皮質(zhì)增厚、腎腫大等腎實質(zhì)損傷[12]。汞還可與體內(nèi)靶器官中的谷胱甘肽和谷胱甘肽過氧化物酶等產(chǎn)生結(jié)合作用，導(dǎo)致含巰基的抗氧化劑損耗及蛋白質(zhì)損傷，進而引發(fā)氧化應(yīng)激介導(dǎo)的肝損傷[13]。

對大鼠肝腎功能的相關(guān)指標(biāo)檢測發(fā)現(xiàn)，低劑量紅油膏對ALT、AST、BUN、CREA水平影響較小，而高劑量紅油膏可致AST含量明顯升高，中、高劑量紅油膏也可致BUN、CREA含量明顯升高。血清ALT、AST是評價肝功能的重要指標(biāo)，汞蓄積可誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化，進而引發(fā)ALT、AST等肝功能異常升高[14]。血清BUN、CREA是評價腎小球濾過功能的經(jīng)典指標(biāo)，兩者水平升高能夠間接反映腎臟損傷程度[15]。上述實驗結(jié)果提示超劑量使用紅油膏可對肝腎功能造成損傷，而持續(xù)30 d的正常臨床日均用量未見明顯的肝腎毒性。然而，上述實驗中紅油膏中劑量組中AST含量與肝臟汞蓄積量存在滯后性，這也提示AST在評價汞蓄積所致肝毒性的靈敏度方面可能存在誤差。中、高劑量紅油膏中BUN、CREA含量上升趨勢與腎臟汞蓄積量一致，表明BUN、CREA可能是評價紅油膏汞蓄積所致腎毒性的可靠指標(biāo)。

綜上所述，紅油膏長期、超量給藥可造成大鼠體內(nèi)血液、尿液、肝臟、腎臟中汞蓄積及肝臟、腎毒性，但日均劑量4.744 mg（相當(dāng)于人體臨床日均劑量230 mg）且持續(xù)30 d外用紅油膏粉對肝腎臟汞蓄積及肝腎功能影響較小，可為紅油膏臨床安全性提供數(shù)據(jù)參考。盡管如此，人體臨床日均劑量230 mg紅油膏在血液和尿液中汞蓄積仍不可避免，建議通過減少使用時間以保障紅油膏臨床用藥安全。對于兒童、孕婦、老年人等特殊人群仍然缺乏相關(guān)安全性評價證據(jù)，建議禁用、慎用。