李亞嬌，孫國(guó)琴**，于傳宗，王海燕，龐 杰，郭九峰

（1.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031；2.內(nèi)蒙古大學(xué)物理科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010021）

隨著人們生活水平不斷提高，各年齡段人們追求的生活品質(zhì)不斷提升。由于食用菌味道鮮美、風(fēng)味獨(dú)特，且具有很高的營(yíng)養(yǎng)保健及藥用價(jià)值，成為現(xiàn)代人們青睞的餐桌食品，野生食用菌更是倍受學(xué)者及消費(fèi)者關(guān)注，具有良好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景[1-3]。我國(guó)是野生食用菌資源最豐富的國(guó)家之一，據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界已知的食用菌有2 000多種，我國(guó)已被鑒定的約有近1 000種，其中有100多種被馴化，用于商業(yè)栽培的有60多種[4-5]。然而，還有很多具有極高食（藥）用價(jià)值的食用菌資源仍未被挖掘。近年來(lái)，由于野生菌市場(chǎng)火熱，利益驅(qū)使人們亂采亂挖、過(guò)度采集；加之生態(tài)環(huán)境退化，致使野生食用菌資源量逐年遞減，許多品種瀕臨滅絕，因此，急需對(duì)野生菌資源進(jìn)行馴化保育工作。

將形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)（如DNA分子標(biāo)記技術(shù)）相結(jié)合，由表及里的對(duì)野生菌進(jìn)行深層次的基因挖掘，從本質(zhì)上進(jìn)行鑒定。DNA分子標(biāo)記技術(shù)具有快速、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)[6-7]，能夠?qū)π螒B(tài)差異較小的種間及種內(nèi)菌株進(jìn)行鑒別[8]。常用的食用菌DNA分子標(biāo)記方法主要有隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性（RAPD）[9]、簡(jiǎn)單序列重復(fù)區(qū)間擴(kuò)增多態(tài)性（ISSR）[10]、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性 （AFLP）[11-12]、特征片段擴(kuò)增區(qū)域 （SCAR）[13]、核糖體DNA（rDNA-ITS）[14-15]，其中核糖體 DNA（rDNA-ITS）是最常用的方法。核糖體 DNA（rDNA）中既包含保守的編碼區(qū)18S、5.8S和28S，適合種以下水平的研究[16]；同時(shí)又包含進(jìn)化速率較快的非編碼區(qū)，內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1和2（ITS1和ITS2）以及非轉(zhuǎn)錄區(qū)，承受的進(jìn)化選擇壓力較小，進(jìn)化速度較快，適合屬以下水平的研究[17]。

內(nèi)蒙古自治區(qū)東西地域跨度較大，地勢(shì)復(fù)雜、氣候多樣，因此野生食用菌資源較豐富、差異性大、特異性強(qiáng)。這就需要食用菌科研工作者加大力度進(jìn)行考察、收集、保育，充分挖掘內(nèi)蒙古大草原上的珍稀野生食用菌資源。鄂爾多斯位于內(nèi)蒙古自治區(qū)阿拉善-鄂爾多斯生物多樣性中心的核心區(qū)域，是生物多樣性研究的關(guān)鍵地帶[18]。筆者團(tuán)隊(duì)于2017年8月在對(duì)鄂爾多斯市野生食用菌資源考察時(shí)采集到一株野生食用菌樣品，當(dāng)?shù)匕傩辗Q(chēng)之為“紫蘑菇”，且已有很長(zhǎng)的食用歷史。通過(guò)組織分離及收集孢子的方式獲得純菌絲體，進(jìn)行馴化保育，并采用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類(lèi)及分子生物學(xué)方法對(duì)樣品進(jìn)行系統(tǒng)的分析鑒定。

1 材料與方法

1.1 供試樣品

樣品編號(hào) gf7821，于2017年8月采自?xún)?nèi)蒙自治區(qū)西部鄂爾多斯市。樣品被帶回內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院進(jìn)行孢子收集，并通過(guò)組織分離方式獲得純菌絲體，后進(jìn)行了保藏、馴化。

主要試劑：植物基因DNA提取試劑盒（離心柱型），天根生化科技 (北京)有限公司；PCR引物ITS1/4，上海生工生物工程有限公司。

主要儀器：QS510C高壓滅菌鍋，重慶雅馬拓科技有限公司；SW-CJ-1F超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣科技有限公司；5430R高速離心機(jī)，德國(guó)艾本德公司（eppendorf）；TC-EA48DAPCR儀，杭州博日科技有限公司；DYY-6C電泳儀，北京市六一生物科技有限公司。

1.2 研究方法

1.2.1 樣品采集

采集樣品后對(duì)其生態(tài)環(huán)境及外部形態(tài)進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)觀(guān)察，并詳細(xì)記錄，同時(shí)拍照。將樣品清理干凈，編號(hào)后帶回內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院。

