劉西周

（天津師范大學生命科學學院，天津 300387）

天津七里海位于中國天津市寧河區(qū)，屬于典型濱海地帶沼澤濕地類型，是具有古代中國海岸地貌特征的大型濕地之一。七里海天然濕地自然生態(tài)資源多樣性豐富，但由于環(huán)境變化和人類活動的雙重影響，如今七里海沿岸的濕地正在嚴重萎縮[1-2]。近年來，由于自然因素和無節(jié)制地采摘等人為因素，該域內(nèi)野生葦蘑的產(chǎn)量和品質(zhì)逐年下降，野生葦蘑幾乎絕跡。

為保護葦蘑種質(zhì)資源，從七里海地區(qū)采集到野生葦蘑菌株，經(jīng)初步鑒定其為擬蠟傘科（Hygrophoropsidaceae）擬蠟傘屬 （Hygrophoropsis）。經(jīng)查閱國內(nèi)外相關(guān)資料，目前有關(guān)葦蘑的報道有葦蘑多糖提取工藝研究[3]、抗氧化作用研究[4]、分類學研究[5]、液體培養(yǎng)基優(yōu)化[6-8]、人工馴化等[9]，但尚未發(fā)現(xiàn)其繼代次數(shù)對菌種活性影響的相關(guān)報道。葦蘑作為天津七里海地區(qū)特色的菌物資源，對其進行馴化、栽培研究具有極大的應(yīng)用前景，且生態(tài)效益和經(jīng)濟效益顯著。因此，通過探究葦蘑不同繼代次數(shù)對菌種活性的影響，為保護菌種資源、恢復天津七里海濕地生態(tài)系統(tǒng)物種多樣性提供科學依據(jù)，同時對葦蘑的進一步研究以及實現(xiàn)葦蘑合理、有序地開發(fā)和利用具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株

葦蘑（Hygrophoropsis sp.）菌株，保藏于天津師范大學蕈菌研究所。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑

1）PDA綜合培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、VB110 mg、硫酸鎂1.5 g、磷酸二氫鉀3 g、瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然。

2）培養(yǎng)料配方：稻草52%、麥粒24%、蘆葦腐殖質(zhì)24%[9]。

3）染色劑：吉姆薩染色液。

1.2 試驗方法

1.2.1 葦蘑菌種繼代培養(yǎng)

葦蘑子實體組織分離獲得的菌種標記為第1代，接種到PDA綜合培養(yǎng)基上，于25℃培養(yǎng)。選取葦蘑菌落邊緣生長部位，使用無菌槍頭打孔，接種至PDA綜合培養(yǎng)基上，進行繼代培養(yǎng)。每代接種8個平板，連續(xù)從第1代傳至第10代。

1.2.2 栽培種制作

選取2 cm～4 cm稻草段，浸水12 h進行預濕，然后瀝干水分；麥粒浸泡24 h后預煮至透明無白芯；選擇無雜質(zhì)的蘆葦腐殖質(zhì)，過篩（孔徑3 mm）備用。

按培養(yǎng)料配方進行稱料，將預濕后的稻草、煮好的麥粒、蘆葦腐殖質(zhì)進行混勻拌料，調(diào)整培養(yǎng)料含水量約為56%；然后裝入聚丙烯袋（300 mm×150 mm×0.05 mm），濕重150 g，于121℃滅菌2 h；冷卻后接種，每代接20袋。

1.2.3 葦蘑菌落特征的比較與分析

1）菌落直徑大小

自每代菌種轉(zhuǎn)接至新平板培養(yǎng)開始，每隔1天用卡尺按“十”字交叉法測出固體培養(yǎng)基中菌落直徑，并拍照記錄；繪制各代菌落生長折線圖，比較和分析不同繼代次數(shù)菌落大小的差異與成因。

