黃苓芬 陸恒 謝圓圓 韋樹根 韋天如 潘麗梅

摘要??? 以金果欖組培苗為試材，研究了基礎(chǔ)培養(yǎng)基類型、不同pH、不同碳源及碳源濃度、不同瓊脂濃度對金果欖叢生芽繼代增殖培養(yǎng)的影響。結(jié)果表明：金果欖叢生芽繼代增殖的最優(yōu)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，叢生芽增殖系數(shù)達(dá)到13.85;培養(yǎng)基酸堿度以pH4.5～5.0為宜，傾向于偏酸性的環(huán)境，叢生芽增殖系數(shù)達(dá)到13.22～15.27;最佳碳源為蔗糖，濃度為25 g/L;瓊脂的較佳濃度為4.5～5 g/L，在最優(yōu)的組合條件下，金果欖叢生芽粗壯，增殖系數(shù)高，生長快。本研究結(jié)果為金果欖組培苗的繼代增殖及工廠化育苗提供技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞??? 金果欖;叢生芽;培養(yǎng)基;pH;增殖系數(shù)

中圖分類號??? R281.4??? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼??? A??? DOI：10.12008/j.issn.1009-2196.2022.02.011

Study on the Influence Factors of Cluster Bud Proliferation Culture of Tinospora capillipes Gagnep.

HUANG Qinfen??? LU Heng??? XIE Yuanyuan??? WEI Shugen??? WEI Tianru??? PAN Limei

（Guangxi Botanical Garden of Medicinal Plants，Nanning，Guangxi 530023，China）

Abstract ????Taking the tissue cultured seedling of Tinospora capillipes Gagnep. as materials，the effects of basic medium type，different pH value，different carbon source and carbon source concentration，different agar concentration on the subculture and proliferation of cluster buds of Tinospora capillipes Gagnep. were studied. The results showed that the optimal medium for the proliferation of cluster buds is MS medium，and the proliferation coefficient of cluster buds reached 13.85. The suitable pH is 4.5-5.0，which is inclined to acidic environment，and the proliferation coefficient of cluster buds is 13.22-15.27. The best carbon source is sucrose，the concentration is 25 g·L;the optimal concentration of agar is 4.5～5 g·L. Under the optimal combination conditions，the cluster buds of Tinospora capillipes Gagnep. are strong，the proliferation coefficient is high and the growth is fast. The results of this study provide technical support for the subculture and propagation of tissue culture seedlings and industrial seedling of Tinospora capillipes Gagnep.

Keywords ????Tinospora capillipes Gagnep.;cluster bud;medium;pH;proliferation coefficient

金果欖（Tinospora capillipes Gagnep.），又名地苦膽、青牛膽。野生資源主要分布在廣西、湖南、湖北、四川、貴州和云南部分地區(qū)，為我國傳統(tǒng)中草藥，以植株的干燥塊根入藥，具有清熱解毒、利咽、止痛之功效。因其具有良好的抗炎效果[1-3]，近年來被多家藥企重視，需求量逐年升高，因此人工種植前景看好。但金果欖雌雄異株，授粉受到環(huán)境影響極大，自然結(jié)實(shí)率低，在資源調(diào)查和引種中發(fā)現(xiàn)，金果欖雄株遠(yuǎn)多于雌株（約50：1），結(jié)果機(jī)會大大減少，且種子有明顯的休眠期，發(fā)芽率較低，種子繁殖困難[4]。組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)是應(yīng)用廣泛的現(xiàn)代繁育技術(shù)，具有繁殖系數(shù)高、育苗速度快等優(yōu)點(diǎn)，還能保持原植株的優(yōu)良性狀，成為植物繁殖領(lǐng)域的優(yōu)先技術(shù)[5]。課題組前期建立了金果欖組織培養(yǎng)技術(shù)[4]，但在金果欖的繼代增殖培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)，不同的培養(yǎng)基類型以及pH等對金果欖叢生芽繼代培養(yǎng)有不同的影響。因此本研究以金果欖組培苗為實(shí)驗(yàn)材料，研究不同的培養(yǎng)基類型、不同pH、不同碳源、碳源濃度以及瓊脂濃度對金果欖叢生芽繼代增殖培養(yǎng)的影響，以期為金果欖的增殖培養(yǎng)及工廠化生產(chǎn)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1??? 材料與方法

1.1??? 材料

1.1.1??? 試材??? 試驗(yàn)材料為廣西藥用植物園組培室保存的金果欖組培苗，組培苗來源于金果欖雌性植株的幼嫩莖段。

1.1.2??? 試劑??? 主要試劑包括MS培養(yǎng)基、White培養(yǎng)基、LS培養(yǎng)基、B5培養(yǎng)基、N6培養(yǎng)基、生長素類似物使用a-萘乙酸（NAA）、細(xì)胞分裂素使用6-芐氨基嘌呤（6-BA）;蔗糖、葡萄糖、白糖、瓊脂等。

