常雪飛 歐陽茜茜 王韻 孫國慶 田洋

摘要??? 以辣木葉為原料，首先對植物多糖提取的影響因素及工藝進(jìn)行研究，其次通過不同體積分?jǐn)?shù)乙醇分級醇沉多糖探索辣木葉多糖的抗氧化性。采用熱水浸提法，在單因素的基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗，考察辣木葉多糖得率的影響因素，通過乙醇梯度沉淀分級的方法得到3種辣木葉多糖，分別命名為MP-1（40%乙醇）、MP-2（60%乙醇）、MP-3（80%乙醇），真空冷凍干燥后得到這3種辣木葉粗多糖，并探討辣木葉多糖體外抗氧化活性。通過單因素及正交試驗得出辣木葉多糖的最佳提取工藝為：料液比1：20g/mL、提取溫度85℃、提取時間2.5 h、提取次數(shù)2次，在此條件下，辣木葉多糖得率為2.039%。體外抗氧化實驗表明，MP-1、MP-2、MP-3均具有良好的DPPH自由基清除活性，在辣木葉多糖濃度為25 μm/mL時，MP-1的DPPH自由基清除能力最低，此時MP-3的DPPH自由基清除能力最高，達(dá)到85.34%。該提取工藝條件穩(wěn)定可行，多糖得率較高，且具有較強(qiáng)的抗氧化能力;該提取方法無需特殊設(shè)備，生產(chǎn)工藝成本低，安全，適合工業(yè)化大生產(chǎn)，是一種可取的提取方法。

關(guān)鍵詞??? 辣木葉;多糖;提取工藝;分級醇沉;抗氧化

中圖分類號??? S792.99??? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼??? A??? DOI：10.12008/j.issn.1009-2196.2022.02.013

Extraction and Isolation of Polysaccharides from Moringa Leaves and Their Antioxidant Activities

CHANG Xuefei1??? OUYANG Qianqian1，2，3??? WANG Yun1??? SUN Guoqing1??? TIAN Yang1

（1. School of Food Science and Technology，Yunnan Agricultural University/Engineering Research Center for the Development and Utilization of Edible and Medicinal Resources，Ministry of Education，Kunming，Yunnan 650201，China;2. Marine Biomedical Research Institute，Guangdong Medical University，Zhanjiang，Guangdong 524023，China;3. Zhanjiang Marine Biomedical Research Institute，Zhanjiang，Guangdong 524023，China）

Abstract??? Polysaccharides were extracted from the leaves of Moringa oleifera. The influencing factors and technology of the polysaccharide extraction were optimized，and the antioxidant activities of the polysaccharides extracted from the leaves of M. oleifera by ethanol fractional precipitation were analyzed. The hot water extraction method was used to conduct orthogonal experiments based on the single factor experiments to investigate the factors influencing the yield of polysaccharides extracted from the Moringa leaves. Three polysaccharides were fractionated from the Moringa leaves by graded ethanol precipitation，which were named MP-1 （40% ethanol），MP-2 （60% ethanol），MP-3 （80% ethanol）. These crude polysaccharides extracted from the Moringa leaves were vacuum freeze-dried，and their antioxidant activities in vitro were analyzed. Single factor and orthogonal experiments showed that the optimal extraction for Moringa leaf polysaccharides is done when the mate- rial-to-liquid ratio is 1：20 g·mL，extraction temperature 85 ℃，extraction time 2.5 h and extraction frequencies 2 times. Under these optimal conditions the extraction yield of polysaccharides from M. oleifera leaves is 2.039%. Antioxidant activity test in vitro of the polysaccharides showed that MP-1，MP-2，and MP-3 all have good DPPH free radical scavenging activity. When the concentration of the M. oleifera leaf polysaccharides is 25 μg·mL，MP-1 has the lowest DPPH free radical scavenging ability，while MP-3 has the highest DPPH free radical scavenging ability，which is upto 85.34%. This extraction is feasible under these stable conditions，and has a high yield of polysaccharides，and the polysaccharides extracted under these conditions have high antioxidant activities，which lays the foundation for the in-depth study of M. oleifera leaf polysaccharides. The extraction method does not require special equipment，has low extraction cost，and is safe and suitable for large-scale industrial production of the polysaccharides，and it is hence a desirable extraction method.