1.2.2 孢子收集

將樣品菌柄用小刀削去泥土，放入超凈工作臺(tái)，用75%的酒精擦拭菇體表面進(jìn)行消毒；再將菇體表面用無(wú)菌水快速?zèng)_洗3次，用滅過(guò)菌的吸水紙盡量吸干菇體表面水分；然后用灼燒過(guò)的鐵絲穿過(guò)菇體，菌褶向下懸掛于滅過(guò)菌的廣口瓶?jī)?nèi)收集擔(dān)孢子，于-70℃冰箱保存[19]。

1.2.3 母種及原種培養(yǎng)基

母種改良PDA培養(yǎng)基制作方法：馬鈴薯200 g·L-1、蔗糖 10 g·L-1、葡萄糖 10 g·L-1、酵母粉 1.5 g·L-1、蛋白胨 1.5 g·L-1、硫酸鎂 0.5 g·L-1、磷酸氫二鉀1 g·L-1、瓊脂10 g·L-1加蒸餾水定容至1 L。于高壓滅菌鍋121℃滅菌25 min后備用。

原種燕麥培養(yǎng)基制作方法：新鮮無(wú)霉變的燕麥粒用自來(lái)水清洗干凈，以料液比1.0∶1.6比例浸泡12 h，于高壓滅菌鍋121℃滅菌60 min后備用。

1.2.4 rDNA-ITS方法分子鑒定

1）DNA提取

子實(shí)體提?。簩⒐┰囎訉?shí)體置于65℃烘干箱內(nèi)8 h烘干，然后置于微量植物樣品粉碎機(jī)內(nèi)粉碎，分裝于離心管內(nèi)，低溫處保藏以備DNA提取。稱(chēng)取適量子實(shí)體粉末，用天根試劑盒提取DNA。

菌絲體DNA提取：刮取適量母種改良PDA培養(yǎng)基上的菌絲，置于液氮中研磨后用試劑盒提取DNA。

2）PCR擴(kuò)增

ITS序列通用引物ITS1/ITS4，堿基序列如下。

ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG；ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC。

PCR擴(kuò)增采用20 μL反應(yīng)體系：Mix 10 μL、引物各 1 μL、DNA 模板 2 μL、dd H2O 6 μL。

PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性40 s，50℃退火1 min，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃繼續(xù)延伸10 min；4℃保存。

電泳條件為：1.2%瓊脂糖凝膠，電壓100 V。

經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，檢測(cè)合格送往英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司測(cè)序。

3）序列比對(duì)、序列的數(shù)據(jù)分析及系統(tǒng)進(jìn)化分析

將測(cè)序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行BLAST比對(duì)，根據(jù)比對(duì)序列結(jié)果及形態(tài)特征，進(jìn)行同源性分析，并用DNAman 8驗(yàn)證，確定相關(guān)信息。從GenBank隨機(jī)下載蘑菇科 （Agaricaceae）傘菌屬 （Agaricus）的種序列用于系統(tǒng)發(fā)育分析，利用MEGA 6.0軟件鄰接法 NJ（Neighbor-joining method，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，以自展法（Bootstrap 1 000次重復(fù)）檢驗(yàn)各分支的置信度。

2 結(jié)果與分析

2.1 生境

樣品采集地位于鄂爾多斯市烏審旗（108°17′36″E～109°40′22″E，37°38′54″N～39°23′50″N）。該地地處毛烏素沙漠腹部，海拔為1 300 m～1 400 m，年平均氣溫6.8℃，全年日照2 800 h～3 000 h，有效積溫2 800℃～3 000℃，年降水量350 mm～400 mm，年蒸發(fā)量2 200 mm～2 800 mm。

2.2 形態(tài)描述

樣品子實(shí)體形態(tài)見(jiàn)圖1。

圖1 子實(shí)體外觀(guān)形態(tài)Fig.1 Appearance of the fruit body

如圖1所示，樣品子實(shí)體小型，為淺褐色，遇傷后變紅逐漸變紫，肉厚，有特殊的蘑菇香味；菌蓋呈不規(guī)則形狀、有少量淺褐色鱗片，菌蓋直徑3 cm ～7 cm，菌柄 （3～8）cm×（3～4）cm，圓柱或圓錐形；菌褶初期淺褐色，后漸變深褐色至黑色；菌柄上無(wú)菌環(huán)。子實(shí)體幼時(shí)主要生長(zhǎng)在土壤里，成熟時(shí)依舊半生或全部在土壤里。

2.3 菌絲體培養(yǎng)及原基形成

通過(guò)組織分離方法，將菌種塊移至改良的PDA平板培養(yǎng)基上，25℃下避光培養(yǎng)。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2、圖3。

圖2 菌絲體發(fā)育成“小蘑菇”Fig.2 Mycelium develops into‘small fruit body’