1.2??? 方法

1.2.1?? ?試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1.1??? 不同培養(yǎng)基類型對金果欖叢生芽繼代增殖的影響??? 將金果欖組培苗帶腋芽的莖段接入不同類型培養(yǎng)基中，配制的培養(yǎng)基類型分別包括MS、White、LS、B5、N6共5種培養(yǎng)基，培養(yǎng)基的其余成分為6-BA1.0 mg/L+NAA0.2 mg/L+蔗糖25 g/L+瓊脂4.5g/L，各處理設(shè)置15瓶，每瓶接種3個(gè)帶腋芽組培苗，3次重復(fù)，培養(yǎng)30 d后觀察記錄叢生芽增殖系數(shù)及生長狀況。

1.2.1.2??? 不同pH對金果欖叢生芽繼代增殖的影響??? 以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，將金果欖組培苗帶腋芽的莖段接入不同pH培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)pH至4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5共6組處理，各處理設(shè)置15瓶，每瓶接種3個(gè)帶腋芽組培苗，3次重復(fù)，培養(yǎng)30 d后觀察記錄叢生芽增殖系數(shù)及生長狀況。

1.2.1.3??? 不同碳源對金果欖叢生芽繼代增殖的影響??? 以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別加入蔗糖、葡萄糖、白糖作為碳源，各種糖用量為25 g/L，各處理設(shè)置15瓶，每瓶接種3個(gè)帶腋芽組培苗，3次重復(fù)，培養(yǎng)30 d后觀察記錄叢生芽增殖系數(shù)及生長狀況。

1.2.1.4??? 不同蔗糖濃度對金果欖叢生芽繼代增殖的影響??? 以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，設(shè)置5個(gè)不同蔗糖濃度，分別為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0 g/L，研究不同濃度的蔗糖對叢生芽繼代增殖的影響，各處理設(shè)置15瓶，每瓶接種3個(gè)帶腋芽組培苗，3次重復(fù)，培養(yǎng)30 d后觀察記錄叢生芽增殖系數(shù)及生長狀況。

1.2.1.5??? 不同瓊脂濃度對金果欖叢生芽繼代增殖的影響??? 以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，試驗(yàn)設(shè)置5個(gè)不同瓊脂濃度，分別為15、20、25、30、35 g/L，研究不同瓊脂濃度對叢生芽繼代增殖的影響，各處理設(shè)置15瓶，每瓶接種3個(gè)帶腋芽組培苗，3 次重復(fù)，培養(yǎng)30 d后觀察記錄叢生芽增殖系數(shù)及生長狀況。

以上所有處理，除了特定設(shè)置的試驗(yàn)條件，其余均以MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+蔗糖25 g/L+瓊脂4.5 g/L作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，所有處理的培養(yǎng)條件為：溫度（25±1）℃，光照時(shí)間12 h/d，光照強(qiáng)度2 500 lx。

1.2.2??? 數(shù)據(jù)處理??? 試驗(yàn)數(shù)據(jù)均做3次重復(fù)，用Microsoft Office Excel和SPSS16.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2??? 結(jié)果與分析

2.1??? 不同培養(yǎng)基類型對金果欖叢生芽繼代增殖的影響

不同培養(yǎng)基類型對金果欖叢生芽繼代增殖的影響見表1。由表1可以看出，不同的培養(yǎng)基類型對金果欖叢生芽的繼代增殖有不同的影響，其中以MS培養(yǎng)基的培養(yǎng)效果最好，叢生芽增殖系數(shù)達(dá)到13.85，顯著高于其他幾種培養(yǎng)基;其次是N6和B5培養(yǎng)基，增殖系數(shù)分別達(dá)到9.33和9.12，叢生芽生長狀態(tài)也相似;效果較差的是White培養(yǎng)基和LS培養(yǎng)基，叢生芽增殖效果一般，不適于金果欖叢生芽的增殖培養(yǎng)。

2.2??? 不同pH對金果欖叢生芽繼代增殖的影響

不同pH對金果欖叢生芽繼代增殖的影響見表2。由表2可以看出，不同pH對金果欖叢生芽繼代增殖有較大影響，偏酸性的環(huán)境更有利于金果欖叢生芽的繼代增殖，其中以pH 4.5～5.0較為適合，叢生芽增殖系數(shù)在13.22～15.27，顯著高于其他處理;隨著pH的升高，金果欖叢生芽的增殖系數(shù)降低，且生長狀態(tài)較差，特別是當(dāng)pH達(dá)到6.5時(shí)，叢生芽增殖率低，芽細(xì)弱，葉泛黃，不利于叢生芽生長。

2.3??? 不同碳源對金果欖叢生芽繼代增殖的影響

不同碳源對金果欖叢生芽繼代增殖的影響見表3。由表3可以看出，不同碳源對金果欖叢生芽繼代增殖影響不大，3種碳源都能正常繼代增殖，沒有顯著差異，增殖系數(shù)均達(dá)到了10以上，以蔗糖為碳源的培養(yǎng)基，其增殖系數(shù)以及生長狀態(tài)稍微優(yōu)于另外2種碳源，因此以蔗糖為碳源最佳。