Keywords??? Moringa leaves;polysaccharides;extraction technology;graded alcohol precipitation;antioxidant

辣木（Moringa oleifera Lam.）又稱鼓槌樹或洋椿樹，屬白花菜目辣木科辣木屬，原產(chǎn)于印度，是一種種植范圍廣、營養(yǎng)及利用價值極高的多年生樹種，具有耐干旱、耐貧瘠、生長迅速、適應(yīng)性強(qiáng)等特點。有研究表明，口服辣木葉提取物幾乎不會對動物體造成任何毒副作用。辣木研究逐步形成產(chǎn)業(yè)化及規(guī)模化[1-2]。辣木主要種植地分布于印度、南美及東南亞國家，中國主要分布于海南、臺灣、廣東及云南等地[3]。辣木的葉、根、籽和花均可食用，其中氨基酸、蛋白質(zhì)以及維生素等營養(yǎng)物質(zhì)含量豐富。辣木葉不但營養(yǎng)豐富，可作為優(yōu)質(zhì)的飼料，還具有抗氧化、降血糖、降血脂的功效，如辣木葉中富含黃酮、酚昔類物質(zhì)，具有明顯的降糖效果，滿足人們對飲食營養(yǎng)健康的需求，國家衛(wèi)生部于2012年將辣木葉批準(zhǔn)為新資源食品，可見辣木葉作為新資源食品的研究開發(fā)利用價值[4]。

多糖又稱多聚糖，是一種分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜的天然活性成分，一般由10個以上單糖單元組成，廣泛分布于動植物、微生物與藻類細(xì)胞中[5]。目前已知的天然多糖化合物大約有300多種，其中至少有100多種被應(yīng)用于臨床試驗，以制造相關(guān)藥物。多糖廣泛存在于生物體內(nèi)，是除蛋白質(zhì)和核酸外另一類能維持機(jī)體正常運行的生物大分子，因其在抗氧化、抗腫瘤、降血糖、降血脂方面的功效，逐漸成為生物化學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域的研究熱點[6]。

辣木葉富含大量的多糖，含量8.61%～33.61%不等，是眾多優(yōu)質(zhì)植物源多糖之一，制備方法多為水提、酶提及酸堿提等。眾多研究表明，辣木葉多糖不僅兼具多糖的功效，還對促進(jìn)腸胃吸收、增強(qiáng)免疫力、調(diào)節(jié)血糖等有明顯作用[7]。目前對辣木葉的研究較少，多集中于提取工藝及體外生物活性驗證方面，極少涉及到辣木葉多糖體內(nèi)生物活性和結(jié)構(gòu)的解析方面。辣木葉多糖能有效清除機(jī)體內(nèi)自由基，提高血液中超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）等的活性，從而阻斷活性氧和自由基的生成，起到抗氧化作用網(wǎng);此外，辣木葉多糖用于功能性食品的開發(fā)也是另外一個研究熱點[9]。

本研究以云南德宏地區(qū)的辣木葉為研究對象，以水溶性多糖得率為指標(biāo)，對辣木葉多糖的提取工藝進(jìn)行了單因素試驗和正交試驗研究，探討其多糖提取最佳工藝條件和體外抗氧化活性，為開發(fā)云南的辣木葉資源提供科學(xué)參考。

1??? 材料與方法

1.1??? 材料

1.1.1??? 試材??? 辣木葉粉，德宏天佑科技開發(fā)有限公司;葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，北京索萊寶科技有限公司;濃硫酸，重慶川東化工有限公司;5%苯酚，北京索萊寶科技有限公司;無水乙醇，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司;氯仿，成都市科隆化學(xué)品有限公司;正丁醇，重慶川東化工有限公司;DPPH試劑盒，北京索萊寶科技有限公司。

1.1.2??? 儀器與設(shè)備??? RE-3000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）;FD-1A-50型真空冷凍干燥機(jī)（上海比郎儀器制造有限公司）;紫外可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）;HH-11-2型水浴鍋（常州諾基儀器有限公司）;JY2002型電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）;VL-7F低速冷凍離心機(jī)（長沙市白諾克離心機(jī)儀器有限公司）;低速離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）。

1.2??? 方法

1.2.1??? 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作??? 準(zhǔn)確稱取干燥至恒重的葡萄糖10mg，然后取適量的蒸餾水溶解，轉(zhuǎn)移到100 mL的容量瓶中，最后加水稀釋到容量瓶的刻度線，即可得到0.1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，標(biāo)記為標(biāo)普A;按表1添加相同試劑，快速渦旋震蕩30 s，靜置30 min，于490 nm處測定吸光度[10]，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2??? 辣木葉多糖的制備??? 稱取50 g辣木葉粉末，加入1 L的去離子水，于90℃水浴鍋中加熱回流2 h，以4 000 r/min轉(zhuǎn)速離心20 min，收集上清液，置于45 ℃下，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮，待懸蒸至400 mL時取出;加入1/4體積的Sevag試劑（V：V=4：1）進(jìn)行脫蛋白，混合搖勻30 min，使其充分混勻，離心5 min（4 000 r/min），將上層溶液吸出，置于新的離心管內(nèi);繼續(xù)加入Sevag溶液，至少重復(fù)8次，直至無白色絮狀沉淀出現(xiàn);于45 ℃下減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去殘留的Sevag試劑，并濃縮至200 mL;加入100g AB-8大孔樹脂，室溫條件下?lián)u晃脫色2 h，抽濾分離濾液，用去離子水清洗3次，合并濾液，減壓濃縮至200 mL;在濃縮液中加入4倍的無水乙醇，在4 ℃冰箱中靜置過夜;第二天離心10 min（4 000 r/min）得到沉淀，冷凍干燥得到辣木葉粗多糖，最后計算辣木葉多糖的得率。