2）菌絲稀疏程度比較與分析

自每一代菌種轉(zhuǎn)接至新平板培養(yǎng)開始，觀察菌絲稀疏程度以及老化（褐化）出現(xiàn)時間，并拍照記錄。

3）菌種老化（褐化）時間比較與分析

觀察、記錄菌落出現(xiàn)色素沉積（褐化）的時間并拍照，比較和分析不同繼代次數(shù)菌種老化程度與形成原因。

4）菌種退化程度與分析

觀察記錄菌落出現(xiàn)停止生長與退行性生長的時間并拍照。5）不同繼代次數(shù)葦蘑菌種菌絲特征比較與分析觀察、記錄不同繼代次數(shù)葦蘑菌種菌絲特征，分析形成原因。

1.2.4 不同繼代次數(shù)葦蘑栽培種生長情況對比

無菌條件下分別將不同繼代次數(shù)的菌種進行栽培種培養(yǎng)基接種，接種塊為1 cm2，于25℃黑暗條件培養(yǎng)；觀察并記錄不同菌種萌發(fā)與菌絲體長勢，滿袋與否及抗雜菌能力。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落直徑大小比較與分析

第1代～第8代葦蘑菌落生長變化曲線見圖1。

圖1 不同繼代次數(shù)葦蘑菌落生長曲線Fig.1 Growth curve of the Hygrophoropsis sp.colony with different subculture times

如圖1所示，第1代～第7代葦蘑菌種菌落總體生長趨勢在0～19 d基本趨同，從第21天起逐漸分化，菌落直徑持續(xù)增大；前6代在傳代27天后，所有葦蘑菌落生長遲緩；第8代葦蘑較前7代菌落生長速度極其緩慢，到第11天葦蘑菌落生長明顯變慢，幾乎停滯。前3代培養(yǎng)37天后葦蘑菌落不生長，平均菌落大?。ㄖ睆剑┩Ａ粼?.85 cm，由此可見，隨著繼代次數(shù)增加，前6代菌落生長接近正常，至第8代菌落生長速度明顯減慢，培養(yǎng)至第11天基本停止生長，說明連續(xù)傳代至第8代時，在營養(yǎng)與其他條件滿足的前提下，葦蘑菌種出現(xiàn)斷崖式退化，因此在葦蘑批量化栽培過程中需要嚴格控制傳代次數(shù)，以減少不必要的菌種退化。

2.2 菌絲稀疏程度的比較與分析

對比不同繼代次數(shù)葦蘑菌種培養(yǎng)13 d的菌絲生長情況，見圖2。

圖2 不同繼代次數(shù)葦蘑菌種培養(yǎng)13 d的菌落生長情況Fig.2 Colony growth of the Hygrophoropsis sp.cultured for 13 days with different subculture times

如圖2所示，其菌絲疏密程度隨繼代次數(shù)呈逐漸下降趨勢。第1代葦蘑菌絲最密集；第3代葦蘑菌絲密度開始降低；直至第8代菌絲稀疏最明顯，且不再生長，出現(xiàn)斷崖式改變。

不同繼代次數(shù)葦蘑的菌絲體密集程度變化見表1。

表1 不同繼代次數(shù)葦蘑的菌絲體密集程度Tab.1 The density of mycelium of the Hygrophoropsis sp.with different subculture times

如表1所示，隨著繼代次數(shù)增加，菌絲體密集度隨之降低，前3代葦蘑菌絲體較密集，且在培養(yǎng)全過程中變化不大；第4代～第7代菌絲體密集程度降低；從第6代開始，菌絲體密集程度明顯下降，直至第8代最明顯；第8代菌絲體在培養(yǎng)5天后變得稀疏，且相比其他繼代次數(shù)，從菌絲體稀疏度和菌絲體呈現(xiàn)稀疏時間都比其他代數(shù)提前。正常葦蘑菌種一般情況菌絲體疏密度不會有太大變化，菌絲體稀疏程度與生物量相關(guān)，一定程度上反應(yīng)了菌種活性，可見第8代繼代菌種出現(xiàn)活性驟降，退化明顯，且不可恢復。

2.3 菌種老化時間的比較與分析

不同繼代次數(shù)葦蘑菌種老化時間及生長情況，見圖3。

圖3 不同繼代次數(shù)下菌種首次出現(xiàn)菌落老化時間Fig.3 The colony aging time appeared for the first time under different subculture times