2.4??? 不同蔗糖濃度對金果欖叢生芽繼代增殖的影響

從表4可知，不同的蔗糖濃度對金果欖叢生芽的繼代增殖有明顯的影響，蔗糖濃度以25～30 g/L為宜，增殖系數(shù)分別為14.03和13.86，生長狀態(tài)也最好。蔗糖濃度過高或過低都不利于繼代增殖，濃度為15 g/L時(shí)增殖系數(shù)僅4.35，而當(dāng)濃度超過30 g/L后，增殖系數(shù)也隨之降低，且長勢較差。綜合以上因素，以25 g/L的蔗糖濃度最利于金果欖叢生芽的增殖培養(yǎng)。

2.5??? 不同瓊脂濃度對金果欖叢生芽繼代增殖的影響

瓊脂作為凝固劑，對金果欖叢生芽的繼代增殖也有較大影響。瓊脂用量在4.0～5.0 g/L，叢生芽的增殖系數(shù)隨著瓊脂用量的加大而增加（表5），當(dāng)用量升至5.0 g/L時(shí)，叢生芽的增殖系數(shù)最大，達(dá)到12.89，與其它用量相比差異顯著;而當(dāng)瓊脂用量超過5 g/L時(shí)，叢生芽的增殖系數(shù)開始降低。從叢生芽苗的生長狀態(tài)來看，用量超過5 g/L對金果欖叢生芽的生長不利，當(dāng)瓊脂濃度為4.5 g/L時(shí)，叢生芽的長勢最好，從總體上看，金果欖叢生芽增殖培養(yǎng)的瓊脂濃度以4.5～5.0 g/L為宜。

3??? 討論與結(jié)論

在植物的組織培養(yǎng)過程中，叢生芽的繼代增殖容易受多種因素影響，適宜的濃度水平和相互作用才能使叢生芽更好地增殖和生長[6]。課題組前期進(jìn)行了金果欖組織培養(yǎng)技術(shù)的初步研究，總結(jié)了金果欖從初代誘導(dǎo)到生根移栽的基礎(chǔ)技術(shù)[4]，但在日常的繼代增殖過程中，發(fā)現(xiàn)不少因素影響著金果欖叢生芽的繼代增殖。

首先是基礎(chǔ)培養(yǎng)基類型，不同的培養(yǎng)基類型主要區(qū)別在于其無機(jī)鹽和離子濃度的高低不同，因此適應(yīng)于不同植物的組織培養(yǎng)[7]。本研究中MS培養(yǎng)基最適合金果欖叢生芽的增殖培養(yǎng)，其次是N6培養(yǎng)基和B5培養(yǎng)基，效果較差的是White培養(yǎng)基和LS培養(yǎng)基。MS培養(yǎng)基和N6培養(yǎng)基都是含有較高無機(jī)鹽和較高離子濃度的培養(yǎng)基，說明金果欖的叢生芽增殖需要較高的無機(jī)鹽和離子濃度，其中MS培養(yǎng)基也是目前應(yīng)用最廣的培養(yǎng)基[8];其次是培養(yǎng)基的酸堿度，不同pH下各培養(yǎng)基對金果欖叢生芽的增殖有顯著的影響，總體以在偏酸性的培養(yǎng)基中增殖效果更好，生長更旺，與藍(lán)莓[9]等的研究結(jié)果相似，常規(guī)培養(yǎng)基的pH控制在5.6～6.0，這一范圍對大多數(shù)植物的組織培養(yǎng)較為適合[10-11]，但也有偏堿性的報(bào)道[12-13]。之所以與常規(guī)培養(yǎng)基不同，金果欖的叢生芽更傾向于偏酸性的環(huán)境，本研究認(rèn)為可能與繼代增殖過程中的分泌物有關(guān)。

增殖培養(yǎng)基中不同的碳源及濃度也對金果欖叢生芽分化有不同的影響，碳源為細(xì)胞的呼吸代謝提供底物與能源，在各種最簡單至最復(fù)雜的培養(yǎng)基中，幾乎均要加入糖作為碳源[14]，本研究中以25～30 g/L的蔗糖更適合金果欖叢生芽的增殖培養(yǎng)，與大多數(shù)植物組織培養(yǎng)的用糖量一致[11]。瓊脂作為一種培養(yǎng)基的凝固劑和支持物，其濃度的大小決定了培養(yǎng)基的硬度，影響著培養(yǎng)物對培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的吸收，進(jìn)而影響培養(yǎng)物的生長，瓊脂濃度過低則培養(yǎng)基不凝固，影響叢生芽接種，瓊脂濃度過高則培養(yǎng)基偏堿性，不適于金果欖叢生芽增殖，本研究中以4.5～5 g/L蔗糖較適合金果欖叢生芽的增殖培養(yǎng)，與文心蘭[15]的10 g/L、薄荷[16]的8 g/L等明顯不同，究其原因，可能與金果欖叢生芽的繼代增殖更傾向于偏酸性的環(huán)境有關(guān)，與前面的研究結(jié)果相符。

本試驗(yàn)通過研究金果欖叢生芽的增殖分化過程，從培養(yǎng)基類型、培養(yǎng)基pH、不同碳源、碳源濃度以及瓊脂濃度建立了金果欖叢生芽增殖體系，為金果欖的工廠化育苗及遺傳轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。

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