圖3 菌絲體發(fā)育成“蘑菇圈”Fig.3 The mycelium develops into a‘mushroom circle’

如圖2、圖3所示，一段時(shí)間后發(fā)現(xiàn)菌絲體長(zhǎng)成多個(gè)塊狀的凸起，并不斷長(zhǎng)大，從外觀(guān)上看類(lèi)似于原基，直至長(zhǎng)成一個(gè)“小蘑菇”，有的甚至形成類(lèi)似于“蘑菇圈”的形態(tài)。將“小蘑菇”用解剖刀切開(kāi)，見(jiàn)圖4。

圖4 “小蘑菇”解剖橫面圖Fig.4 Anatomical cross section of‘little mushroom’

如圖4所示，為蘑菇形狀的解剖橫面圖。再將母種轉(zhuǎn)接至燕麥粒原種培養(yǎng)基中，在25℃下避光培養(yǎng)，見(jiàn)圖5。

圖5 燕麥二級(jí)培養(yǎng)基菌種Fig.5 Secondary strain in oat medium

如圖5所示，可得到菌絲潔白、濃密、粗壯的二級(jí)原種。

2.4 系統(tǒng)發(fā)生學(xué)分析

經(jīng)測(cè)定，樣品子實(shí)體的rDNA ITS序列長(zhǎng)度為950 bp。于2020年6月11日將測(cè)序結(jié)果通過(guò)NCBI進(jìn)行BLAST比對(duì)，取其中最大評(píng)分和同源性較高的8個(gè)序列比對(duì)結(jié)果見(jiàn)表1。

如表1所示，樣品gf7821與Agaricus padanus同源性最高，為98.33%～98.20%。將二者再次進(jìn)行比對(duì)驗(yàn)證，在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載A.padanus的ITS序列，用DNAman 8軟件進(jìn)行序列比對(duì)，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 序列比對(duì)部分圖Fig.6 Diagramof sequence alignment

由圖6可知，序列一致度（identity）為68.18%，進(jìn)一步說(shuō)明分子水平上可確定gf7821為蘑菇科一個(gè)新的種。

從GenBank中隨機(jī)下載蘑菇科傘菌屬的種的序列，軟件生成的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，見(jiàn)圖7。

從圖7中可以看出，樣品gf7821與A.padanus聚為一類(lèi)，且在外圍，自展支持率為100%；而樣品gf7821與Agaricus amicosus自展支持率為42%，與其他的序列則均不在同一類(lèi)群上，遺傳距離更遠(yuǎn)。由此分析可能樣品gf7821與A.padanus可能在進(jìn)化史、生活史上存在一定的關(guān)聯(lián)，而與A.padanus及其他種可能有區(qū)域性差異或是生理生化特點(diǎn)上本質(zhì)差異。

圖7 基于ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)Fig.7 Bootstrap tree based on ITS sequences

3 結(jié)論與討論

樣品gf7821采集于氣候干燥、毛烏素沙漠腹部的內(nèi)蒙古西部鄂爾多斯市，獨(dú)特的氣候環(huán)境下生長(zhǎng)的樣品gf7821有其獨(dú)一無(wú)二的特點(diǎn)。樣品gf7821因其獨(dú)特的味道深受當(dāng)?shù)厝讼矏?ài)，但也因此遭到當(dāng)?shù)厝诉^(guò)度采食而瀕臨滅絕，因此，應(yīng)該受到重視，以保護(hù)這一珍貴的資源。

gf7821在母種階段形成獨(dú)特的原基結(jié)構(gòu)“小蘑菇”，由于其獨(dú)特的生長(zhǎng)方式，可以考慮其出菇方式及形式是否也存在特異性，這是接下來(lái)工作需要突破的方向；形成類(lèi)似的“蘑菇圈”是否與草原蘑菇也有相似的生活史及相同的生理生化特點(diǎn)也是值得深思的。通過(guò)形態(tài)學(xué)描述及分子標(biāo)記法最終確定gf7821為蘑菇科的一個(gè)新種，結(jié)論具有可靠性。通過(guò)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，gf7821與A.padanus為同一類(lèi)群可能在進(jìn)化史、生活史上存在一定的關(guān)聯(lián)。A.padanus首次記錄于意大利，在中國(guó)境內(nèi)首次記錄于2012年新疆的艾比湖附近[20]，可參考A.padanus一些相關(guān)報(bào)道對(duì)gf7821進(jìn)行人工馴化及生理生化特點(diǎn)分析，但必須考慮自身特點(diǎn)。

由于蘑菇科傘菌屬真菌不僅味道鮮美，且在食（藥）用方面占有重要地位，因此推斷該種gd7821具有一定的開(kāi)發(fā)價(jià)值，需進(jìn)一步研究和探討，為人工馴化提供可靠依據(jù)。