如圖3所示，第8代葦蘑菌種與其他7代差異最為明顯，菌種生長速度明顯變慢，且在第6天有些菌落變?yōu)辄S褐色，第9天葦蘑菌落全部變?yōu)楹诤稚?，由于菌絲分泌的褐色素，菌落周圍培養(yǎng)基變?yōu)辄S色，不同繼代次數(shù)葦蘑菌絲體老化程度記錄見表2。

從表2可知，培養(yǎng)9 d～13 d葦蘑菌種老化程度隨繼代次數(shù)逐漸增強。第3代葦蘑菌種老化速度明顯變快，且比第4代～第7代的菌絲褐變程度更加嚴重，第3代葦蘑菌種中后期菌落邊緣菌絲體聚集成球狀；第3代葦蘑菌落后期徹底變?yōu)楹诤稚?，PDA綜合培養(yǎng)基內(nèi)看不到白色菌絲體，葦蘑菌落未長滿培養(yǎng)基，PDA綜合培養(yǎng)基變成深黃色。第4代～第7代葦蘑菌落生長狀況較第3代而言老化速度變慢。每一代菌種培養(yǎng)4 d，菌落中央就開始呈現(xiàn)淺黃色。總體來看，前4代菌種老化均出現(xiàn)在培養(yǎng)25 d～27 d，隨著繼代次數(shù)增加老化程度出現(xiàn)時間越來越早，至第8代培養(yǎng)約9 d即出現(xiàn)大面積褐化現(xiàn)象，菌落不再生長，培養(yǎng)至第8代驟然出現(xiàn)菌種老化。

表2 不同繼代次數(shù)代葦蘑菌種老化程度Tab.2 The aging degree of Hygrophoropsis sp.culture with different subculture times

2.4 不同繼代次數(shù)葦蘑菌種退化程度與分析

以第1代葦蘑為例，不同培養(yǎng)時間的菌落特征見圖4。

圖4 第1代葦蘑不同培養(yǎng)時間菌落特征Fig.4 Colony characteristics of the 1th generation of Hygrophoropsis sp.at different culture time

由圖4可知，第1代葦蘑菌種在PDA綜合培養(yǎng)基上，1 d～5 d菌絲生長狀態(tài)良好，菌落呈現(xiàn)白色，菌絲密集并且呈現(xiàn)絨毛狀；11 d菌落中心凹陷，菌落外周菌絲體呈現(xiàn)絨氈狀，菌絲體呈淺黃色，之后逐漸加深；15 d菌落中部呈深黃色，且于中央出現(xiàn)菌核；19 d菌核變大，菌落中央菌絲體密集度增加；培養(yǎng)29 d，菌落中央呈深棕色且顏色向四周逐漸變淺，中央處菌核變大；培養(yǎng)至后期，由于其分泌的褐色素使菌落中央變?yōu)楹诤稚６?代～第8代葦蘑菌落生長趨勢相同，唯一不同是隨著菌種繼代次數(shù)的增加，菌落整體生長周期明顯縮短；第1代29 d出現(xiàn)褐化；第6代～第8代主要表現(xiàn)為菌落不生長，且菌落褐化時間提前。經(jīng)轉(zhuǎn)板重復驗證，該規(guī)律重復出現(xiàn)，可視為菌種的退化。由此可見，菌落老化是外在表現(xiàn)，一定程度上也反映菌種退化的規(guī)律；菌落從活性較強到菌絲稀疏，甚至不再生長，說明菌種已經(jīng)退化，需要重新分離新菌種；且退化現(xiàn)象不可逆，一旦出現(xiàn)無法修復。

2.5 不同繼代次數(shù)葦蘑菌絲特征對比

不同繼代次數(shù)葦蘑菌絲微觀形態(tài)見圖5，菌絲特征量化指標見表3。

圖5 葦蘑菌絲染色結(jié)果Fig.5 Mycelial staining results of the Hygrophoropsis sp.