1.2.3??? 影響多糖得率的單因素試驗

1.2.3.1??? 液料比對辣木葉多糖得率的影響??? 準(zhǔn)確稱取辣木葉粉末2 g，固定提取溫度90 ℃，提取時間2 h，提取次數(shù)1次，分別考察液料比1：10、1：15、1：20、1：25、1：30（g/mL）對辣木葉粗多糖得率的影響。

1.2.3.2??? 提取溫度對辣木葉多糖得率的影響??? 準(zhǔn)確稱取辣木葉粉末2 g，固定液料比1：20（g/mL），提取時間2 h，提取次數(shù)1次，分別考察提取溫度75、80、85、90、95℃對辣水葉粗多糖得率的影響。

1.2.3.3??? 提取時間對辣木葉多糖得率的影響??? 準(zhǔn)確稱取辣木葉粉末2 g，固定液料比1：20（g/mL），提取溫度90 ℃，提取次數(shù)1次，分別考察提取時間1.0、1.5、2.0、2.5、3.0h對辣木葉多糖得率的影響。

1.2.3.4??? 提取次數(shù)對辣木葉多糖得率的影響??? 準(zhǔn)確稱取辣木葉粉末2 g，固定液料比1：20（g/mL），提取溫度90 ℃，提取時間2 h，分別考察提取次數(shù)1、2、3、4、5次對辣木葉多糖得率的影響[11]。

1.2.4??? 辣木葉多糖提取的正交試驗??? 在單因素的試驗基礎(chǔ)上，以料液比、提取溫度、提取時間、提取次數(shù)來設(shè)計四因素三水平的正交試驗[12]，以辣木葉多糖得率為考察指標(biāo)，正交試驗因素水平見表2。利用正交設(shè)計助手輔助軟件設(shè)計正交試驗方案，見表3。

1.2.5??? 辣木葉多糖乙醇分級醇沉??? 在辣木葉多糖濃縮液中加入一定量的無水乙醇，使其體積分?jǐn)?shù)為40%、60%、80%，冷凍干燥得到相應(yīng)的辣木葉多糖，最后計算辣木葉多糖得率。

1.2.6??? 多糖得率計算[13]??? 量取樣液2.0 mL，加5% 苯酚溶液1 mL搖勻，迅速加入濃硫酸溶液5 mL，快速渦旋震蕩30 s，靜置30 min，于490 nm處測定吸光度。

式中：C為辣木葉多糖濃度（mg/mL）;V為辣木葉多糖溶液的體積（mL）;M為辣木葉干粉質(zhì)量（mg）。

1.2.7??? 辣木葉多糖的抗氧化活性測定??? 主要測定辣木葉多糖對DPPH自由基的清除作用[14]。采用氮自由基（DPPH）清除能力測試試劑盒，其中包括試劑一[DPPH 試劑（1 mL）一瓶]、試劑二[100 μg/mL VC 標(biāo)準(zhǔn)溶液（20 mL）一瓶]。

1.2.7.1??? 試劑配制??? 試劑一溶液：將DPPH試劑放入37 ℃水浴鍋中平衡20 min左右，等待試劑完全融化后，在試劑瓶中加入100 mL的95%無水乙醇，劇烈震蕩，使試劑充分混勻溶解。

試劑二溶液：分別量取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL試劑二于試管中，再依次加入9.5、9.0、8.5、8、7.5 mL純水，使其充分混勻，配制成5、10、15、20、25μg/mL的VC樣品。

辣木葉多糖樣品溶液配制：稱取一定量的MP-1、MP-2、MP-3辣木葉多糖，配制成5、10、15、20、25 μg/mL的辣木葉多糖樣品溶液。

1.2.7.2??? 操作步驟??? 參照李欣欣等[15]的測定方法，在96孔板上設(shè)置空白孔、對照孔、測定孔和VC測定孔，每個孔設(shè)置3個平行[16]。其中，空白孔加入試劑一和純水各1 mL，對照孔依次加入各個濃度的樣品溶液1 mL，測定孔依次加入試劑一和各個濃度的樣品溶液各1 mL，VC測定孔依次加入各個濃度的VC樣品1mL;輕微震動，使其充分混勻，在室溫下避光靜置30 min使其充分反應(yīng)，使用酶標(biāo)儀于517nm處測定其吸光值。

2??? 結(jié)果與分析

2.1??? 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。以濃度（X）為橫坐標(biāo)，吸光度（Y）為縱坐標(biāo)，得到曲線，回歸方程Y=5.025 2X+0.103 7，相關(guān)系數(shù)R=0.999 2，線性關(guān)系良好。

2.2??? 單因素試驗結(jié)果

2.2.1??? 料液比對辣木葉多糖得率的影響??? 料液比對辣木葉多糖得率的影響如圖2所示。由圖2可知，辣木葉多糖得率隨著液料比的增加先升高后降低[17]。其中液料比為1：20時，辣木葉多糖得率最大，得率為1.135%。料液比較小時得率降低的原因可能是，樣品與水分沒有混勻，造成樣品浸提不完全，不利于多糖的溶解，從而造成得率偏低;料液比較大導(dǎo)致得率變低的原因可能是，多糖可與水以任意比互溶，水量越多提取液中多糖的濃度就越低，相同濃度的乙醇就越難將多糖沉淀出來，造成多糖得率降低[18]。因此，液料比選擇1：20為宜。

2.2.2??? 提取溫度對辣木葉多糖得率的影響??? 提取溫度對辣木葉多糖得率的影響如圖3所示。由圖3可知，在75～90℃，辣木葉多糖得率與溫度成正比。90 ℃時辣木葉多糖得率達(dá)到最大值，得率為1.830%。當(dāng)溫度為90 ℃以上時，隨著溫度上升，得率降低。其原因可能是溫度過高容易破壞多糖的結(jié)構(gòu)，降低多糖的活性，不利于辣木葉多糖的溶解，從而導(dǎo)致得率降低[19]。因此，選擇提取溫度90℃左右為宜。

2.2.3??? 提取時間對辣木葉多糖得率的影響??? 提取時間對辣木葉多糖得率的影響如圖4所示。由圖4可知，辣木葉多糖得率隨著提取時間的增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。1～2 h之內(nèi)隨著時間的增力口，多糖得率也隨之增加[20]，在2 h時達(dá)到最大值，得率為1.135%;2～3 h得率反而下降，這是因為較長的加熱時間導(dǎo)致多糖分解、結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，使多糖得率下降[21]。因此，最優(yōu)提取時間以2h為宜。

2.2.4??? 提取次數(shù)對辣木葉多糖得率的影響??? 提取次數(shù)對辣木葉多糖得率的影響如圖5所示。由圖5可知，辣木葉多糖得率隨提取次數(shù)增加呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢。與第1次相比，第2次多糖得率明顯最高，得率為1.774%。但第2次后多糖得率急劇下降[22]，這可能是由于多次長時間加熱使多糖分解，從而導(dǎo)致得率下降;此外，每增加一次提取次數(shù)會使人力、物力等生產(chǎn)成本增加[23]，因此，提取次數(shù)以2次為宜。

2.2.6??? 辣木葉多糖的得率??? 通過乙醇分級醇沉將辣木葉多糖分為3個階段的多糖，分別是MP-1、MP-2、MP-3。這3個辣木葉多糖得率最高的是MP-2，得率為64.70%，MP-1多糖得率最低。

2.2.7??? 辣木葉多糖的抗氧化活性??? 辣木葉多糖的抗氧化活性見圖6。從圖6可看出，陽性對照組（VC）在質(zhì)量濃度為25μg/mL時，對DPPH自由基的清除能力達(dá)到90%以上。與陽性對照組（VC）相比，辣木葉多糖在設(shè)置的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，對DPPH自由基均有一定的清除能力，且隨著多糖濃度的增加，DPPH清除能力逐漸增加[26]。綜合MP-1、MP-2、MP-3的自由基清除能力可知，在辣木葉多糖濃度為25 μg/mL時，MP-1的DPPH自由基清除能力最低;MP-3的DPPH自由基清除能力最高，達(dá)到85.34%。

3??? 結(jié)論

利用熱水浸提法提取多糖具有成本低、安全、不破壞有效成分等優(yōu)點，該工藝合理、成熟，有較高的開發(fā)價值。通過單因素試驗以及正交試驗，可得到對辣木葉多糖得率影響的因素主次排序依次為：提取次數(shù)>料液比>提取時間>提取溫度，確定辣木葉多糖的最佳提取工藝條件為：料液比1：20 g/mL，提取溫度85℃、提取時間2.5 h、提取次數(shù)2次，在此工藝條件下辣木葉多糖得率為2.039%。同時，辣木葉多糖具有體外抗氧化活性，隨著濃度的升高抗氧化能力逐漸增強(qiáng)，綜合3種辣木葉多糖的DPPH自由基清除能力可知，MP-3體外抗氧化活性最佳，MP-1、MP-2也具有一定的抗氧化活性，為辣木葉的特色產(chǎn)品開發(fā)提供了一定的理論依據(jù)。

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