表3 不同繼代次數(shù)葦蘑菌絲特征量化指標對比Tab.3 Comparison of quantitative indexes of mycelial characteristics of the Hygrophoropsis sp.with different subculture times

如圖5和表3所示，葦蘑菌絲隨著繼代次數(shù)增加菌絲逐漸變細，其中骨架菌絲數(shù)量減少且變?nèi)?，生殖菌絲數(shù)量多和鎖狀聯(lián)合有所減少，由此可見菌種老化與退化不僅表現(xiàn)在菌落特征上。從微觀形態(tài)觀察其菌絲特征可以明顯看到隨著繼代次數(shù)遞增，骨架菌絲和聯(lián)絡(luò)菌絲的形態(tài)與數(shù)量基本保持不變，生殖菌絲明顯變少，分支變多，菌絲纖細。

2.6 不同繼代次數(shù)葦蘑栽培種生長情況對比

不同繼代次數(shù)葦蘑栽培種的菌絲生長情況見表4。

表4 不同繼代次數(shù)葦蘑栽培種生長情況Tab.4 Growth of the Hygrophoropsis sp.spawn with different subculture times

由表4可知，第1代葦蘑栽培種菌絲萌發(fā)周期約為24 h，之后隨繼代次數(shù)增加萌發(fā)周期逐漸增加；至第8代需72 h萌發(fā)且菌絲基本不吃料，無健壯生長跡象。滿袋時長隨繼代次數(shù)增加呈逐漸增加的趨勢，至第7代和第8代開始，長時間不能滿袋。原基數(shù)量和抗雜菌能力同樣呈現(xiàn)相同趨勢，這可能是由于菌絲較弱形成不了優(yōu)勢菌落，雜菌容易侵染。由此可見菌種老化與退化不僅表現(xiàn)在菌落特征和微觀形態(tài)，從栽培種的生長情況也可以明顯看到；隨著繼代次數(shù)遞增，菌絲萌發(fā)活力逐漸降低，甚至不再生長。葦蘑菌絲體在培養(yǎng)料中定植和生長的情況，更直觀地反應(yīng)了菌絲活性變化規(guī)律以及繼代次數(shù)。由此可知，在實際生產(chǎn)中應(yīng)該重視繼代次數(shù)，以免造成大面積減產(chǎn)或損失。

3 討論

尋找食用菌的最佳繼代次數(shù)有利于食用菌菌種保藏和食用菌規(guī)?；a(chǎn)，通過多次繼代培養(yǎng)的食用菌菌種都會出現(xiàn)退化的現(xiàn)象。不同菌種的老化屬于生理現(xiàn)象，由于菌種的基因型沒有變化，所以并不會遺傳給下一代，但退化現(xiàn)象是可遺傳的。研究表明，繼代培養(yǎng)過程中菌種的繼代次數(shù)越多，其菌落大小、生長速率、菌絲的密度均呈下降趨勢；同時菌種開始逐漸退化，退化菌種的菌絲形態(tài)要比正常菌絲細弱，且生長速度也遠低于正常菌絲[10-11]。相比正常菌種而言，退化菌種的生長優(yōu)勢缺失，抗雜菌能力降低；繼代過程中菌落形態(tài)發(fā)生了明顯變化；同時菌種的遺傳物質(zhì)也發(fā)生了改變[12-13]。蛹蟲草（Cordyceps militaris）繼代培養(yǎng)相關(guān)研究表明，隨繼代次數(shù)的增加，原基形成數(shù)量逐漸變少，形成原基和子實體的時間逐漸延后，生物轉(zhuǎn)化率降低，品質(zhì)下降的同時出現(xiàn)畸形菇的概率上升[14]。通過觀察不同繼代次數(shù)葦蘑菌種的生長速度、菌落和菌絲形態(tài)、栽培種萌發(fā)等情況，發(fā)現(xiàn)繼代次數(shù)對其菌種活性影響較大；繼代培養(yǎng)到第8代時，菌種生長速度變慢，菌絲體密集程度下降，老化程度加深，原基數(shù)量減少，退化現(xiàn)象明顯；因此，葦蘑最佳繼代次數(shù)應(yīng)嚴格控制在8代以內(nèi)，這為葦蘑菌種保藏和批量化生產(chǎn)提供了理論和實踐指導。